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Um Fluxo de Trabalho Rápido para Modelar Déficits de Memória de Reconhecimento Induzidos por Privação de Sono em Camundongos Utilizando Reconhecimento de Objeto Novo e Biomarcadores Hipocampais

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DOI:

10.3791/73557

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8 de setembro de 2026

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1Department of Laboratory Medicine, Nanjing Drum Tower Hospital, Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, 2Department of Neurology, Hefei Eighth People's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine, Bengbu First People's Hospital, 4Department of Pathogen Biology, School of Basic Medicine, Tongji Medical College and State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Severe Zoonotic Infectious Diseases, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um fluxo de trabalho rápido e reprodutível para modelar déficits na memória de reconhecimento induzidos pela privação de sono em camundongos, combinando a privação de sono com manipulação suave, testes de reconhecimento de objeto novo e análise de biomarcadores hipocampais nos mesmos animais ao longo de um protocolo de 10 dias, com registro estruturado de intervenções e critérios pré-definidos de controle de qualidade.

Resumo

A falta de sono contribui para o declínio cognitivo e pode acelerar processos neurodegenerativos. Este artigo apresenta um fluxo de trabalho rápido e reprodutível para modelar déficits na memória de reconhecimento induzidos pela privação de sono em camundongos, associando resultados comportamentais a alterações moleculares no hipocampo. O protocolo utiliza um paradigma de privação de sono por manipulação suave durante 5 h, aplicado imediatamente após uma sessão padronizada de familiarização de 10 min com o reconhecimento de objeto novo (RON). A memória de reconhecimento é avaliada por meio de um teste de RON de 5 min após um intervalo de retenção rigorosamente definido de 5 h, seguido pela coleta imediata do hipocampo dos mesmos animais para quantificação de citocinas pró-inflamatórias, incluindo interleucina-1 beta (IL-1β), interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), e marcadores de estresse oxidativo, incluindo superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e malondialdeído (MDA). O principal avanço metodológico não reside nas técnicas comportamentais ou bioquímicas individuais, que já são bem estabelecidas, mas na sua padronização operacional como um único fluxo de trabalho integrado. O protocolo exige um registro estruturado e quantificável das intervenções de manipulação suave, vincula o treinamento e a privação a um ponto fixo no tempo circadiano, preserva as associações individuais entre os registros de RON e as amostras de tecido, e pré-especifica critérios de controle de qualidade e análise. O procedimento foi projetado para minimizar a restrição física e o exercício forçado, pode ser concluído em um curto período experimental e é proposto como um fluxo de trabalho de referência que laboratórios individuais podem utilizar para comparar sua própria implementação da privação de sono por manipulação suave, aguardando replicação independente.

Introdução

O sono é um processo fisiológico fundamental, essencial para a função cerebral, aprendizado e consolidação da memória1. A privação insuficiente de sono está associada a disfunção cognitiva, transtornos do humor e à progressão de doenças neurodegenerativas2. A privação experimental de sono (PE) em roedores é amplamente utilizada para investigar as consequências neurobiológicas da perda aguda de sono. O hipocampo, uma região cerebral central para a memória declarativa e espacial, é particularmente vulnerável à privação de sono3.

Vários procedimentos estão disponíveis para induzir perda de sono em roedores. O método modificado da múltipla plataforma pode reduzir efetivamente o sono REM, mas pode introduzir estresse considerável e exaustão física4. Em contraste, o manuseio suave (GH) mantém a vigília por meio de estímulos sensoriais leves, como bater na gaiola, perturbar a cama de material, ou apresentar material novo para ninho quando surgem sinais de sono. Um breve período de GH aplicado imediatamente após a aprendizagem pode interferir na consolidação da memória dependente do hipocampo, evitando muitas das confusões associadas aos paradigmas de privação prolongada5. Como as intervenções neste protocolo são acionadas por postura e sinais comportamentais de vigília, e não por detecção confirmada de REM por EEG, o GH conforme implementado aqui constitui um método estabelecido de privação total de sono, e não uma técnica específica para REM, tendo sido usado nesta forma por várias décadas6.

O teste de reconhecimento de objeto novo (NOR) é um ensaio amplamente utilizado para avaliar a memória de reconhecimento. Ele se baseia na tendência natural dos roedores de explorar um objeto novo mais do que um objeto familiar, sem exigir recompensa, punição ou treinamento extensivo7,8. Demonstrou-se que a privação aguda de sono prejudica a discriminação de objetos novos, fornecendo assim uma leitura comportamental eficiente da consolidação da memória comprometida9. Em nível molecular, a perda de sono pode provocar neuroinflamação e estresse oxidativo no hipocampo, incluindo níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias e produtos da peroxidação lipídica, juntamente com redução da capacidade antioxidante10,11.

