Fabricação e Uso de uma Microplaca de 32 Poços com LEDs Embutidos para Controle Dinâmico Optogenético

Resumo

Este protocolo descreve como fabricar, programar e operar uma microplaca de 32 poços com diodo emissor de luz (LED) embutido para estudos optogenéticos (LEMOS 2.0) dentro de um leitor de microplacas, permitindo a estimulação optogenética em alto rendimento e medições quantitativas de expressão gênica em culturas microbianas.

Resumo

O controle optogenético permite a regulação ativada por luz da expressão gênica e fornece uma interface programável entre células vivas e sistemas eletrônicos. No entanto, a prototipagem rotineira de construtos optogenéticos ainda é limitada pela infraestrutura. As plataformas fechadas existentes frequentemente exigem quimostatos, microfluídica, manipulação robótica ou sensores ópticos personalizados, o que pode aumentar os custos, reduzir a acessibilidade ou restringir o desempenho das medições.

Aqui é apresentado o LEMOS 2.0, uma microplaca atualizada com diodos emissores de luz (LEDs) embutidos para estudos optogenéticos, um dispositivo de baixo custo para estimulação optogenética e caracterização de circuitos gênicos dentro de leitores de microplacas padrão. O LEMOS 2.0 aprimora a plataforma original LEMOS ao aumentar a produtividade de 16 para 32 micropoços e reduzir o vazamento de luz entre micropoços adjacentes, permitindo condições escuras como um estado adicional de iluminação. O dispositivo é composto por um suporte impresso em três dimensões (3D), LEDs endereçáveis individualmente posicionados ao lado de cada micropoço, uma bateria recarregável e um microcontrolador embutido para comunicação sem fio baseada em Bluetooth. Micropoços de polidimetilsiloxano (PDMS) biocompatível são moldados diretamente no dispositivo por meio de moldagem por replicaçãoo, permitindo a estimulação de culturas bacterianas através do molde transparente. O dispositivo se encaixa em leitores de placas padrão, permitindo medidas de densidade óptica e fluorescência.

Este protocolo descreve todo o fluxo de trabalho do LEMOS 2.0, incluindo a fabricação do dispositivo, montagem do circuito, programação do Arduino, moldagem de micropoços em PDMS, configuração do leitor de placas, preparo do microrganismo e do cultivo, execução automatizada do experimento, limpeza do dispositivo e análise dos dados de fluorescência e OD₆₀₀. Como demonstração, o protocolo utiliza o sistema optogenético CcaSR, no qual a expressão de sfGFP é ativada pela luz verde e reprimida pela luz vermelha. O LEMOS 2.0 tem como objetivo tornar as perturbações optogenéticas e a caracterização da expressão gênica mais acessíveis aos usuários de laboratório, permitindo ciclos mais rápidos de projetar-construir-testar-aprender, sem necessidade de infraestrutura especializada de biorreator ou microfluídica.

Introdução

A optogenética fornece uma interface programável entre células vivas e sistemas de controle eletrônicos. Ao usar luz para regular a expressão gênica, o comportamento celular pode ser ativado com precisão temporal, reversibilidade e mínima perturbação ao meio de cultura¹. Quando combinada com repórteres fluorescentes ou luminiscentes, os sistemas optogenéticos permitem que estados biológicos sejam medidos eletronicamente e regulados por meio de retroalimentação¹. Essa interface óptica bidirecional permitiu o controle cibernético de processos celulares, incluindo expressão gênica, crescimento celular e composição da população^2,3,4. No entanto, muitos sistemas optogenéticos de malha fechada bem-sucedidos exigem quimistatos especializados⁵, dispositivos microfluídicos^4,6,7 ou amostragem robótica^2,3,8, o que pode limitar a acessibilidade e dificultar ciclos rotineiros de projetar-construir-testar-aprender.

Leitores de microplacas estão entre os instrumentos mais amplamente utilizados para medir o crescimento microbiano e a dinâmica da expressão gênica. Eles fornecem medições confiáveis de densidade óptica e fluorescência em diversas amostras, suportam controle ambiental e já estão integrados aos fluxos de trabalho padrão em biologia sintética⁹. No entanto, os caminhos de iluminação em leitores de placas comerciais padrão são projetados para medição óptica, e não para atuação optogenética programável e específica por poço durante o crescimento do cultivo. Como resultado, experimentos optogenéticos frequentemente exigem dispositivos de iluminação separados^{10,11,12,13,14}, transferência robótica entre plataformas de estimulação e medição^8,15 ou hardware personalizado de leitura^5,16,17. Essas etapas adicionais reduzem a resolução temporal, introduzem variabilidade no manuseio e complicam o controle em malha fechada.

A placa microplaqueta com LED embutido para estudos de optogenética, ou LEMOS, foi previamente desenvolvida para preencher essa lacuna¹⁸. O LEMOS é um dispositivo compatível com leitor de microplacas que contém LEDs individualmente endereçáveis posicionados ao redor de micropoços de cultura. O dispositivo permanece dentro de um leitor de microplacas comercial durante todo o experimento, permitindo que a estimulação óptica e a medição de fluorescência/densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) ocorram na mesma plataforma. Na implementação original, o LEMOS suportava 16 micropoços de cultura e foi utilizado para demonstrar estimulação optogenética em malha aberta e controle de realimentação em malha fechada da expressão gênica em cultura descontínua¹⁸. O dispositivo foi sincronizado com um computador externo para que a iluminação dos LEDs pudesse ser desligada durante as janelas de medição, minimizando a interferência direta nas leituras de fluorescência e densidade óptica.

Este protocolo descreve uma versão atualizada do dispositivo, LEMOS 2.0, e seu uso em experimentos optogenéticos com culturas microbianas. O LEMOS 2.0 foi redesenhado para aumentar o número de micropoços de cultura independentemente endereçáveis de 16 para 32, melhorando o rendimento experimental e permitindo testar mais condições, réplicas ou projetos de controladores em um único ensaio. O design do dispositivo também foi modificado para reduzir a fuga de luz entre micropoços iluminados e micropoços escuros vizinhos, aumentando a confiabilidade dos controles escuros e dos experimentos de estimulação com padrões espaciais. Essas modificações tornam a plataforma mais adequada para caracterização optogenética comparativa, testes de controladores em múltiplas condições e adoção rotineira de protocolos por laboratórios que já utilizam leitores de microplacas.

O LEMOS 2.0 foi projetado para experimentos microbianos de cultivo descontínuo que exigem medições repetidas de OD₆₀₀ e fluorescência com iluminação programável nos estados vermelho, verde, azul ou escuro. O leitor de placas deve suportar medições cinéticas de OD₆₀₀ e fluorescência, controle de temperatura, agitação, definição personalizada do layout da placa para as 32 micropoças do LEMOS e exportação automatizada dos arquivos de medição para uma pasta monitorada pelo script de controle em Python. A implementação atual foi validada utilizando um leitor de microplacas BioTek Synergy H1 com o software BioTek Gen5 v3.14; a implementação com outros softwares de leitores de placas requer modificações adequadas ao formato de exportação, ao analisador sintático de arquivos e aos passos de automação de tela. Como o dispositivo utiliza LEDs com picos de emissão em 620–630 nm, 515–525 nm e 465–475 nm, os usuários devem selecionar atuadores optogenéticos e repórteres fluorescentes cujos espectros de atuação e leitura sejam compatíveis com esses canais^19,20. Novas linhagens hospedeiras, repórteres, sistemas optogenéticos, meios de cultura, temperaturas de crescimento, intervalos de amostragem ou projetos de controladores provavelmente exigirão o recalibração da intensidade dos LEDs, faixa do ciclo de trabalho, correção de branco, normalização da fluorescência e parâmetros do controlador.

