Identificação de Biomarcadores de Hipertensão Pulmonar e Compostos Terapêuticos Candidatos via Bioinformática e Aprendizado de Máquina

Chenglang Jiang; Juanchuang Liang; Xianghui Jiang

doi:10.3791/73519

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Artigo de investigação

Identificação de Biomarcadores de Hipertensão Pulmonar e Compostos Terapêuticos Candidatos via Bioinformática e Aprendizado de Máquina

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DOI:

10.3791/73519

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25 de agosto de 2026

Chenglang Jiang¹ , Juanchuang Liang¹ , Xianghui Jiang¹

¹College of Biological and Food Engineering, Huaihua University

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um fluxo de trabalho bioinformático reprodutível que integra conjuntos de dados transcriptômicos públicos, aprendizado de máquina, validação externa, PCR quantitativa com transcrição reversa, triagem da Connectivity Map e acoplamento molecular para identificar biomarcadores da hipertensão pulmonar e compostos terapêuticos candidatos.

Resumo

Este estudo teve como objetivo identificar biomarcadores moleculares associados à hipertensão pulmonar (HP) e compostos de pequenas moléculas candidatos utilizando dados transcriptômicos públicos e recursos independentes de validação. Três conjuntos de dados do Gene Expression Omnibus (GSE22356, GSE33463 e GSE48149) foram integrados após normalização, anotação de sondas e correção do efeito de lote pelo método ComBat. Análise de expressão diferencial, análise de rede de coexpressão gênica ponderada, análise de enriquecimento funcional, análise de rede de interação proteína-proteína e três algoritmos de aprendizado de máquina foram utilizados para identificar genes centrais característicos. O desempenho diagnóstico foi avaliado por meio de curvas de característica operacional do receptor. A validação externa incluiu uma coorte independente de tecido pulmonar (GSE117261), um conjunto de dados de sequenciamento de RNA de célula única de artéria pulmonar (GSE210248) e validação por PCR quantitativo em tempo real em amostras independentes de tecido pulmonar. A reposicionamento de fármacos baseado no Connectivity Map e o encaixe molecular foram utilizados para triagem de compostos candidatos. Setenta e oito genes diferencialmente expressos foram identificados, e CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 e TLR7 foram selecionados como genes centrais característicos. Na coorte independente de tecido pulmonar GSE117261, JUN apresentou o suporte externo mais forte, enquanto a replicação dos outros genes foi variável. A PCR quantitativa em tempo real em 20 amostras biologicamente independentes de hipertensão arterial pulmonar e 20 amostras controle confirmou a superexpressão dos cinco genes. O modelo aparente de qRT-PCR com cinco genes e análises de validação cruzada estratificada repetida cinco vezes (100 repetições) ambos resultaram em uma área sob a curva de 1,000, embora a pequena coorte exija interpretação cautelosa e validação prospectiva independente. A análise de célula única do conjunto GSE210248 apoiou alterações na comunicação entre células imunes e estruturais e a mudança fenotípica de células musculares lisas. O composto BRD-K91900765/VX-745 obteve a classificação mais alta na triagem do Connectivity Map. MAPK14/p38α, seu alvo farmacológico estabelecido, foi incluído como proteína de referência positiva no encaixe molecular, enquanto o encaixe contra as cinco proteínas associadas aos biomarcadores foi tratado de forma exploratória. Esses achados sustentam os cinco genes como biomarcadores candidatos para HP e o VX-745 como uma hipótese computacional de reposicionamento de fármaco que exige validação experimental.