O desafio na aplicação deste modelo não reside na disponibilidade de seus elementos individuais, mas na falta de consistência operacional entre os estudos. O manuseio gentil é frequentemente relatado sem um registro estruturado da intensidade da intervenção; os pontos finais comportamentais e moleculares são comumente coletados em coortes separadas; e os critérios de controle de qualidade para o comportamento exploratório e o planejamento do tamanho da amostra nem sempre são explícitos. O objetivo geral do presente artigo é fornecer um fluxo de trabalho padronizado para modelar déficits na memória de reconhecimento induzidos pela privação de sono, ao mesmo tempo em que vincula os resultados comportamentais a medidas moleculares do hipocampo nos mesmos animais. O método aborda essas lacunas de reprodutibilidade combinando uma janela de 5 h de manuseio gentil pós-treinamento, um registro de intensidade da intervenção, coleta comportamental e de tecidos na mesma coorte e critérios analíticos pré-definidos em um único fluxo de trabalho de 10 dias (Figura 1). A falta de padronização na implementação do manuseio gentil já foi observada anteriormente na literatura metodológica de pesquisa do sono6.

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Figura 1. Representação esquemática do fluxo experimental. O protocolo abrange 10 dias, incluindo manipulação e habituação, seguidos por um dia crítico de testes que integra uma fase de familiarização de 10 min no NOR, 5 h de privação de sono GH, um teste de NOR de 5 min e a coleta imediata de tecido hipocampal dos mesmos animais para análise de biomarcadores. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Bem-Estar e Ética Animal de AILIMO (Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.) mediante solicitação do Hospital Nanjing Drum Tower (Investigador Principal: Yuan Liu), Número de Aprovação AP CODE: ALM202605070, aprovado em 7 de maio de 2026 (válido por 4 anos), de acordo com as regulamentações institucionais e nacionais aplicáveis. Utilize camundongos machos adultos C57BL/6J (8–12 semanas de idade) para o protocolo descrito abaixo.

1. Preparação e Habituação dos Animais

  1. Mantenha camundongos em condições laboratoriais padrão a 22°C ± 1°C e umidade de 50%–60%, com ciclo de 12 h de luz/12 h de escuro (iluminação ligada às 07:00, definida como ZT0). Forneça acesso ad libitum a ração padrão para roedores e água.
  2. Manuseie cada camundongo por 3–5 min diariamente durante pelo menos 7 dias consecutivos antes do teste.
    NOTA: Este procedimento minimiza o estresse induzido pelo manuseio, o qual poderia interferir no comportamento exploratório.
  3. Prepare uma arena opaca quadrada para o NOR com dimensões de 40 cm × 40 cm × 40 cm e paredes não reflexivas. Utilize uma cor para a arena que contraste com a cor da pelagem dos animais.
  4. Selecione objetos para o NOR que sejam suficientemente pesados para evitar deslocamento e que sejam feitos de material não poroso. Use objetos que sejam distinguíveis em forma e textura, mas que permaneçam comparáveis em tamanho geral.
    NOTA: Figura 2 mostra a configuração de treinamento e teste.
  5. Nos Dias 8 e 9, transfira os camundongos para a sala de testes 1 h antes da habituação. Coloque cada camundongo na arena vazia por 10 min e, em seguida, devolva-o à sua gaiola de origem.
  6. Limpe a arena e os objetos com etanol a 70% entre os animais. Deixe o etanol secar ao ar por aproximadamente 3–5 min sob ventilação laboratorial normal antes de introduzir o próximo animal.
    CAUTELA: O etanol é altamente inflamável. Garanta ventilação adequada e mantenha-o afastado de fontes de ignição.

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Figura 2. Esquema do aparato de reconhecimento de objeto novo e do delineamento experimental. Durante a familiarização, posicione dois objetos idênticos (A e A′) em cantos opostos da arena. Durante a fase de teste, após o intervalo de retenção de 5 h, substitua um dos objetos familiares por um objeto novo (B). Equilibre a posição do objeto novo entre os lados esquerdo e direito entre os animais, de modo que aproximadamente metade dos animais em cada grupo receba o objeto novo em cada posição, a fim de minimizar o viés espacial. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