O protocolo abrange todo o fluxo de trabalho do LEMOS 2.0: fabricação do dispositivo, montagem do circuito, programação do Arduino, moldagem de micropoços de polidimetilsiloxano (PDMS), configuração do leitor de placas, preparo do microrganismo e do cultivo, execução automatizada do experimento, limpeza do dispositivo e análise de dados de fluorescência e OD₆₀₀. Embora o exemplo de fluxo de trabalho enfatize o controle óptogenético da expressão gênica em bactérias, a mesma estrutura pode ser adaptada a outras linhagens microbianas, repórteres fluorescentes, sistemas atuadores óptogenéticos e algoritmos de controle. Ao combinar iluminação programável com medições padrão em leitores de placas, a plataforma atualizada LEMOS 2.0 oferece uma abordagem acessível para experimentos de perturbação óptogenética e controle com retroalimentação em alto rendimento em cultivos em batelada.

Protocolo

All experimental procedures involving Escherichia coli strain MG1655  were performed in designated Biosafety Level 2 (BSL-2) laboratories at Texas A&M University. Bacterial cultures and manipulations were carried out in certified Class II Biosafety Cabinets in accordance with standard containment guidelines. Procedures were performed under designated containment conditions reviewed and approved by the Texas A&M Institutional Biosafety Committee (IBC) under permit number IBC2023-044.

1. Fabrication of the LEMOS 2.0 Frame and LED Array

NOTE: Begin fabricating LEMOS 2.0 by 3D-printing the LEMOS 2.0 frame and placing the LED strips into the device body. The goal is to generate a mechanically stable frame in which each LED is positioned next to the corresponding microwell. Correct LED placement at this stage is important because misalignment can reduce stimulation uniformity and increase optical crosstalk between microwells.

1. 3D-print the LEMOS 2.0 inner frame and the casting mold for the PDMS microwells using the provided STL files in the GitHub repository (github.com/synbiosystems/LEMOS-2.0). Remove all support material after printing.
   NOTE: It is recommended to use polylactic acid (PLA) filament and a fused deposition modelling (FDM) printer with the following printing parameters: 0.2 mm layer height, 20% infill for the LEMOS 2.0 frame, and 40% infill for the casting mold.
2. Cut the LED strips across the center of the soldering pads into 2 sets of 16 LEDs. Ensure each strip end has three soldering pads available for soldering, as discussed further in Section 2.
3. Fold each LED strip in half, with the LEDs facing outward (Supplementary Figure 1A, Supplementary Video 1).
4. Manually conform the LED strip to the device geometry and insert it between the microwells, with the +5 V soldering pads oriented downward, noting the arrow on the LED strip (Supplementary Figure 1A, Supplementary Video 1). Adjust the strip position iteratively until each LED is correctly seated in its slot before continuing.

2. Assembly and Validation of the Electrical Circuit

NOTE: Assemble the power, charging, microcontroller, switch, and LED connections required for wireless device operation. After assembly, the LEMOS 2.0 device should operate from the onboard battery, recharge through the charging module, and receive LED commands from the peripheral Arduino board. Verify each power connection before connecting the LED strips, as incorrect voltage routing can damage the microcontroller or LEDs.

CAUTION: The protocol requires prior proficiency in soldering, including appropriate safety practices (e.g., use of a smoke absorber, protective eyewear, and burn-prevention methods), soldering iron maintenance, and basic through-hole/wire-soldering techniques. Users without this experience should obtain training before attempting the steps in this section.

1. Gather all electronic components listed in the Table of Materials and inspect for visible physical damage. Review the wiring diagram (Supplementary File 1).
2. Configure the step-up voltage converter to output 5 V, instead of the default 12 V. Following the configuration key on the back of the board, disconnect pads A and B by applying heat from a soldering iron to remove the connection.
3. Solder the Arduino Nano BLE Rev2 (referred to hereafter as BLE Nano) VIN pin to the step-up converter OUT+ pin and the BLE Nano GND pin to the step-up converter OUT- pin (Supplementary Figure 1B).
4. Solder the step-up converter IN– pin to the battery charging module negative (-) pin.
5. Separate the two wires of the 'JST PH 2-Pin Cable – Female Connector, 100 mm' by pulling the battery-connection ends from the white housing. Trim each to ~70 mm to better fit in the device by trimming from the non-battery-connection ends (Supplementary Figure 1C).
6. Modify the switch. First, remove the mounting pins in each corner. Second, trim all pins to 30% of their length. Then, remove completely T1, T3, and B3 (Notation: T = top, B = bottom, numbered left to right from 1 to 4 when looking directly at the pins with the switch on top) (Supplementary Figure 1D).
7. Solder the red JST cable to B2, leaving the battery-connection end exposed for connecting to the battery’s male connector later (Supplementary Figure 1D).
8. Solder a connecting wire between B1 and B4.
9. Solder the battery charging module B+ pin to B1, being careful to leave the connecting wire from the previous step also soldered to B1 (Supplementary Figure 1E).
10. Solder the step-up converter IN+ pin to T4.
11. Solder the battery charging module positive (+) pin to T2.
12. Solder the black JST cable to the battery charging module B– pin. Leave the battery-connection end loose for later connection to the battery’s male connector.
13. Verify connections under normal device operation mode. Connect the Li-ion battery to the circuit via battery connecting wires left loose in soldering steps, with the switch in the center/off position (Supplementary Figure 1E).
14. Flip the switch to the left/on position (the side with only 2 occupied pins).
15. Verify power to the BLE Nano via the onboard power LED (labeled ‘ON’, next to the USB port), which should turn green (Supplementary Figure 1E, Supplementary Video 1).
16. Verify power to the step-up converter via its on-board LED, which should turn blue.
    NOTE: If LED indicators do not illuminate, verify all connections with a multimeter before proceeding.
17. Remove the first LED strip (inserted in step 1.4) and solder wires to both sets of VIN, DIN, and GND pads. Reinsert the LED strip, feeding the wires through the port on the side of the frame (Supplementary Figure 1F, Supplementary Video 1).
18. Repeat with the second LED strip, according to Supplementary Video 1.
19. Solder the first LED strip to the BLE Nano GND pin, BLE Nano D13 pin, and BLE Nano VIN pin.
    NOTE: Soldering to the VIN pin requires soldering two wires to the same Arduino pin. Solder one wire inside the pin hole, and the other to the outside of the pin hole, at the indentation in the Nano board.
20. Solder the two LED strips together.
21. Verify connections with a multimeter in continuity mode by touching the VIN pin on the BLE Nano and the +5 V pad on the last unsoldered LED pad. Repeat for GND.
22. Secure the LED strips in place using a hot glue gun (Supplementary Figure 1F, Supplementary Video 1). Move slowly, gluing only one or two LED pairs at a time, allowing the glue to cool between applications. Use tweezers as needed to hold the LEDs in place.