Introdução

A hipertensão pulmonar (HP) é uma síndrome cardiorrespiratória progressiva caracterizada por pressão arterial pulmonar persistentemente elevada, resistência vascular pulmonar aumentada e falência ventricular direita eventual. Os critérios hemodinâmicos atuais definem HP como uma pressão arterial pulmonar média em repouso de >20 mmHg, medida por cateterização do lado direito do coração¹. Entre os diferentes subtipos clínicos, a hipertensão arterial pulmonar (HAP) é uma das formas mais graves e caracteriza-se por remodelação progressiva dos vasos pulmonares. Suas características patológicas incluem disfunção endotelial, proliferação e migração anormais das células musculares lisas arteriais pulmonares, ativação de fibroblastos da túnica adventícia, deposição de matriz extracelular, infiltração de células inflamatórias e estreitamento ou obliteração das artérias pulmonares distais². Essas alterações indicam que a HP/HAP não é apenas um distúrbio de vasoconstrição, mas também uma doença complexa de remodelação vascular impulsionada por mecanismos moleculares, celulares e imuno-inflamatórios coordenados.

As terapias atuais para HAP visam principalmente as vias da prostaciclina, endotelina, óxido nítrico – guanilato ciclase solúvel e fosfodiesterase tipo 5³˒⁴. Embora esses tratamentos melhorem os sintomas, a capacidade de exercício e os parâmetros hemodinâmicos, seus efeitos permanecem predominantemente vasodilatadores e hemodinâmicos. A capacidade de reverter o remodelamento vascular pulmonar estabelecido é limitada, e muitos pacientes continuam a apresentar progressão da doença apesar da terapia combinada. Portanto, a identificação de novos biomarcadores moleculares e candidatos terapêuticos que reflitam o processo de remodelamento representa uma necessidade clínica não atendida importante. Em particular, a ativação imune-inflamatória, a sinalização relacionada ao interferon, as vias dos receptores tipo Toll, o recrutamento imune mediado por quimiocinas e a transição fenotípica das células musculares lisas surgiram como possíveis fatores contribuintes para a progressão da HP/HAP⁵˒⁶.

Conjuntos de dados transcriptômicos de alto rendimento fornecem recursos valiosos para identificar assinaturas moleculares associadas a doenças na HP/HAAP. No entanto, estudos baseados em um único conjunto de dados frequentemente são limitados por tamanhos amostrais pequenos, efeitos de lote, heterogeneidade de plataforma e validação insuficiente. A análise de expressão diferencial pode identificar genes com expressão alterada, mas pode não capturar completamente módulos de coexpressão relacionados à doença ou interações em nível de rede. A análise de rede de coexpressão gênica ponderada (WGCNA) pode identificar módulos de genes associados a características da doença, enquanto a análise de rede de interação proteína-proteína (PPI) pode revelar genes altamente conectados dentro de redes biológicas. Métodos de aprendizado de máquina também podem priorizar genes com valor diagnóstico ou classificatório. Contudo, a dependência de um único algoritmo pode introduzir viés específico ao modelo. Portanto, a integração da análise de expressão diferencial, WGCNA, análise de rede PPI e múltiplos algoritmos de aprendizado de máquina pode melhorar a robustez na descoberta de biomarcadores.

Outro grande desafio nos estudos de biomarcadores transcriptômicos é a interpretação biológica. Os sinais de tecido total podem refletir alterações na expressão gênica dentro de células vasculares residentes, infiltração de células imunes ou proporções alteradas de múltiplas populações celulares. O sequenciamento de RNA de célula única oferece a oportunidade de situar genes candidatos derivados de análises em massa em um contexto celular. Na HP/HAAP, o remodelamento vascular pulmonar envolve células endoteliais, células musculares lisas, fibroblastos, monócitos/macrófagos, linfócitos e outras células imunes ou estruturais. A progressão da doença também está associada à alteração na comunicação entre células e à mudança fenotípica das células musculares lisas. Assim, a combinação de triagem transcriptômica em massa com validação em célula única pode ajudar a determinar se os biomarcadores candidatos estão associados à ativação imune, ao remodelamento estrutural vascular ou a um desequilíbrio na comunicação multicelular.