2. Treinamento em NOR (Familiarização)

  1. No dia 10, inicie o treinamento NOR em ZT1 (08:00 segundo o cronograma de luz indicado). Mantenha esse horário de início entre os grupos para minimizar variações circadianas.
  2. Transfira os camundongos para a sala de teste 1 h antes do início da sessão de treinamento. Coloque dois objetos idênticos (A e A′) em cantos opostos da arena, aproximadamente a 10 cm das paredes.
  3. Fixe os objetos ao piso quando necessário.
  4. Coloque o camundongo no centro da arena, voltado para longe dos objetos. Permita que o camundongo explore livremente por 10 min.
  5. Registre o comportamento utilizando um sistema de rastreamento de vídeo superior. Defina exploração ativa como direcionar o nariz em direção a um objeto a uma distância de ≤2 cm, farejar o objeto ou tocá-lo com o nariz.
    NOTA: Não considere como exploração do objeto o ato de sentar sobre ele ou escalá-lo sem farejamento ativo.
  6. Registre e analise o comportamento NOR utilizando o EthoVision XT versão 17.5 com uma câmera Basler acA1300-60gm posicionada acima. Configure o software de rastreamento com uma zona de detecção do ponto do nariz de ≤2 cm de cada objeto para pontuar a exploração ativa, conforme os critérios definidos na etapa 2.5.
  7. No final da sessão de familiarização de 10 min, remova imediatamente o camundongo da arena.
  8. Limpe cuidadosamente a arena e os objetos com etanol 70% antes de introduzir o próximo animal.

3. Deprivacão do Sono por Manipulação Suave

  1. Antes da sessão de treinamento do Dia 10, atribua a cada animal um código de identificação único. Mantenha o código de identificação durante todo o registro comportamental e a coleta de tecidos.
  2. Atribua os animais aos grupos SD e NSD em uma proporção de 1:1 utilizando números aleatórios gerados por computador com a função RAND do Excel.
  3. Imediatamente após o treinamento NOR, devolva os camundongos NSD às suas gaiolas de origem e mantenha-os sem perturbação por 5 h. Mantenha os animais SD e NSD em condições ambientais equivalentes e dentro da mesma janela de tempo circadiano.
  4. Imediatamente após o treinamento NOR, inicie a privação de sono GH para os camundongos SD. Mantenha a vigília por 5 horas consecutivas na gaiola de origem.
  5. Monitore os animais continuamente. Intervenha quando um camundongo adotar posturas relacionadas ao sono, incluindo encolhimento, fechamento dos olhos ou imobilidade prolongada.
  6. Aplicar estimulação progressivamente, começando com batidas suaves na gaiola. Se necessário, perturbe levemente a cama, introduza um objeto novo e limpo, como um tubo de papel, ou toque suavemente o animal com uma escova macia.
  7. Evite contenção física, locomoção forçada e estimulação aversiva ou dolorosa.
  8. Preencha o registro de intervenções na Tabela 1 para cada gaiola ao longo dos 5 h do período GH. Registre o número aproximado de intervenções por hora, o tipo predominante de intervenção e quaisquer desvios do protocolo ou preocupações com o bem-estar.
  9. Utilize o mesmo modelo de registro de intervenções em todas as coortes.
    CAUTION: Não utilize contenção física, exercício forçado ou estímulos dolorosos, pois estes podem influenciar independentemente a memória, o estresse e os resultados inflamatórios.
Identificação da gaiola/coorteH1H2H3H4H5Tipo(s) principal(is) de intervençãoDesvio ou observação de bem-estar
ID do registroContagem do registro H1Contagem do registro H2Contagem do registro H3Contagem do registro H4Contagem do registro H5Tap / cama / objeto novo / escova maciaRegistrar se presente

Tabela 1: Modelo de registro da intervenção de manipulação suave. Registre o ID da gaiola ou coorte, o número de intervenções de manipulação suave durante cada hora do período de privação de sono de 5 h (H1–H5), o(s) tipo(s) predominante(s) de intervenção e quaisquer desvios do protocolo ou observações de bem-estar.

4. Fase do Teste NOR

  1. Exatamente 5 h após a conclusão do treinamento NOR, inicie a fase de teste NOR para manter um intervalo de retenção fixo de 5 h.
  2. Coloque um objeto familiar (A) e um objeto novo (B) na arena.
  3. Equilibre a posição do objeto novo entre os animais alternando sua colocação entre os lados esquerdo e direito, de modo que aproximadamente metade dos animais em cada grupo receba o objeto novo à esquerda e metade à direita.
  4. Coloque o camundongo no centro da arena. Permita que ele explore livremente por 5 min.
  5. Grave a sessão utilizando o mesmo sistema de rastreamento de vídeo superior usado na familiarização. Aplique a definição de exploração especificada na etapa 2.5.
  6. Limpe a arena e os objetos com etanol 70% entre os animais.