3. Programming the Central and Peripheral Arduino Boards

NOTE: Program the two Arduino boards used for wireless communication and LED control. The central Arduino (Arduino Nano IOT 33) is connected to the computer during an experiment, and it relays commands from the Python script. The peripheral Arduino (Arduino Nano 33 BLE Rev 2) is stationed in the LEMOS 2.0 device and controls the LED array. Both boards must be loaded with the appropriate sketches before starting an experiment. Visual indicators of successful connection to the other device are available by uncommenting the listed lines in the Arduino scripts: Central – Lines 34–37, Yellow LED flashes; Peripheral – Lines 99–106, Green LED flashes. Re-comment these lines after observing successful connections between devices. Otherwise, flashing LEDs may turn on while the device is inside the plate reader, potentially compromising the measurements.

1. Download the Arduino files from the GitHub repository: LEMOS_Central.ino, LEMOS_Peripheral.ino. Download and install the latest version of the Arduino integrated development environment (IDE) from http://www.arduino.cc/en/software.
2. Install the latest version of the board package from the Boards Manager (Tools > Board > Boards Manager) (Supplementary Figure 2A).
   Central: Arduino SAMD Boards
   Peripheral: Arduino Mbed OS Nano Boards
3. Install the following Arduino libraries in the Library Manager (Tools > Manage Libraries) (Supplementary Figure 2B): 'ArduinoBLE’ for Bluetooth Low Energy communication between both peripheral and central devices, and ‘Adafruit_NeoPixel’ for LED programming.
4. Open the LEMOS_Central.ino Arduino file in the Arduino IDE.
5. Connect the corresponding device to the computer via universal serial bus (USB) data cable.
6. Select the correct COM port for the connected device (Tools > Port). If the COM port is unclear, observe which port appears and disappears when connecting and disconnecting the device.
7. Select the Arduino Nano 33 IoT board from the board menu (Tools > Board).
8. Upload the script to the device.
9. Repeat for the LEMOS_Peripheral.ino file and peripheral device (Arduino Nano 33 BLE Rev 2).

4. Casting PDMS Microwells by Replica Molding

NOTE: Cast optically clear PDMS microwells directly inside the LEMOS 2.0 frame using replica molding²¹. The PDMS microwells hold the bacterial cultures during plate-reader experiments and must have clear, bubble-free bottoms for reliable OD₆₀₀ and fluorescence measurements. Dust, bubbles, or incomplete curing can introduce well-to-well variation and should be avoided during casting. Ensure the fume hood surface is clean before casting, as any dust or debris in the PDMS will compromise its optical transparency and result in inconsistent OD₆₀₀ readings across microwells.

CAUTION: Work in a fume hood when handling uncured PDMS. Avoid skin contact with the curing agent.

1. Sanitize the interior of the LEMOS 2.0 frame where the microwells are cast by spraying 70% ethanol, avoiding direct contact with any electrical components other than the LEDs. Allow the LEMOS 2.0 frame to dry completely before casting PDMS microwells.
   NOTE: Ethanol exposure to the LEDs is safe, but will damage all other electrical components.
2. Spray the casting mold for the PDMS microwells with a release agent, and wait 10 min for the spray to settle on the plastic surface. A second application after an additional 10 min can improve mold release, but it is optional.
   NOTE: The release agent (e.g., Ease Release 200) will make the casting mold hydrophobic, allowing for easy removal of the casting mold from the cured PDMS microwells.
3. Weigh and mix the curing agent and base of 184 silicone elastomer to a 10:1 mass ratio of base to curing agent in a disposable plastic cup.
   NOTE: It is recommended to use 2.5 g of curing agent + 25 g of base for a total of 27.5 g mixture for one LEMOS 2.0 device; scale up proportionally if casting multiple devices simultaneously.
4. Mix vigorously for at least 5 min using a disposable spatula or wooden stick, scraping the sides and bottom of the cup to ensure complete mixing.
   NOTE: Thorough mixing is critical. Undermixed PDMS will not cure uniformly and will yield inconsistent baseline OD₆₀₀ readings across microwells.
5. Place the cup containing the PDMS mixture in a vacuum desiccator. Apply vacuum (at least 65 cmHg /25 inHg) for 45–60 min, until all visible air bubbles have been removed from the mixture. The PDMS will expand as air bubbles rise to the surface and may overflow its cup. Use a container with at least 3× the volume of the mixture.
   NOTE: Residual air bubbles in the cured PDMS will alter the optical transmission of the microwell bottoms, leading to inconsistent baseline OD₆₀₀ measurements.
6. Secure the LEMOS 2.0 frame to the outer shell using binder clips of appropriate sizes on all four sides.
   NOTE: The binder clips minimize the amount of PDMS that seeps into the gap between the outer shell and the LEMOS 2.0 frame. Excess PDMS in this gap can increase the overall device height and prevent the LEMOS 2.0 frame from sitting level within the outer shell. Placing Kapton tape along the bottom perimeter of the LEMOS 2.0 frame, adjacent to the microwells, can further reduce seepage.
7. Pour the degassed PDMS carefully into the LEMOS 2.0 frame. Use a syringe to add PDMS into each microwell in the frame to ensure they are filled with minimal bubbles.
   NOTE: Formation of small bubbles is unavoidable; they will eventually rise to the surface and disappear. Pour the degassed PDMS immediately after degassing to minimize the reintroduction of bubbles during handling.
8. Insert the 3D-printed casting mold into the PDMS-filled frame. Press the mold gently and evenly, ensuring the circular protrusions in the casting mold sit in the holes of the LEMOS 2.0 frame. The mold defines square microwells aligned next to the LEDs. Wipe away excess PDMS that overflows from the edges with a clean lint-free wipe.
9. Allow the PDMS to cure at room temperature (25 °C) on a level surface for a minimum of 30 h. If needed, accelerate curing by placing the device at 37 °C for 4 h, but only once all visible air bubbles have been removed from the PDMS.
   CAUTION: Do not expose the LEMOS device to temperatures above 37 °C, as this may cause the onboard Li-ion battery to overheat and rupture.
10. Remove the casting mold after the PDMS microwells are cured by gripping it at the edges and pulling it up with a steady force. Ensure the PDMS microwells remain in the frame.
11. Inspect each microwell to ensure that the walls are optically clear and the bottom is free of bubbles. The LEMOS 2.0 device with fresh PDMS microwells is now ready for use.

5. Configuring the Microplate Reader and Data Export Workflow

NOTE: Configure the microplate reader to obtain LEMOS 2.0-compatible kinetic measurements and automation of data export. The reader must recognize the custom LEMOS 2.0 microwell layout, acquire OD₆₀₀ and fluorescence measurements at defined intervals, and export data files to the folder monitored by the Python control script. Perform a baseline measurement with sterile medium before biological experiments to confirm that the PDMS microwells and plate-reader settings produce consistent readings. This protocol uses a BioTek Synergy H1 microplate reader operated via BioTek Gen5 software v3.14.