Além da descoberta de biomarcadores, assinaturas transcriptômicas podem ser utilizadas para reposicionamento computacional de fármacos. O Mapa de Conectividade (CMap) associa perfis de expressão gênica relacionados a doenças com moléculas pequenas que podem reverter ou modular essas assinaturas⁷. Quando combinado com curadoria de compostos e encaixe molecular, essa estratégia pode gerar hipóteses terapêuticas passíveis de teste experimental. Embora as previsões do CMap e o encaixe molecular não possam comprovar a eficácia de um fármaco, eles podem priorizar compostos candidatos para ensaios futuros de ligação ao alvo, experimentos baseados em células e validação em modelos animais.

Foi desenvolvida uma metodologia integrada e reprodutível para identificar biomarcadores de HP/HAAP e compostos terapêuticos candidatos. Três conjuntos de dados transcriptômicos públicos do Gene Expression Omnibus foram integrados após normalização e correção de efeitos de lote. Análise de expressão diferencial, WGCNA, análise de enriquecimento funcional, análise de rede de interação proteína-proteína e três algoritmos de aprendizado de máquina foram utilizados para triar genes robustos com características relevantes. A análise da curva ROC, uma coorte de validação independente de tecido pulmonar, evidências de sequenciamento de RNA de célula única da artéria pulmonar e a validação por PCR quantitativa reversa em amostras independentes foram utilizadas para avaliar ainda mais os genes selecionados. Por fim, a reposicionamento de fármacos baseado em CMap e o encaixe molecular foram aplicados para identificar compostos candidatos. A novidade do estudo reside em sua estrutura de validação em múltiplas camadas, que conecta a descoberta transcriptômica em massa, a priorização por aprendizado de máquina, a validação independente, a confirmação experimental por PCR quantitativa reversa, a interpretação mecanicista em nível de célula única e a triagem computacional de compostos. A hipótese do estudo era que a HP/HAAP é impulsionada por um programa coordenado de inflamação imunológica e remodelação vascular e que genes robustos dentro desse programa podem atuar como biomarcadores candidatos e oferecer oportunidades de reposicionamento de medicamentos.

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Protocolo

Os conjuntos de dados públicos do Gene Expression Omnibus (GEO) analisados neste estudo continham dados transcriptômicos desidentificados de estudos previamente publicados e não exigiram aprovação ética adicional. O Comitê de Ética da Universidade Huaihua aprovou o estudo independente de validação por PCR quantitativa de transcrição reversa (qRT-PCR) em tecido pulmonar humano (número de aprovação: 2024(A05112)). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes ou de seus representantes legalmente autorizados antes da coleta das amostras. Os procedimentos de aprovação e consentimento aplicaram-se a todas as 20 amostras de tecido pulmonar de hipertensão arterial pulmonar (PAH) e 20 amostras de controle incluídas na validação por qRT-PCR. As ferramentas de pesquisa utilizadas neste protocolo estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Coleta e pré-processamento de conjuntos de dados transcriptômicos públicos

Conjuntos de dados de microarranjos relacionados à hipertensão pulmonar (HP) GSE22356, GSE33463 e GSE48149 foram obtidos a partir do banco de dados GEO. Amostras de HP/hipertensão arterial pulmonar (HAP) e controles foram extraídas de acordo com as anotações fenotípicas originais. Matrizes de expressão e arquivos de anotação da plataforma foram baixados usando scripts reprodutíveis em R e o pacote GEOquery.

A anotação das sondas e a associação aos símbolos gênicos foram realizadas de forma consistente entre os conjuntos de dados. Quando múltiplas sondas correspondiam ao mesmo gene, o valor médio de expressão foi calculado. Foi aplicada normalização por quantis, e os genes com baixa expressão ou baixa variância foram removidos. Os conjuntos de dados foram combinados, e os efeitos de lote foram corrigidos utilizando o algoritmo ComBat do pacote sva⁸. A correção foi avaliada por meio de boxplots e análise de componentes principais.