5. Coleta de Tecido e Dissecação do Hipocampo no Mesmo Grupo

  1. Imediatamente após o teste NOR, identifique o mesmo animal submetido ao teste comportamental para a coleta de tecido.
  2. Sacrifique o animal por decapitação sem anestesia, conforme o protocolo animal aprovado, para evitar possíveis efeitos confundidores de agentes anestésicos sobre biomarcadores inflamatórios e dependentes de fosforilação. Colete o tecido cerebral imediatamente após a eutanásia.
  3. Mantenha o ID único de registro comportamental do animal em todos os tubos de amostra e registros para garantir que cada amostra molecular permaneça diretamente vinculada ao resultado NOR desse animal.
  4. Extraia rapidamente o cérebro e coloque-o sobre uma superfície de dissecação estéril e gelada.
  5. Se pare os hemisférios com um corte médio-sagital. Disseque o hipocampo de cada hemisfério utilizando microespátulas resfriadas.
  6. Congele rapidamente os hipocampos dissecados em nitrogênio líquido. Armazene as amostras a −80°C até a análise.
    CAUTION: O nitrogênio líquido pode causar lesões graves por frio. Use equipamento de proteção individual criogênico apropriado.

6. Quantificação de Biomarcadores do Hipocampo

  1. Suplemente o tampão de lise RIPA gelado com um coquetel combinado de inibidores de protease e fosfatase em uma concentração de trabalho de 1× (10 µL por mL de tampão de lise a partir de um estoque 100×).
  2. Homogeneíze o tecido hipocampal em uma proporção tecido:tampão de 1:10 (p/v) no tampão de lise RIPA gelado suplementado (10 µL de tampão de lise por mg de tecido). Para uma massa típica de tecido hipocampal de aproximadamente 25–30 mg por hemisfério, utilize aproximadamente 250–300 µL de tampão de lise por hemisfério, ou aproximadamente 500–600 µL para cerca de 50–60 mg de tecido hipocampal bilateral.
  3. Centrifugue o homogenato RIPA a 14.000 × g durante 15 min a 4°C e colete o sobrenadante. Utilize o sobrenadante para a quantificação de proteína total e para os três ELISAs de citocinas.
    NOTA: Utilize os tampões de homogeneização específicos para cada kit nos ensaios de SOD, GPx e MDA, conforme as recomendações dos fabricantes para preservar a atividade enzimática.
  4. Prepare um homogenato hipocampal separado a 10% (p/v) para as medições de SOD, GPx e MDA em uma proporção tecido:tampão de 1:9, utilizando o tampão de homogeneização específico do kit correspondente em vez do tampão de lise RIPA.
  5. Determine a concentração total de proteína utilizando um ensaio de proteína BCA.
  6. Quantifique IL-1β, IL-6, TNF-α, SOD, GPx e MDA utilizando os kits de ELISA ou ensaios bioquímicos específicos para cada alvo listados na Tabela de Materiais. Siga as instruções do fabricante para cada ensaio.
  7. Prepare os padrões no tampão de ensaio correspondente. Dilua as amostras de modo que os valores de densidade óptica estejam dentro da porção linear da curva padrão.
  8. Dilua as amostras hipocampais para os ELISAs de citocinas aproximadamente em 1:5 com o diluente de ensaio correspondente. Ajuste a diluição dentro de uma faixa de 1:2 a 1:10 conforme necessário para obter valores de densidade óptica dentro da porção linear da curva padrão.
  9. Utilize diretamente os sobrenadantes dos homogenatos hipocampais a 10% (p/v) descritos na etapa 6.4 para os ensaios de SOD, GPx e MDA. Não aplique o esquema de diluição para ELISA de citocinas descrito na etapa 6.8 a esses três ensaios.
  10. Para os ELISAs de IL-1β, IL-6 e TNF-α, adicione 100 µL de padrão ou amostra hipocampal devidamente diluída por poço em duplicata e incube a 37°C por 90 min. Adicione 100 µL de anticorpo de detecção biotinilado e incube a 37°C por 60 min.
  11. Adicione 100 µL de conjugado de HRP a cada poço do ELISA de citocinas e incube a 37°C por 30 min. Desenvolva com o substrato TMB a 37°C no escuro por aproximadamente 15 min.
  12. Para o ensaio de SOD, misture 20 µL do sobrenadante do homogenato hipocampal com 20 µL da solução enzimática de trabalho e 200 µL da solução de substrato. Incube a 37°C por 20 min e meça a absorbância a 450 nm.
  13. Para o ensaio de GPx, combine 200 µL do sobrenadante do homogenato hipocampal com a mistura de reação contendo GSH e incube a 37°C por 5 min. Interrompa a reação e centrifugue a mistura a 3500 × g por 10 min a 4°C. Submeta o sobrenadante ao desenvolvimento da cor por aproximadamente 15 min e meça a absorbância a 412 nm utilizando 200 µL do sobrenadante da reação.
  14. Para o ensaio de MDA, misture 100 µL do sobrenadante do homogenato hipocampal com 1,0 mL do reagente de trabalho de MDA e incube em banho-maria a 95°C por 40 min. Resfrie e centrifugue a mistura. Transfira aproximadamente 250 µL do sobrenadante para uma microplaca e meça a absorbância a 532 nm.
  15. Para os ELISAs de citocinas, leia a absorbância no comprimento de onda especificado pelo kit, geralmente 450 nm, utilizando correção por comprimento de onda de referência quando disponível.
  16. Gere uma curva padrão utilizando um modelo apropriado, como regressão logística de quatro parâmetros. Normalize cada medição de biomarcador ao teor total de proteína.
  17. Relate as concentrações de citocinas em pg/mg de proteína, as atividades das enzimas antioxidantes em U/mg de proteína e o MDA em nmol/mg de proteína, quando compatível com o kit selecionado.