1. Launch Gen5.
2. Go to Plate Types and import LEMOS 2.0.xml from GitHub, or alternatively set up the custom plate layout for LEMOS 2.0 in Gen5 by referring to Supplementary File 2 (Section 1)  and Supplementary File 3.
3. Perform a baseline measurement with the LEMOS 2.0 device (microwells filled with 200 µL of sterile M9CA media, covered with a medical-grade sealing film [e.g., Breathe-Easy film]). Record the OD₆₀₀ and fluorescence baseline values for all 32 microwells and compare these values to those obtained from a standard 96-well microplate. If a large discrepancy is observed, re-cast the PDMS microwells, as bubbles or debris in the cured PDMS are the most likely cause.
   NOTE: Breathe-Easy film is gas-permeable, maintaining aerobic conditions for cell growth, while remaining optically transparent to avoid interference with fluorescence and OD₆₀₀ measurements.
4. Open the experiment protocol closed_loop_protocol.prt from the GitHub repository in Gen5.
   NOTE: A pre-configured experiment file template.xpt is available in the GitHub repository for convenience. However, the settings are described in detail in Supplementary File 2 (Section 2) and Supplementary File 3 to provide a reference for troubleshooting for users with different versions of Gen5.

6. Preparation of Bacterial Cultures for LEMOS 2.0 Experiments

NOTE: Prepare bacterial cultures for a LEMOS 2.0 optogenetic time-course experiment. A cautious approach to culture preparation is important because starting density and pre-experiment light exposure can affect the measured gene-expression dynamics. The demonstration strain is Escherichia coli (E. coli) MG1655 carrying pSR58.6 and pNO286-3²². pSR58.6 contains superfolder green fluorescent protein (sfgfp) under P_cpcG2 and constitutive CcaR, chloramphenicol resistance, and a pColE1 origin. pNO286-3 contains constitutive CcaS, spectinomycin resistance, and a p15A origin. Together, these plasmids reconstitute a green-light-inducible, red-light-repressible gene expression system. pSR58.6 and pNO286-3 were transformed into chemically competent E. coli MG1655 using standard heat-shock transformation²³. Plates were kept in a box to protect cells from ambient light to avoid premature activation of the optogenetic circuit.

1. Inoculate a single colony of the CcaSR optogenetic strain and a fluorescence-negative control strain into separate 14 mL round-bottom culture tubes, each containing 2 mL of M9CA broth supplemented with 50 µg/mL spectinomycin and 25 µg/mL chloramphenicol. Use this media formulation for all subsequent culture steps throughout the experiment.
2. Cover each tube with aluminum foil and incubate overnight (14–16 h) at 37 °C with shaking at 220 rpm.
   NOTE: Foil wrapping maintains dark conditions and prevents unintended activation of the CcaSR system. Alternatively, cultures can be incubated under constant red light by housing the tubes in an LED enclosure wired with the same electrical setup described in section 2, which more closely mimics the repressed state of the system prior to the experiment.
3. Transfer 100 µL of each overnight culture into 2 mL of fresh media in a new foil-wrapped culture tube. Incubate for 4 h at 37 °C with shaking at 220 rpm.
4. Measure the OD₆₀₀ of each sub-culture after 4 h using the microplate reader.
   NOTE: Cultures should have reached an OD₆₀₀ of 0.4–0.6.
5. Dilute each culture to OD₆₀₀ = 0.1 in fresh media, pipette 200 µL into each microwell of the LEMOS 2.0 device, taking care while pipetting to avoid the formation of air bubbles, and seal the device with a medical-grade sealing film.

7. Initiation of a LEMOS 2.0 Optogenetic Time-Course Experiment

NOTE: Start the automated LEMOS 2.0 experiment by coordinating the microplate reader, the central Arduino, and the Python control script. During the run, the computer coordinates plate-reader measurements, data export, Bluetooth communication, and LED actuation. It is critical that the Gen5 window remains visible, as the Python script uses screen-based automation to interact with the plate-reader software. A successful start is indicated by exported data files appearing in the expected folder, terminal output confirming Bluetooth communication, and LED commands updating at each control interval.

1. Slide the switch to the left to power on the LEMOS 2.0 device. The first LED on the LED strip in LEMOS 2.0 will illuminate green.
2. Connect the central Arduino to the computer via USB and select it in the Arduino IDE from the drop-down menu (Tools > Board).
3. Open the Serial Monitor and connect the peripheral Arduino staged in LEMOS 2.0 to the central Arduino.
4. Turn off the indicator LED on the LED strip by entering the letter 'o' into the serial monitor.
5. Open the experiment file LEMOS-start-data.xpt in Gen5 and take a baseline reading of the cultures in the device, ensuring that the OD₆₀₀ and fluorescence values are consistent with expectations. Close the experiment file.
6. Open the protocol file saved in step 5.4 in Gen5 and save it as an experiment by referring to the Supplementary File 2 (Section 3) and Supplementary File 3.
7. Ensure that Python 3.10 or newer is installed on the system, and install the required packages using the provided requirements.txt file.
8. Open control_duty_cyle.py (for duty cycle experiments) or control_pid.py (for PID experiments) in any suitable IDE, such as Visual Studio Code or Spyder.
   NOTE: Ensure the working directory is set to the folder containing all the Python scripts so they can be imported during script execution. The choice of IDE is not critical.
9. In the Main section of the python script, modify the file variable to match the filename chosen for the Gen5 experiment file in step 7.6.
10. Set up the experiment file and Python script side by side (Figure 1).
11. Click Run on the Gen5 experiment, then abort it once the kinetic step begins.
    NOTE: The Python script looks for a Continue button after clicking Run. However, in a fresh experiment file, this button is not displayed until the second reading is taken or the kinetic run is aborted.
12. Run the Python script. Do not minimize or cover the Gen5 window during the run.
    NOTE: The Python script uses screen-based automation and must be able to locate the Gen5 window approximately every 20 min to handle data export after each kinetic cycle. Obscuring or minimizing the window during this time may disrupt the experiment.

8. Device Cleaning, PDMS Removal, and Battery Recharging

NOTE: Clean and reset the LEMOS 2.0 device after the experiment. Remove the bacterial cultures and the used PDMS microwells, sanitize the reusable frame and shell, and recharge the battery for the next run. Avoid exposing the non-LED electronic components to ethanol or excessive mechanical force during cleaning.

1. Gently peel the medical-grade sealing film from the top of the LEMOS 2.0 device and discard.
2. Aspirate and discard all cell suspension fluid from each microwell using a pipette according to biological waste disposal procedures.
3. Separate the outer shell from the LEMOS 2.0 frame by applying a steady, even force. Avoid excessive bending or twisting of the PLA frame, as this may cause cracking or permanent deformation.
4. Peel away the bulk PDMS layer from the exterior of the frame and use tweezers to carefully remove PDMS microwells from the LEMOS 2.0 frame.
5. Sanitize the LEMOS 2.0 frame and outer shell with 70% ethanol, avoiding direct contact with any electrical components other than the LEDs, as described in step 4.1.
6. Recharge the Li-ion battery for the next experiment:
   1. Slide switch to the right/charging position.
   2. Connect USB to charging module.
   3. Confirm charging via the onboard LED, which will flash while charging (Supplementary Figure 1E).