2. Identificação de genes diferencialmente expressos

O pacote limma foi utilizado para comparar os níveis de expressão entre amostras de PH e controles na matriz de expressão corrigida por lote⁹. Um modelo linear foi ajustado e estatísticas Bayesiana empíricas foram aplicadas. Os genes diferencialmente expressos foram definidos utilizando um valor de P ajustado <0,05 e uma mudança absoluta no log2 da razão > 0,585. Os resultados foram visualizados usando gráficos de vulcão e mapas de calor.

3. Construção da rede de coexpressão gênica ponderada

Uma rede de coexpressão gênica ponderada foi construída utilizando o pacote WGCNA¹⁰. A clusterização de amostras foi realizada para detectar valores atípicos. A potência de limiarização suave foi selecionada com base no índice de ajuste à topologia livre de escala. Os módulos gênicos foram identificados utilizando o algoritmo de corte dinâmico de árvores. Os eigengenes dos módulos foram correlacionados com o fenótipo de HP, e o módulo associado à doença com a correlação mais forte foi selecionado. Os genes no módulo principal foram intersectados com os genes diferencialmente expressos para obter os genes de consenso.

4. Análise de enriquecimento funcional

As categorias de processo biológico, componente celular e função molecular da Gene Ontology foram analisadas utilizando o clusterProfiler¹¹. Foi realizada a análise de enriquecimento de vias do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes para identificar vias de sinalização¹². Um valor de P < 0,05 e um valor de q < 0,2 foram utilizados como limiares de enriquecimento, e os termos enriquecidos foram visualizados utilizando gráficos de bolhas¹¹.

5. Construção da rede de interação proteína-proteína e identificação de genes centrais

A lista consenso de genes foi submetida ao banco de dados STRING, com Homo sapiens selecionado como a espécie e um limiar de confiança de interação > 0,4¹³. O arquivo de interação foi importado para o Cytoscape, e o plug-in CytoHubba foi utilizado para classificar os genes pelo grau do nó. Os genes altamente conectados foram definidos como genes centrais.

6. Seleção de genes com características diagnósticas utilizando aprendizado de máquina

Três algoritmos independentes de seleção de características foram aplicados. Primeiro, realizou-se uma regressão logística com operador de redução e seleção por módulo mínimo utilizando o pacote glmnet e validação cruzada com 10 dobras para identificar genes com coeficientes não nulos¹⁴. Segundo, aplicou-se a eliminação recursiva de características com máquinas de vetores de suporte para remover características redundantes e selecionar o subconjunto de características que alcançou a maior precisão na validação cruzada¹⁵. Terceiro, construiu-se um modelo de floresta aleatória, e as características foram classificadas com base na diminuição média da impureza de Gini¹⁶. A intersecção dos conjuntos de genes derivados dos três algoritmos foi utilizada para definir o conjunto final de genes característicos centrais. O pacote pROC foi utilizado para gerar curvas de característica operacional do receptor e calcular os valores da área sob a curva¹⁷.

7. Validação de genes centrais utilizando conjuntos de dados independentes de bulk e de célula única

GSE117261 foi utilizado como uma coorte externa independente de validação de tecido pulmonar, contendo 58 amostras de HAP e 25 amostras de controle de doadores falecidos¹⁸. Este conjunto de dados não foi utilizado na análise de descoberta de expressão diferencial, na construção da rede de coexpressão gênica ponderada ou na seleção de características por aprendizado de máquina. A matriz de expressão foi normalizada e anotada, e a expressão diferencial foi analisada usando o limma v3.68.0. A correção da taxa de falsa descoberta de Benjamini-Hochberg foi aplicada em todo o transcriptoma anotado. Curvas de característica operacional do receptor (ROC) para genes individuais foram calculadas usando o pROC v1.19.0.1, intervalos de confiança de 95% de DeLong e pontos de corte do índice de Youden. Um modelo exploratório de regressão logística com cinco genes foi ajustado dentro do GSE117261, e seu desempenho interno foi adicionalmente avaliado usando validação cruzada aninhada repetida.