7. Análise de Dados e Controle de Qualidade

  1. Extraia o tempo de exploração direcionado ao objeto familiar (Tfamiliar) e ao objeto novo (Tnovel) durante a fase do teste NOR.
  2. Calcule o índice de discriminação (ID) da seguinte forma:
    figure-protocol-2.
    NOTA: Um ID acima de 0,5 indica preferência pelo objeto novo.
  3. Exclua um animal da análise NOR quando o tempo total de exploração dos objetos (Tnovel + Tfamiliar) for inferior a 10 s. Aplique este critério antes da análise em nível de grupo e relate todas as exclusões.
  4. Avalie a normalidade para cada grupo utilizando o teste de Shapiro–Wilk e a homogeneidade da variância utilizando o teste de Levene. Para cada grupo, avalie o ID em relação ao nível de chance de 0,5 usando um teste t amostra única bicaudal; se a suposição de normalidade não for atendida, utilize o teste de postos com sinal de Wilcoxon amostra única em vez disso.
  5. Defina alfa em 0,05 para todos os testes estatísticos, salvo indicação em contrário.
  6. Compare o ID entre os grupos independentes NSD e SD utilizando um teste t não pareado bicaudal quando as suposições de normalidade e homogeneidade de variância forem atendidas. Use o teste U de Mann–Whitney caso contrário.
  7. Analise o tempo de exploração do objeto familiar versus novo utilizando uma análise de variância de medidas repetidas a dois fatores, com Grupo e Tipo de Objeto como fatores. Realize comparações post hoc pareadas corrigidas pelo método de Sidak e relate os intervalos de confiança de 95% juntamente com todas as estimativas de comparação entre grupos.
  8. Compare cada biomarcador hipocampal entre os grupos independentes NSD e SD utilizando um teste t não pareado bicaudal quando as suposições de normalidade e homogeneidade de variância forem atendidas. Use o teste U de Mann–Whitney caso contrário.
  9. Ao avaliar múltiplos biomarcadores a partir da mesma coorte, controle a taxa de falsa descoberta ao longo do painel de biomarcadores utilizando o procedimento de Benjamini–Hochberg. Relate os valores de p nominais e ajustados pela FDR.
  10. Realize a análise de poder a priori utilizando o G*Power versão 3.1 para uma comparação bilateral entre amostras independentes, com o índice de discriminação NOR como desfecho primário. Baseie o efeito esperado em estudos previamente publicados que demonstraram um prejuízo acentuado na preferência pelo objeto novo após privação de sono pós-aprendizagem.
  11. Realize a análise de poder a priori utilizando um tamanho de efeito padronizado de Cohen’s d = 1,35, alfa bilateral de 0,05, poder de 80% e razão de alocação 1:1. Esses parâmetros resultam em um tamanho mínimo calculado de amostra de 10 animais por grupo.
    NOTA: O tamanho do efeito foi estimado a partir de dados previamente publicados de reconhecimento de objetos9. Palchykova et al. relataram um efeito significativo de grupo na duração da exploração do objeto novo durante a fase de teste (F(1,16) = 8,26, p < 0,007) em camundongos privados de sono imediatamente após o treinamento em comparação com controles pareados temporalmente (n = 9 por grupo), correspondendo a Cohen’s d ≈ 1,36. Assim, adotou-se um tamanho de efeito padronizado de d = 1,35 para a análise de poder a priori.
  12. Aumente o tamanho planejado da amostra em 20%, para 12 animais por grupo (24 animais no total), para permitir exclusões comportamentais ou técnicas previamente especificadas. Defina previamente como critérios de exclusão: exploração total dos objetos <10 s durante o teste NOR, exclusões relacionadas ao bem-estar, gravações de vídeo inutilizáveis e falha técnica nos ensaios de tecido/amostras.
  13. Não exclua animais com base na direção ou magnitude do efeito do tratamento observado.
  14. Realize as análises estatísticas utilizando Python versão 3.12, SciPy versão 1.17 para testes de hipóteses e cálculos de tamanho de efeito, e statsmodels versão 0.14 para a correção da taxa de falsa descoberta de Benjamini–Hochberg.
  15. Ao utilizar este protocolo para gerar um conjunto de dados formal, relate os tamanhos de efeito (por exemplo, Cohen's d para comparações entre grupos) juntamente com os valores de p para todos os testes estatísticos especificados nos passos 7.4–7.9.