9. Analyzing Fluorescence and Growth Dynamics

NOTE: Process the fluorescence and OD₆₀₀ data generated during the LEMOS 2.0 experiment. The analysis notebook imports the exported plate-reader data, applies blank and negative-control corrections, calculates normalized fluorescence, and generates time-course plots. Before running the notebook, confirm that the microwell assignments and condition labels match the experimental layout.

1. Open either FL_OD_Data_Analysis_Duty_Cycle.ipynb or FL_OD_Data_Analysis_PID.ipynb.
   NOTE: This uses fluorescence (FL) and optical density (OD) data, which are stored in these files, generated during the run: Datafile/fl.csv and Datafile/od.csv. The PID analysis sheet also uses the errors of expression from the set point that are stored in Datafile/errors.csv.
2. Set the conditions variable with condition names and wells.
3. Set neg_wells equal to a bracketed list of negative control microwell names.
4. Set od_blank and fl_blank to averages across blank wells, or to known values if no blank was run.
5. Set colors_4_figures to desired colors (full list of named colors available at https://matplotlib.org/stable/gallery/color/named_colors.html).
6. Set figsize to the desired width and height of resultant figures in inches.
7. Confirm filenames listed under Constants.
8. Run the notebook, figures will be generated as .png files.

10. Troubleshooting

1. During LED wiring, if the LED soldering pads break off, consider the following:
   1. Bend the corner of the LED strip to more easily fit the wires through the wiring port.
   2. If a stiffer (solid) wire was used, switch to a more flexible (stranded) wire.
2. If the switch is turned on and the BLE Nano's power LED does not illuminate, consider the following:
   1. First, confirm whether the battery is charged. Set the switch to charging mode and connect the charging module to power. If charged, the indicator LED should stop flashing and turn solid green after a few minutes. If the battery was drained, allow it to charge fully before retrying.
   2. If the battery is charged and the LED still does not illuminate, use a multimeter to measure the voltage across the BLE Nano's VIN and GND pins.
      1. 0 V: A wiring connection is broken. Inspect each solder joint along the battery > switch > step-up converter > Nano path and re-flow any joint that looks cold or incomplete.
      2. 5 V: Power is reaching the Nano correctly, so the board itself may be damaged. Attempt to power the Nano via cable to confirm this. If the power LED still does not illuminate, solder a new Nano to replace the faulty Nano.
      3. Greater than 5 V: The step-up converter has not been configured to output 5 V. Confirm pads A and B have been disconnected on the step-up converter, as described in the device assembly section.
3. If the Python script fails to run, consider the following:
   1. Confirm whether the Python script is opened from within its full project folder rather than as a standalone file; both control_duty_cycle.py and control_pid.py depend on other local modules and will fail if opened independently.
   2. Confirm that Arduino IDE is closed, since the Arduino can only have one active connection at a time. The operating system grants access to whichever program opens the port first.
   3. Confirm that the Gen5 protocol is set up correctly, especially if using different software. Refer to Supplementary File 2 (Section 2).
   4. Ensure the required packages are installed. Create a virtual environment and install the packages as listed in the requirements.txt file.
4. If the experiment stops unexpectedly, consider the following:
   1. Stops after the first cycle: The Gen5 data export path is likely misconfigured. Confirm the export destination matches the folder the Python script expects to read from the file variable.
   2. Stops after several cycles: PyAutoGUI occasionally fails to recognize on-screen elements, often after a change in screen resolution, display scaling, or window size. Re-capture the reference screenshots used by the script and keep the Gen5 window active and in the foreground throughout the run; the Python IDE window can be minimized.
   3. In the event that Gen5 reports that the chamber temperature is outside the target range, allow the reader to equilibrate before continuing. Do not override the temperature warning, because doing so can trigger an audit report window that must be closed manually and may interrupt automation.
5. If unusually high or inconsistent OD₆₀₀/fluorescence baseline values across microwells are observed, consider the following:
   1. Inspect the PDMS microwells for trapped dust or debris, which scatters light and inflates readings.
   2. Avoid leaving PDMS uncovered and exposed to ambient air for extended periods before casting or use.
6. If cells show no detectable response to light despite running the experiment, consider the following:
   1. Confirm LED "on" commands are being issued by checking both the IDE terminal output and the BLE communication log.
   2. If commands are being sent but no light is visible, check the LED soldering connections with a multimeter.

Resultados

O LEMOS 2.0 é uma plataforma compatível com leitoras de microplacas de 32 poços²⁴ para estimulação optogenética programável e medição quantitativa da expressão gênica (Figura 2A,B). Cada micropoço é associado a um diodo emissor de luz (LED) WS2812B individualmente endereçável, controlado por um Arduino Nano 33 BLE Sense Rev2 por meio da biblioteca Adafruit_NeoPixel. O dispositivo se comunica com um computador externo por Bluetooth, permitindo que comandos de iluminação sejam atualizados durante o experimento. Micropoços frescos de PDMS são moldados no dispositivo antes do uso por meio de moldagem por réplica (Figura 2C,D). Culturas de E. coli cultivadas no LEMOS 2.0 a 30 °C sob iluminação constante dos LEDs apresentaram crescimento reprodutível entre os micropoços, indicando que o dispositivo suporta o cultivo bacteriano e a medição em leitoras de placas ao longo do tempo experimental¹⁸ (Figura 2E). Além disso, as curvas de crescimento foram semelhantes entre as diferentes condições de iluminação, indicando que a exposição aos LEDs não afetou mensuravelmente o crescimento celular nessas condições.

Para demonstrar o controle da expressão gênica por optogenética, adotou-se o sistema CcaSR v3.0²², um sistema de dois componentes ativado pela luz verde e reprimido pela luz vermelha que controla a expressão de sfGFP (Figura 3A). Sob luz verde, CcaS autofosforila-se e transfere o fosfato para o regulador de resposta CcaR, que dimeriza para ativar a expressão de sfGFP dependente do promotor P_cpcG2. Sob luz vermelha, CcaS defosforila-se, reduzindo assim a atividade de P_cpcG2 e reprimindo a expressão de sfGFP. Os plasmídeos CcaSR foram transformados em E. coli MG1655 e utilizados nos experimentos descritos neste protocolo (Figura 3B). Durante o experimento, o leitor de microplacas mediu a DO₆₀₀ e a fluorescência a cada 10 min. Para evitar que a iluminação por LED interferisse nas medições ópticas, programou-se os LEDs para desligarem durante as janelas de medição no início e no final de cada intervalo de 10 min (Figura 3C).

A interferência entre poços foi inicialmente avaliada posicionando poços microplaca escuros vertical ou horizontalmente adjacentes a poços microplaca sob iluminação constante com luz verde (Figura 3D). Os poços escuros adjacentes aos poços com luz verde constante não apresentaram aumento significativo na expressão em relação aos poços escuros sem poços vizinhos iluminados, indicando vazamento mínimo de luz entre os poços. Com base nesses resultados, utilizou-se um valor de modulação por largura de pulso (PWM) de 1 em 255 nos experimentos subsequentes, a fim de fornecer estimulação óptica suficiente enquanto se minimizava a interferência entre poços.