O GSE210248 (Tabela 1) foi utilizado como conjunto de dados de validação de artéria pulmonar em nível de célula única, contendo amostras de três pacientes com HAP e três doadores saudáveis¹⁹. Os dados foram processados usando o Seurat v5.5.1 para controle de qualidade, normalização, redução de dimensionalidade, agrupamento e anotação celular²⁰. Foram identificadas as principais populações celulares, incluindo células endoteliais, células musculares lisas, fibroblastos, monócitos/macrófagos e células T/células natural killer. A comunicação célula-célula foi analisada usando o CellChat v2.1.2 e a base de dados de ligantes-receptores CellChatDB.human²¹. Um objeto CellChat foi criado a partir da matriz de expressão normalizada do Seurat e dos metadados de tipo celular. Foram identificados genes superexpressos e interações ligante-receptor; as probabilidades de comunicação foram calculadas; foram removidas interações envolvendo grupos celulares com menos de 10 células; e foram inferidas e agregadas redes de comunicação em nível de vias. Este conjunto de dados foi utilizado apenas para validação mecanicista externa e não para o treinamento do modelo.

Item	Descrição
Conjunto de dados	GSE210248
Tipo de dado	Sequenciamento de RNA de célula única baseado em microgotas da 10x Genomics; perfilagem transcriptômica de alto rendimento
Amostras humanas	Três amostras de artéria pulmonar de PAH e três amostras de artéria pulmonar de doadores saudáveis
Origem do tecido	Tecido de artéria pulmonar ex vivo, refletindo principalmente a ecologia celular da parede vascular pulmonar e o processo de remodelação vascular
Objetivo analítico principal	Localização do tipo celular, mudança fenotípica de células musculares lisas, comunicação entre células imunes e estruturais, e validação da consistência mecanicista de genes candidatos

Tabela 1: Informações básicas do conjunto de dados de validação de célula única GSE210248. A tabela resume o acesso ao conjunto de dados, plataforma de sequenciamento, origem do tecido, composição da amostra e finalidade analítica da análise de validação de artéria pulmonar em célula única.

8. Validação da expressão gênica por qRT-PCR

A validação por qRT-PCR incluiu 20 amostras de tecido pulmonar de pacientes com PH/PAH independentes do ponto de vista biológico e 20 amostras de controle de tecido pulmonar independentes do ponto de vista biológico. O RNA total foi extraído utilizando o Kit de Extração de RNA Total. A concentração e a pureza do RNA foram avaliadas por meio de um espectrofotômetro, e a integridade do RNA foi analisada por eletroforese em gel de agarose. Somente amostras de RNA com valores de A260/280 entre 1,8 e 2,1 e sem degradação visível foram incluídas.

Quantidades iguais de RNA foram transcritas reversamente em DNA complementar utilizando o Kit Solarbio Universal RT-PCR (AMV; número de catálogo RP1200). A PCR quantitativa para CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 e TLR7 foi realizada utilizando o SYBR Green PCR Master Mix em um Sistema de PCR em Tempo Real. Cada amostra biológica foi analisada em três réplicas técnicas, juntamente com controles sem molde e sem transcrição reversa. O valor médio de Ct das três réplicas técnicas foi utilizado para a análise subsequente; as réplicas técnicas não foram tratadas como observações independentes. Foram utilizados primers que abrangem junções exon-exon e produzem amplicons de 80–200 pb (Tabela 2). A especificidade dos primers foi verificada utilizando o NCBI Primer-BLAST e análise da curva de dissociação²².