Resultados

Uma implementação bem-sucedida deste protocolo deve gerar um padrão coerente de resultados comportamentais e moleculares, sem a necessidade de interpretação de qualquer leitura isolada. A sequência experimental completa é ilustrada em Figura 1, e o aparato NOR e o delineamento experimental são mostrados em Figura 2. No grupo NSD, os camundongos devem exibir uma preferência clara pelo objeto novo, refletida por um ID acima do nível de chance de 0,5. Camundongos expostos ao protocolo de GH 5 h após o treinamento devem apresentar preferência atenuada pelo objeto novo e um ID inferior ao dos controles NSD. A exploração total dos objetos deve permanecer comparável entre os grupos; uma redução global na exploração sugeriria confundidores motores, de ansiedade ou procedimentais, e não um déficit seletivo de memória de reconhecimento. Na coorte atual (NSD, n = 12; SD, n = 12, dos quais um animal foi excluído de acordo com o limiar pré-especificado de exploração total no Passo 7.3, resultando em n = 11 para a análise NOR; essa exclusão foi aplicada de forma consistente tanto à análise do índice de discriminação quanto à análise do tempo total de exploração relatadas abaixo), os camundongos NSD apresentaram um ID médio de 0,70 ± 0,05 (média ± SD), significativamente acima do nível de acaso de 0,5 (teste t para uma amostra, t(11) = 15.21, p < 0,0001), enquanto os camundongos SD apresentaram uma média de ID de 0,51 ± 0,05, não significativamente diferente do acaso (t(10) = 0.49, p = 0,638). O DI diferiu significativamente entre os grupos (teste t não pareado, t(21) = 9.28, p < 0,0001; d de Cohen d = 3,87; diferença média = 0,19, IC 95% [0,15, 0,23]) (Figura 3A). O tempo total de exploração não diferiu significativamente entre os grupos (NSD: 33,5 ± 8,7 s; DP: 29,9 ± 6,2 s; t(21) = 1.13, p = 0.272) (Figura 3B), consistente com um efeito seletivo sobre a memória de reconhecimento em vez de uma redução generalizada do comportamento exploratório.

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Figura 3. Desempenho no reconhecimento de objeto novo. (A) Índice de discriminação (ID) para os grupos NSD (n = 12) e SD (n = 11; um animal foi excluído de acordo com o limiar pré-especificado de tempo total de exploração). A linha tracejada indica o nível de chance de 0,5. (B) Tempo total de exploração do objeto durante a fase de teste para os grupos NSD (n = 12) e SD (n = 11; a mesma exclusão que no painel A). As barras mostram a média ± erro padrão da média (EP); os círculos abertos mostram os animais individuais. ****p < 0,0001; ns, não significativo (teste t não pareado bicaudal). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

O registro de intervenção (Tabela 1) deve demonstrar que o GH foi mantido com intervenções sensoriais leves e progressivas, em vez de contenção ou locomoção forçada. Grandes diferenças nos números horários de intervenções entre os grupos devem levar à revisão das condições das gaiolas, da consistência dos observadores e das práticas de manipulação antes da interpretação de diferenças comportamentais. Nos 12 grupos registrados neste estudo, os números horários de intervenções durante a janela de 5 h de GH variaram de 1 a 6 por hora, consistindo predominantemente em batidas na gaiola e perturbação da cama, com intervenções com escova macia e objetos novos sendo usadas com menor frequência; nenhuma gaiola exigiu contenção física ou locomoção forçada, e nenhuma alteração no bem-estar foi observada.