A estimulação em malha aberta foi então utilizada para definir o parâmetro de atuação para o controle optogenético baseado em LEMOS. O parâmetro de atuação foi o ciclo de trabalho da luz verde, definido como a fração de cada janela de iluminação ativa atribuída à luz verde, sendo o tempo restante de iluminação atribuído à luz vermelha. Cada intervalo de controle durou 10 min, com os LEDs ativos por 8 min e desligados nos 2 min restantes para evitar interferência com as medições do leitor de placas. Ciclos de trabalho da luz verde entre 5% e 80% produziram uma expressão graduada de sfGFP, demonstrando que o ciclo de trabalho pode ser usado como uma entrada ajustável para regulação optogenética (Figura 3E). A taxa de expressão aumentou conforme o ciclo de trabalho subiu de 5% para 40%, sem aumento significativo adicional em ciclos de trabalho mais altos (Figura 3F), sugerindo que o sistema se aproxima da saturação sob estímulos prolongados com luz verde.

Por fim, implementou-se um controle de realimentação em malha fechada para testar se o LEMOS 2.0 poderia regular dinamicamente a expressão gênica em direção a um ponto definido²⁵ (Figura 4A). Os componentes do sistema de controle foram atribuídos da seguinte forma: atuador — LEDs, controlador — computador externo executando o script PID e saída medida — fluorescência de sfGFP normalizada por OD₆₀₀. O controlador comparou o valor medido de FL/OD₆₀₀ com o ponto ajustado e atualizou o ciclo de trabalho da luz verde para o próximo intervalo de 10 minutos. Implementou-se o controle proporcional-integral-derivativo (PID), no qual a duração da exposição à luz verde em cada ciclo, t_green, foi calculada como:

Aqui, e(t) é o erro entre o sinal medido de FL/OD₆₀₀ e o ponto de ajuste no tempo t. K é o ganho proporcional, τ_I  é a constante de tempo integral e τ_D é a constante de tempo derivativa. Os parâmetros de controle em malha fechada foram selecionados utilizando o modelo de expressão gênica em diferentes estágios de crescimento (GEAGS), que foi previamente descrito²⁶. Com esses parâmetros, o sinal medido se aproximou e acompanhou o ponto de ajuste-alvo de FL/OD₆₀₀ (Figura 4B).

Os comandos correspondentes do ciclo de trabalho são mostrados na Figura 4C. A altura das barras representa a fração de luz verde fornecida durante cada janela de iluminação de 8 minutos. O comando do ciclo de trabalho mudou em etapas discretas porque o controlador atualizava a entrada uma vez a cada 10 minutos. À medida que a expressão de sfGFP se aproximava do ponto ajustado, a exposição à luz verde diminuía e a exposição à luz vermelha aumentava. Após o sinal medido atingir o ponto ajustado, ainda foi observado um nível baixo de entrada de luz verde. Essa entrada de controle residual provavelmente reflete o termo derivativo respondendo à mudança acentuada na taxa de expressão próxima ao ponto ajustado. Esses resultados mostram que o LEMOS 2.0 pode implementar controle de realimentação PID guiado por modelo na expressão gênica optogenética em cultivo em batelada.

Figura 1: Configuração do software LEMOS 2.0 durante um experimento. Captura de tela de exemplo mostrando o script de controle em Python em execução no VS Code (à esquerda), com comandos para os LEDs aparecendo no terminal à medida que são enviados ao microcontrolador Arduino. O diretório do projeto contendo o script principal e os módulos de funções associados está visível no painel do explorador de arquivos. À direita, o software do leitor de placas mostra um ciclo de medição cinética em andamento; ao final de cada ciclo, o script em Python dispara automaticamente a próxima execução por meio da interface Gen5 e atualiza os comandos do ciclo de trabalho dos LEDs de forma correspondente. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 2: Construção do dispositivo LEMOS e caracterização do crescimento celular. (A) Esquema desmontado do dispositivo LEMOS mostrando micropoços de PDMS, LEDs de estímulo, bateria, interruptor, microcontrolador, módulo de carregamento, estrutura do dispositivo e invólucro externo. (B) Dispositivo montado com micropoços de PDMS preenchidos com água desionizada. (C) Micropoço de PDMS moldado no dispositivo LEMOS. Reproduzido de Namboothiri et al. (2026)¹⁸, licenciado sob CC BY 4.0. (D) Molde impresso em 3D para a fabricação dos micropoços. (E) Curvas de crescimento de E. coli no LEMOS a 30 °C (N = 3 réplicas técnicas para poços iluminados continuamente com luz verde ou vermelha, bem como mantidos no escuro). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 3: Caracterização do sistema optogenético no LEMOS e dinâmica de controle em malha aberta. (A) Mapa do plasmídeo do sistema optogenético de dois componentes CcaSR: luz verde (522 nm) ativa CcaS/CcaR para aumentar a expressão de sfGFP, e luz vermelha (620 nm) reduz a expressão. (B) Protocolo para realização de experimentos optogenéticos com o sistema optogenético CcaSR. (C) Esquema de operação do LEMOS. Durante o curso de tempo de 12 h, o dispositivo permanece no leitor de microplacas. O leitor mede a fluorescência de sfGFP e a DO₆₀₀, em seguida transmite os dados para um computador, que gerencia o controle de tempo e executa programas Arduino. Os programas Arduino comandam o microcontrolador embutido para desativar temporariamente a iluminação por LED durante cada medição. Adaptado de Namboothiri et al. (2026)¹⁸, licenciado sob CC BY 4.0. (D) Efeito da interferência da luz verde em células não estimuladas na condição escura. No layout da placa, caixas verdes indicam micropoços com luz verde (N = 9), caixas cinzas indicam micropoços na condição escura sem interferência luminosa nos micropoços adjacentes (N = 6), caixas roxas indicam micropoços escuros (N = 3) adjacentes verticalmente aos micropoços com luz verde, caixas amarelas indicam micropoços escuros (N = 3) adjacentes horizontalmente aos micropoços com luz verde, e caixas azuis indicam micropoços com luz verde (N = 2) com uma linhagem controle para medir autofluorescência. (E) Respostas em malha aberta no LEMOS a ciclos de trabalho variáveis de luz verde (5–80%, N = 3) como parâmetro atuante. Linhas contínuas indicam médias; faixas sombreadas indicam desvios-padrão. (F) Taxa média de expressão durante a fase exponencial de crescimento com ciclo de trabalho variável. N denota o número de réplicas técnicas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 4: Controle com retroalimentação em malha fechada no LEMOS 2.0. (A) Esquema do funcionamento em malha fechada: o leitor de microplacas atua como sensor que mede FL/OD₆₀₀, o computador atua como controlador e o dispositivo LEMOS 2.0 aciona os LEDs para regular a expressão gênica. O processo é a expressão gênica em células bacterianas vivas. Adaptado de Namboothiri et al. (2026)¹⁸, licenciado sob CC BY 4.0. (B) Controle por derivativo integral proporcional (PID) acompanhando o ponto de ajuste de FL/OD₆₀₀ (SP = 18,5 × 10⁵ u.a.). As referências com luz constante são verde e vermelha (N = 3). As corridas de acompanhamento do ponto de ajuste são representadas por linhas laranjas (N = 3). Linhas contínuas indicam a média de FL/OD₆₀₀; áreas sombreadas indicam os desvios-padrão. A linha tracejada marca o ponto de ajuste. (C) Comandos representativos de ciclo de trabalho gerados pelo controlador PID durante o acompanhamento do ponto de ajuste em malha fechada. A altura das barras indica a fração de luz verde fornecida durante cada intervalo de iluminação. N denota o número de réplicas técnicas. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Plataforma	Formato de cultivo	Leitura	Controle de retroalimentação demonstrado	Formato de crescimento	Limitação abordada pelo LEMOS 2.0
LEMOS 2.0	32 micropoços de PDMS em leitor de placas	Leitor de placas comercial	Rastreamento de ponto de ajuste PID guiado por modelo	Cultivo descontínuo agitado	Este estudo	Este estudo
LEMOS 1.0	16 micropoços de PDMS em leitor de placas	Leitor de placas comercial	Rastreamento de ponto de ajuste PI e PID guiado por modelo	Cultivo descontínuo agitado	Baixa produtividade; compatibilidade limitada com condições escuras	18
Turbidostato automatizado + amostragem robótica	Turbidostato	Citometria de fluxo + sensor de DO	Rastreamento de ponto de ajuste PI, PID e MPC	Cultivo contínuo	Requer amostragem robótica; atraso entre medição e atuação	2, 3
Microscopia Mother-machine	Microfluídica de célula única	Microscopia de células vivas	Feedback em célula única / MPC	Perfusão contínua	Requer microfluídica e microscopia especializadas	4, 6, 7
Chi.Bio	Turbidostato miniaturizado	Sensores internos de DO/FL	Rastreamento de ponto de ajuste PI	Cultivo contínuo	A faixa dinâmica do sensor interno limita o desempenho do feedback de fluorescência	5
Light Tube Array	Tubos de cultivo	DO externo/citometria de fluxo	Apenas malha aberta	Cultivo descontínuo agitado	Amostragem manual; leitura de crescimento on-line limitada	10
LAVA / LITOS / RainbowCap / Diya	Dispositivos de iluminação de múltiplas poças	Leitor de placas comercial	Apenas malha aberta	Cultivo descontínuo	Estimulação e leitura separadas; automação limitada	12, 13, 14, 15
Lustro	Iluminação de placa de 96 poços	Leitor de placas comercial	Apenas malha aberta	Cultivo descontínuo	Requer transferência robótica entre estimulação e leitura	8
RT-OGENE	Estágio compatível com múltiplas poças/microfluídica	DO/FL baseado em câmera	Tentativa de malha fechada; limitado pela leitura	Cultivo descontínuo estático	A leitura baseada em câmera e o cultivo estático limitam o desempenho do controle	16
optoPlateReader	Leitor/estimulador personalizado de 96 poços	Fotodiodos integrados	Rastreamento de ponto de ajuste bang-bang	Cultivo descontínuo agitado	A dependência do repórter/filtro e a menor sensibilidade de fluorescência limitam a flexibilidade da leitura	11,17