A β-actina (ACTB) foi utilizada como gene de referência interno para normalizar os níveis de expressão dos genes-alvo. A expressão relativa foi calculada utilizando o método 2^-ΔΔCt²³. Testes Mann-Whitney U bicaudais foram utilizados para comparações entre grupos com base na distribuição dos dados, e foi aplicada a correção da taxa de falsas descobertas de Benjamini-Hochberg entre os cinco genes. Curvas ROC de um único gene foram geradas com intervalos de confiança de 95% de DeLong, e os pontos de corte ótimos foram selecionados utilizando o índice de Youden. O modelo de regressão logística de cinco genes foi inicialmente ajustado e avaliado nas mesmas 40 amostras biológicas; essa estimativa foi, portanto, definida como o desempenho aparente dentro da amostra. Para avaliar o possível superajuste, foram realizadas 100 repetições de validação cruzada estratificada em cinco partes utilizando um modelo de regressão logística com regularização L2, e o desempenho ROC combinado fora das dobras foi calculado.

Gene	Acesso RefSeq	Primer sentido (5′–3′)	Primer antissentido (5′–3′)	Tamanho do produto (pb)	Tm (°C)	Com travessia de éxon
CXCL10	NM_001565.4	GTCAAGCCAT AATTGTTC	ATAGTGCCAG GGTAGAGT	141	46.1	Sim
JUN	NM_002228.4	ACAAGTGGCA GAGTCCCG	CGCCCAAGTT CAACAACC	152	54.5	Sim
IFIH1	NM_022168	GCACAGAGCG GTAGACCCT	GCCCTGAAGC ACGAGATG	182	54.7	Sim
MX1	NM_002462.5	TTAGCCGTGG TGATTTAGC	CAAGGTGGAG CGATTCTG	156	52.3	Sim
TLR7	NM_016562.4	ATTGCCCTCGT TGTTATA	TTCCTGGAGTT TGTTGAT	179	48.1	Sim
ACTB	NM_001101.3	CTCACCATGGAT GATGATATCGC	AGGAATCCTTCT GACCCATGC	194	56.2	Sim

Tabela 2: Sequências de iniciadores utilizadas para PCR quantitativa de transcrição reversa. A tabela lista os genes-alvo, números de acesso RefSeq, sequências dos iniciadores direto e reverso, tamanhos dos produtos, temperaturas de fusão e status de abrangência de éxons dos iniciadores utilizados para qRT-PCR.

9. Triagem de compostos candidatos e acoplamento molecular

As assinaturas de genes centrais reguladas para cima e para baixo foram submetidas ao banco de dados Connectivity Map para identificar moléculas pequenas previstas para reverter o perfil de expressão associado à HP⁷. Os candidatos foram classificados pelo escore Logit e pela probabilidade de predição.

A estrutura tridimensional da BRD-K91900765/VX-745 foi obtida do PubChem sob o CID 3038525²⁴. Informações farmacológicas relacionadas ao composto foram compiladas a partir de bancos de dados públicos de fármacos, e descritores estruturais foram calculados utilizando o DrugBank e o SwissADME²⁵^,²⁶. As estruturas proteicas foram obtidas do Banco de Dados de Estruturas Proteicas RCSB utilizando os seguintes identificadores PDB: CXCL10, 1LV9; JUN, 1JUN; IFIH1, 3B6E; MX1, 5GTM; TLR7, 7CYN; e MAPK14/p38α, 1OUK²⁷. A detecção cega de cavidades e o encaixe molecular foram realizados usando o CB-Dock2 v2.0 com o mecanismo de pontuação AutoDock Vina v1.2.0²⁸^,²⁹. Os arquivos da proteína e do ligante foram enviados ao CB-Dock2, cavidades candidatas foram detectadas automaticamente, e o encaixe foi realizado dentro das caixas específicas para cada cavidade geradas pelo servidor. Para cada proteína, foram registrados o identificador da cavidade, a pontuação Vina, o volume da cavidade, o centro da caixa de encaixe, as dimensões da caixa de encaixe e o arquivo do complexo proteína-ligante. A conformação com a pontuação Vina mais negativa foi selecionada como a conformação prevista de melhor classificação. MAPK14/p38α foi incluída como o alvo farmacológico estabelecido e proteína de referência positiva para o encaixe do VX-745. O encaixe contra CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 e TLR7 foi exploratório e não foi interpretado como evidência de direcionamento farmacológico direto, ligação, inibição ou eficácia.