Medidas bioquímicas coletadas dos mesmos animais devem fornecer um contexto molecular para o fenótipo comportamental. Espera-se que um modelo bem-sucedido de SD apresente um padrão coordenado de maior carga de citocinas pró-inflamatórias no hipocampo, redução da atividade de enzimas antioxidantes e aumento de marcadores de peroxidação lipídica em comparação com controles NSD pareados. A vinculação de cada amostra tecidual ao respectivo registro de NOR permite a avaliação, em nível animal, da concordância entre dados comportamentais e moleculares, evitando ao mesmo tempo a variação por lote introduzida por coortes comportamentais e bioquímicas separadas. Na coorte atual (NSD, n = 12; SD, n = 12), os seis biomarcadores hipocampais diferiram significativamente entre os grupos na direção esperada, e todos permaneceram significativos após a correção de FDR de Benjamini–Hochberg no painel de seis marcadores: IL-1β (NSD 43,4 ± 7,5 versus DP 58,6 ± 5,3 pg/mg de proteína; t(22) = −5,73, nominal p < 0,0001, ajustado para FDR p < 0.0001, d = −2,34), IL-6 (57,8 ± 8,1 versus 71,8 ± 7,4 pg/mg; t(22) = −4,42, nominal p = 0,0002, ajustado para FDR p = 0.0002, d = −1,81), TNF-α (40.5 ± 7,8 versus 55,1 ± 7,8 pg/mg; t(22) = −4,60, nominal p = 0,0001, ajustado para FDR p = 0.0002, d = −1,88), SOD (18,0 ± 2,0 versus 14,0 ± 1,8 U/mg; t(22) = 5,16, nominal p < 0,0001, ajustado para FDR p < 0.0001, d = 2,11), GPx (13,2 ± 0,9 versus 10,8 ± 1,4 U/mg; t(22) = 4,92, nominal p < 0,0001, ajustado para FDR p < 0.0001, d = 2,01) e MDA (3,5 ± 0,3 vs. 4,9 ± 0,8 nmol/mg t(22) = −5,59, nominal p < 0,0001, ajustado para FDR p < 0.0001, d = −2,28). Esses dados são apresentados em Figura 4. Os pontos de dados individuais mostrados em Figura 3 e Figura 4 são as medições experimentais reais obtidas nesta coorte, e todas as médias relatadas, tamanhos do efeito, valores de p e intervalos de confiança foram calculados diretamente a partir desses mesmos dados subjacentes.

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Figura 4. Biomarcadores do hipocampo em camundongos NSD versus SD. Níveis hipocampais de IL-1β, IL-6 e TNF-α (citocinas pró-inflamatórias), SOD e GPx (enzimas antioxidantes) e MDA (marcador de peroxidação lipídica) em camundongos NSD (n = 12) e SD (n = 12). As barras mostram a média ± erro padrão da média (SEM); os círculos abertos representam animais individuais. Os símbolos de significância refletem valores de p ajustados pelo FDR de Benjamini–Hochberg no painel de seis biomarcadores. ***p < 0,001 e ****p < 0,0001 após ajuste de FDR (testes t não pareados bicaudais). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Se camundongos NSD não exibirem preferência por objeto novo, se a exploração total for inferior ao limiar predefinido ou se a variância do biomarcador for inesperadamente grande, investigue problemas na habituação, seleção de objetos, consistência da intervenção, identificação das amostras e no tempo de processamento dos tecidos antes de repetir a coorte, conforme resumido na Tabela 2. Esses resultados representam dados experimentais subótimos que exigem solução de problemas antes da interpretação. Na coorte atual, um animal SD (M19) foi excluído da análise NOR de acordo com o limiar preestabelecido de exploração total (8,7 s; Etapa 7,3), ilustrando o tipo de resultado subótimo abordado por este critério; nenhum animal NSD deixou de mostrar preferência por objeto novo, e nenhuma coorte apresentou variância inesperadamente grande de biomarcador que exigisse repetição da coorte neste conjunto de dados.

ProblemaCausa possívelSolução
Baixa exploração geral no NORHabituação insuficiente, alta ansiedade ou perturbação ambiental excessivaAmplie o manuseio diário; confirme que o ambiente de teste é silencioso e com pouca iluminação; verifique a habituação à arena antes do treinamento.
Sem preferência por objeto novo nos controles NSDObjetos diferem em preferência inata ou são insuficientemente distintosPré-selecione objetos em animais ingênuos; use objetos com texturas/formas claramente diferentes, mas com tamanho e acessibilidade equivalentes.
Grande variação nas contagens de intervenção GHLimiares inconsistentes entre observadores ou condições de gaiolaCapacite os observadores usando os mesmos critérios de vigília; utilize o mesmo registro de intervenções; padronize a cama, o enriquecimento da gaiola e as condições ambientais.
Alta variabilidade nas medidas de biomarcadoresDissecação tardia, identidade inconsistente das amostras ou degradação das amostrasMantenha a identificação de comportamento-amostra; padronize o momento da dissecação; congele rapidamente; mantenha as amostras sobre gelo durante a homogeneização.
Camundongos SD apresentam sofrimento acentuadoManuseio excessivamente intensoUtilize apenas intervenções sensoriais leves; interrompa e siga os procedimentos de bem-estar aprovados caso seja observado sofrimento.

Tabela 2: Solução de problemas. Problemas comuns encontrados durante o protocolo de NOR, a privação de sono com manipulação suave e a análise de biomarcadores do hipocampo, juntamente com as possíveis causas e as ações corretivas recomendadas.

Discussão

Este artigo fornece um framework rápido e reprodutível para estudar os déficits na memória de reconhecimento induzidos pela privação aguda de sono e as alterações moleculares no hipocampo. Ao aplicar 5 h de manipulação suave imediatamente após uma fase de aprendizagem padronizada de 10 min, o procedimento tem como alvo uma janela definida de consolidação pós-aprendizagem e foi projetado para reduzir o impacto físico associado a modelos de privação prolongada ou procedimentos baseados em movimento forçado4,5. No entanto, esta submissão não inclui medições diretas de hormônios do estresse para confirmar uma resposta fisiológica de estresse mais baixa, conforme discutido abaixo nas limitações do método.