Tabela 1: Comparação do LEMOS 2.0 com plataformas optogenéticas existentes^{2,3,4,5,6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,17,18}.

Figura Suplementar 1: Imagens da montagem. (A) Faixa de LED dobrada e faixa moldada no interior do dispositivo. (B) Nano BLE Sense Rev 2 soldado ao conversor elevador, que por sua vez está soldado ao módulo de carregamento da bateria. (C) Versões original e modificada do ‘Cabo JST PH 2 pinos – Conector Fêmea 100 mm’. (D) Interruptor original, interruptor modificado, cabo JST PH vermelho soldado e jumper curto soldado entre dois pinos em lados opostos da fileira inferior. (E) Incorporação do interruptor na montagem do circuito e alimentação do circuito. (F) Vista lateral dos LEDs e das faixas de LED posicionadas com cola quente. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2: Capturas de tela da configuração do Arduino IDE. (A) Captura de tela do Gerenciador de Placas, mostrando uma busca por uma das placas necessárias. (B) Captura de tela do Gerenciador de Bibliotecas, mostrando duas das bibliotecas necessárias. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1. Diagrama de Ligação do LEMOS. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Protocolo para definir um layout personalizado de placa para o LEMOS 2.0 no Gen5. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Capturas de tela das etapas do software descritas no Arquivo Suplementar 2. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 1: Vídeo de montagem com os seguintes passos. Manipulação da tira de LED dentro do quadro, fixação da tira de LED com cola quente, organização dos fios tanto nas tiras de LED quanto entre elas e montagem final com a circuitaria eletrônica. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este protocolo descreve a fabricação e o funcionamento do LEMOS 2.0, uma microplaca de 32 poços com LED embutido para estimulação optogenética e experimentos de controle com retroalimentação dentro de um leitor de microplacas padrão. Experimentos representativos demonstram que o LEMOS 2.0 permite o crescimento microbiano (Figura 2E) sem fototoxicidade significativa observada sob iluminação. Além disso, o LEMOS 2.0 reduz o vazamento de luz para poços adjacentes mantidos no escuro (Figura 3D), melhorando assim a confiabilidade dos controles escuros e dos experimentos de estimulação com padrões espaciais. Além disso, o LEMOS 2.0 permite a atuação optogenética baseada em ciclo de trabalho (Figura 3E) e implementa o controle em malha fechada PID da expressão gênica em cultivos em batelada (Figura 4B).

O fotobranqueamento é uma consideração importante em experimentos optogenéticos porque o mesmo fluxo óptico é utilizado tanto para atuação quanto para leitura da fluorescência²⁷. O LEMOS 2.0 utiliza LEDs RGB comerciais contendo três díodos com picos de emissão em 620–630 nm (vermelho), 515–525 nm (verde) e 465–475 nm (azul)¹⁹. Portanto, a seleção do repórter e a intensidade operacional do LED devem ser escolhidas para minimizar a sobreposição espectral entre os comprimentos de onda de atuação e o espectro de excitação do repórter fluorescente, mantendo ao mesmo tempo uma entrada de luz suficiente para a regulação optogenética. Neste protocolo, foi utilizado o sistema CcaSR, cujas respostas à luz verde e vermelha estão dentro das bandas amplas de ativação e desativação relatadas para este sistema²², e a fluorescência de sfGFP foi medida utilizando excitação em 485 nm. Como os comprimentos de onda de atuação verde e vermelho usados para controle do CcaSR são distintos do comprimento de onda de excitação do sfGFP, e porque a saída do LED foi minimizada a uma intensidade PWM de 1 em 255, ainda assim produzindo regulação optogenética robusta, espera-se que o fotobranqueamento decorrente da atuação com LED seja limitado. Algum fotobranqueamento ainda pode ocorrer durante experimentos de longa duração; no entanto, sob as condições utilizadas aqui, ele não foi suficientemente intenso para obscurecer a indução optogenética medida, a resposta ao ciclo de trabalho ou a dinâmica de rastreamento em malha fechada²⁰.