10. Análise estatística e controle de reprodutibilidade

Todas as análises estatísticas foram realizadas em R, salvo indicação em contrário. Valores de P bicaudais < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. A correção para múltiplos testes foi aplicada às análises de expressão diferencial, enriquecimento, validação externa e qRT-PCR conforme especificado acima. A validação cruzada foi utilizada para avaliar a estabilidade dos modelos de aprendizado de máquina e combinados de qRT-PCR.

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Resultados

Pré-processamento de dados transcriptômicos públicos e identificação de genes diferencialmente expressos

A integração e a correção por ComBat dos conjuntos de dados GSE22356, GSE33463 e GSE48149 reduziram as diferenças sistemáticas entre eles. Os diagramas de caixa mostraram que as distribuições de expressão das amostras tornaram-se mais consistentes após a correção. A análise de componentes principais indicou que as amostras se agrupavam principalmente de acordo com a origem ...

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Discussão

Foi desenvolvida uma metodologia integrada e reprodutível para identificar biomarcadores moleculares associados à HP/HA e compostos terapêuticos candidatos, combinando transcriptômica pública, análise de rede de coexpressão gênica ponderada, enriquecimento funcional, análise de rede de interação proteína-proteína, três algoritmos de aprendizado de máquina, validação externa, interpretação transcriptômica de célula única, confirmação por PCR quantitativa com transcriptase reversa, triagem do Mapa de Conectividade e acopla...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesses.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo Projeto de Construção da Província Inovadora de Hunan (nº 2022JJ30465).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2× SYBR Green PCR Mastermix	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	Catalog no. SR1110	Amplificação quantitativa em tempo real por PCR com corante e detecção de fluorescência
AI21.msvmRFE.R e e1071	Script R personalizado com o pacote CRAN e1071	AI21.msvmRFE.R; e1071 v1.7-17	Eliminação recursiva de características por máquina de vetores de suporte
Agarose	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	Catalog no. A8201; CAS 9012-36-6	Avaliação da integridade do RNA total por eletroforese em gel de agarose
Aparelho de eletroforese em gel de agarose	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	Modelo DYCZ-24DN	Avaliação eletroforética da integridade do RNA
Motor de pontuação AutoDock Vina	Center for Computational Structural Biology, Scripps Research	v1.2.0; RRID: SCR_011958	Pontuação de conformação proteína-ligante no fluxo de trabalho CB-Dock2
CB-Dock2	Laboratório Cao, servidor web CB-Dock2	v2.0; acesso em julho de 2026	Detecção cega de cavidades e acoplamento molecular de VX-745 com as estruturas proteicas selecionadas
CellChat	Pacote R CellChat	v2.1.2	Inferência e visualização da comunicação célula-célula a partir da matriz de expressão de célula única
CellChatDB.human	Distribuído com o pacote R CellChat	CellChatDB.human; subconjunto de sinalização secretada; limiar mínimo de células = 10	Banco de dados de interações ligante-receptor humano para CellChat
clusterProfiler	Pacote R Bioconductor	v4.20.0; versão Bioconductor 3.23	Análises de enriquecimento de Ontologia Genética e do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
Connectivity Map (CMap/CLUE)	Broad Institute	Recurso L1000/CLUE; RRID: SCR_016204; acesso em julho de 2026	Análise computacional de reposicionamento de fármacos
Primeres oligonucleotídicos personalizados	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	Sintetizados sob encomenda; sequências dos primeres fornecidas na Tabela 2	Amplificação de ACTB, CXCL10, JUN, IFIH1, MX1 e TLR7
cytoHubba	Loja de aplicativos Cytoscape	v0.1	Classificação de genes centrais com base no grau na rede de interação proteína-proteína
Cytoscape	Consortium Cytoscape	v3.10.4; RRID: SCR_003032	Visualização e análise da rede de interação proteína-proteína
DrugBank	Banco de conhecimento DrugBank	v6.0; RRID: SCR_002700	Curação de identidade de compostos e informações farmacológicas
Sistema de documentação de géis	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.	Modelo WO-9413B	Visualização e registro dos resultados de integridade do RNA em gel de agarose
Gene Expression Omnibus (GEO)	Centro Nacional de Informação Biotecnológica	GSE22356, GSE33463, GSE48149, GSE117261 e GSE210248; RRID: SCR_005012	Recuperação de conjuntos de dados transcritômicos em massa e de célula única
GEOquery	Pacote R Bioconductor	v2.80.0; versão Bioconductor 3.23	Download e importação programática de dados de expressão e fenótipo do GEO
glmnet	Pacote R CRAN	v5.0	Regressão logística com operador de contração e seleção absoluta e modelagem logística regularizada
limma	Pacote R Bioconductor	v3.68.0; versão Bioconductor 3.23; RRID: SCR_010943	Análise de expressão diferencial e estatísticas bayesianas empíricas
Espectrofotômetro NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop ND-1000; software v3.8	Medição da concentração de RNA e das razões de pureza A260/280 e A260/230
NCBI Primer-BLAST	Centro Nacional de Informação Biotecnológica	Ferramenta web; RRID: SCR_003095; acesso em julho de 2026	Verificação da especificidade dos primeres
pROC	Pacote R CRAN	v1.19.0.1; RRID: SCR_024286	Análise de característica operacional do receptor, intervalos de confiança de DeLong e pontos de corte do índice de Youden
Banco de Dados de Proteínas (PDB)	RCSB Protein Data Bank	CXCL10: 1LV9; JUN: 1JUN; IFIH1: 3B6E; MX1: 5GTM; TLR7: 7CYN; MAPK14/p38α: 1OUK; RRID: SCR_012820	Recuperação de estruturas proteicas determinadas experimentalmente para acoplamento molecular
PubChem	Centro Nacional de Informação Biotecnológica	PubChem CID 3038525; RRID: SCR_004284	Recuperação da estrutura tridimensional e identificadores químicos do BRD-K91900765/VX-745
R	R Foundation for Statistical Computing	v4.6.1; RRID: SCR_001905	Computação estatística, processamento de dados, aprendizado de máquina e visualização
randomForest	Pacote R CRAN	v4.7-1.2	Seleção de características por floresta aleatória e classificação de importância de variáveis
Sistema de PCR em tempo real	Stratagene, agora Agilent Technologies	Sistema Mx3000P de PCR em Tempo Real	Amplificação qRT-PCR, aquisição de fluorescência, análise de curva de dissociação e exportação de Ct
Seurat	Pacote R CRAN; Laboratório Satija	v5.5.1; RRID: SCR_016341	Controle de qualidade, normalização, redução de dimensionalidade, agrupamento e anotação em sequenciamento de RNA de célula única
STRING	Consortium STRING	v12.0; RRID: SCR_005223	Construção da rede de interação proteína-proteína
sva (ComBat)	Pacote R Bioconductor	v3.60.0; versão Bioconductor 3.23	Correção de efeitos de lote entre conjuntos de dados
SwissADME	Instituto Suíço de Bioinformática	Servidor web; acesso em julho de 2026	Pré-avaliação de semelhança a fármacos, propriedades físico-químicas e ADME
Kit de Extração de RNA Total	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	Catalog no. R1200	Extração e purificação de RNA total de amostras de tecido pulmonar
Kit RT-PCR Universal (AMV)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	Catalog no. RP1200	Transcrição reversa de RNA total em DNA complementar
WGCNA	Pacote R CRAN	v1.74	Construção de rede de coexpressão gênica ponderada e análise de módulo-traço

Referências

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