Várias etapas são fundamentais para um desempenho confiável. Durante a fabricação, cada LED deve ser alinhado com o micropoço correspondente para manter a uniformidade da estimulação e reduzir a interferência óptica. Durante a montagem do circuito, o conversor elevador deve ser configurado para 5 V antes de conectar o microcontrolador e as tiras de LED. A moldagem do PDMS também exige cuidados especiais, pois bolhas, poeira, detritos ou cura incompleta podem alterar a transmissão óptica através das bases dos micropoços e gerar valores de referência inconsistentes de OD₆₀₀ ou fluorescência²⁸. Uma medição de referência com meio estéril deve, portanto, ser realizada antes dos experimentos biológicos. Se forem observadas grandes discrepâncias nas leituras de OD₆₀₀ entre os poços em relação ao restante da placa, os poços afetados devem ser inspecionados quanto aos problemas de fabricação mencionados anteriormente. Dependendo da gravidade, esses micropoços devem ser excluídos da análise ou devem ser refeitos completamente.

A configuração de software é outra causa comum de falhas em experimentos. O fluxo de trabalho atual depende da operação coordenada do método do leitor de placas, exportação de dados pelo Gen5, script de controle em Python e comunicação Bluetooth entre as placas Arduino central e periférica. O caminho de exportação e o formato do arquivo devem corresponder à estrutura esperada pelo script em Python, e a janela do Gen5 deve permanecer visível durante a execução, pois a automação utiliza interações baseadas na tela. Antes de iniciar um experimento, o dispositivo LEMOS deve ser conectado à placa Arduino central, e uma rotina de teste deve ser executada para verificar se todos os LEDs acendem corretamente; quaisquer LEDs sem resposta devem ser identificados e corrigidos antes do carregamento das culturas bacterianas, já que falhas não detectadas resultariam em condições de iluminação não controladas durante o experimento. Usuários que adaptarem o fluxo de trabalho a outro modelo de leitor de placas ou pacote de software devem preservar a mesma lógica de cronometragem, medição, exportação e análise, modificando a camada de automação conforme necessário.

O LEMOS fecha o ciclo ao permitir a atuação automatizada sincronizada com os intervalos de medição¹⁸. Aqui, o dispositivo LEMOS inicial é atualizado ao dobrar a quantidade de poços, aumentando a produtividade. Além disso, a geometria revisada dos micropoços minimiza a fuga de luz entre poços, permitindo que circuitos optogenéticos sejam testados em condições escuras ao lado de condições iluminadas no mesmo experimento. O LEMOS 2.0 atualmente suporta experimentos de cultura em batelada. Como a taxa de crescimento, a disponibilidade de recursos e a dinâmica de expressão gênica mudam durante a cultura em batelada, parâmetros como intensidade do LED, faixa do ciclo de trabalho, intervalo de amostragem e parâmetros do controlador podem precisar ser recalibrados para outras cepas, repórteres, sistemas optogenéticos ou condições de crescimento²⁰. Uma comparação detalhada do LEMOS 2.0 com plataformas previamente desenvolvidas para realização de estudos optogenéticos é fornecida na Tabela 1. Versões futuras poderiam incorporar canais ou reservatórios integrados à placa para troca e diluição controladas de meio, permitindo experimentos mais longos enquanto mantêm condições de crescimento mais consistentes. Outros designs também poderiam suportar comprimentos de onda alternativos de LED ou reduzir a dependência de automação baseada em software com tela.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fio flexível 22 AWG	Amazon	ASIN: B089CQ2N69	Fio econômico para conectar o circuito elétrico. Fio rígido ou flexível é aceitável.
Chave deslizante 8 pinos, 3 posições, 2P3T DP3T, com botão lateral	Amazon	ASIN: B007Q9Y8YC	O interruptor e os pinos devem estar em lados adjacentes, não opostos, como é mais comum.
Arduino Nano 33 BLE Rev 2	Arduino	ABX00071	Microcontrolador – Perfil plano e capacidade BLE adequam-se às necessidades do dispositivo periférico.
Arduino Nano 33 IoT	Arduino	ABX00027	Microcontrolador – Utilizado como dispositivo central.
Leitor de microplacas BioTek Synergy H1	Agilent (BioTek)	—	Ou leitor de placas compatível com modo cinético
Filme selante Breathe-Easy	USA Scientific	9123-6100	Filme selante de grau médico; selo de microplaca permeável a gases
Cloranfenicol (estoque de 25 mg/mL em etanol)	Vários	—	Conc. final: 25 µg/mL
E. coli MG1655
Ease Release 200	Mann Release Technologies		Agente desmoldante
Fita de Kapton	Amazon	ASIN: B07F8TZZ4N
Placas de ágar LB e antibióticos apropriados	Próprio laboratório	—	Presume-se que estes já estejam disponíveis.
Bateria Li-ion 3,7 V, 3000 mAh (11,1 Wh), tamanho 104060	Ufine	UFX0391-03	Deve vir com cabo JST PH 2 pinos macho. Fabricada pela Liter Energy, vendida por diversos varejistas.
Módulo de carga e descarga para bateria Li-ion com USB Tipo-C (5 V 1 A)	Amazon	ASIN: B0CTMJMRKZ	Procure por "Replaces TP4056" no Amazon. Passe os módulos TP4056 padrão. Pare em qualquer anúncio que mostre os módulos menores e pretos com "Replaces TP4056" no título.
Cabo JST PH Li-ion 2 pinos – Conector fêmea 100 mm	Vários	ASIN: B07NWNPB77	Deve ser compatível com o conector JST da bateria’.
Módulo Mini Boost 3,7 V para 5 V/8 V/9 V/12 V, placa elevadora com indicador LED	Amazon (Teyleten Robot)	ASIN: B0B4TB9QNY	[https://a.co/d/03ASKZPq](https://a.co/d/03ASKZPq)
Placa Nunc OmniTray de poço único	Thermo Scientific	242811	Carcaça externa
pNO286-3	Addgene	Plasmídeo #107746	Codifica expressão constitutiva de CcaS
pSR58.6	Addgene	Plasmídeo #63176	Codifica expressão constitutiva de CcaR e sfGFP sob o promotor PcpcG2
Estação de solda e solda	Vários	—	Recomendações: ponta fina, solda com núcleo de fluxo ou de resina.
Espectinomicina (estoque de 50 mg/mL)	Vários	—	Conc. final: 50 µg/mL
Tubos de cultura estéreis (14 mL, fundo redondo)	Vários	—
Elastômero de silicone SYLGARD 184 (base + agente de cura)		SYLGARD 184	Proporção de cura:base de 1:10 em massa
Cabo USB-A para Micro USB	Vários	—	Para conectar as placas Arduino ao PC. Deve ser um cabo de transferência de dados, não apenas um cabo de carregamento.
Cabo de carregamento USB-A para USB-C	Vários	—	Conecta-se ao módulo de carregamento da bateria
Dessecador a vácuo e bomba	Vários	—	Para desgaseificação de PDMS
Fita de LED RGB endereçável WS2812B IC SPI, 100 LED/m, CC5V, IP30, preta	Amazon (BTF-LIGHTING)	ASIN: B088B8G8LD ; Número de peça BTF-LIGHTING: WS2812B1M100LB30	Fita de LED com acesso individual. 100 LED/m. Tensão: 5 V. IP30 refere-se à resistência à água. A cor preta é preferível à branca para refletir menos luz.