Os fatores técnicos mais críticos são a habituação, a seleção consistente dos objetos, o intervalo de retenção fixo de 5 h e o monitoramento contínuo, mas não aversivo, durante a GH. Como o NOR depende da exploração espontânea, a ansiedade residual ou uma má habituação à arena podem suprimir a exploração dos objetos e obscurecer os efeitos relacionados à memória8. O critério pré-especificado de exclusão do tempo de exploração e o registro de intervenções fornecem controles práticos de qualidade que ajudam a distinguir um ensaio comportamental falho de um fenótipo de memória genuíno. Quando a exploração geral é baixa, a preferência pelo objeto novo está ausente nos controles NSD, as contagens de intervenção da GH variam significativamente, as medidas de biomarcadores mostram alta variabilidade ou os camundongos SD apresentam evidente sofrimento, os pesquisadores devem consultar os procedimentos correspondentes de solução de problemas na Tabela 2 antes de repetir ou interpretar o experimento.

Em vez de representar uma simples concatenação de técnicas previamente estabelecidas, a contribuição incremental deste protocolo reside em quatro elementos operacionais específicos destinados a abordar a reprodutibilidade, e não a disponibilidade da técnica. Primeiro, o registro obrigatório de intervenções (Protocolo Etapa 3 e Tabela 1) introduz um registro quantificável e comparável para padronizar a intensidade da GH entre coortes e estudos. A técnica em si possui uma história já estabelecida, enquanto o presente protocolo enfatiza a padronização operacional de sua implementação. Isso está de acordo com a história consolidada da GH como uma técnica de privação total de sono e com a falta previamente observada de padronização em sua aplicação entre diferentes estudos6. Segundo, o protocolo exige um delineamento com a mesma coorte, no qual os desfechos comportamentais e moleculares são coletados dos mesmos animais individualmente rastreados dentro de um único fluxo de trabalho de 10 dias; esse delineamento tem como objetivo reduzir a variação associada à coleta de desfechos comportamentais e bioquímicos em coortes separadas. Terceiro, o protocolo fixa a janela de treinamento e privação a uma âncora circadiana definida (ZT1, Protocolo Etapa 2) e exige que as coortes NSD e SD sejam mantidas sob condições de fase luminosa equivalentes (Protocolo Etapa 3), controlando assim o momento circadiano dentro do fluxo de trabalho. Quarto, o protocolo especifica critérios analíticos e de controle de qualidade a priori, incluindo um limiar mínimo de tempo de exploração (Protocolo Etapa 7), relato transparente de exclusões, planejamento prospectivo de poder estatístico, testes do DI em relação ao nível de chance de 0,5, verificação de pressupostos, correção para múltiplas comparações de biomarcadores e relato do tamanho do efeito. Em conjunto, esses elementos convertem métodos individualmente estabelecidos em um fluxo de trabalho explícito e transferível, proposto como um quadro de referência candidato contra o qual laboratórios individuais podem comparar suas próprias implementações, mediante adoção independente e replicação, e não como um relato de uma descoberta biológica específica.

O fluxo de trabalho apresenta várias limitações. A GH é intensiva em mão de obra e exige atenção contínua do pesquisador, o que limita a produtividade. Além disso, a GH mantém o estado de vigília, mas por si só não quantifica a arquitetura do sono. Aplicações futuras podem incorporar validação piloto com EEG/EMG para documentar os estados de vigília e verificar o grau de privação de sono provocado pelo procedimento de GH antes de aplicar o fluxo de trabalho a uma coorte experimental completa. Aplicações futuras também podem incluir medições de corticosterona para avaliar os efeitos relacionados ao estresse da intervenção. Essas medições não fazem parte do presente protocolo e, portanto, não devem ser interpretadas como validação realizada neste estudo. O NOR é sensível à memória de reconhecimento, mas não avalia de forma abrangente a navegação espacial ou a memória de trabalho; ensaios complementares, como o labirinto em Y, o labirinto de Barnes ou outras tarefas de um único ensaio, podem ser adicionados quando um perfil cognitivo mais amplo for necessário. O método modificado dos múltiplos plataformas representa uma abordagem alternativa para induzir experimentalmente a privação de sono e tem sido usado para quantificar a perda e recuperação do sono4; em contraste, o presente fluxo de trabalho de GH enfatiza uma intervenção sensorial leve sem locomoção forçada. No entanto, como os marcadores fisiológicos de estresse não foram medidos diretamente neste protocolo, nenhuma conclusão pode ser feita aqui sobre a GH provocar uma resposta de estresse fisiológico menor.

O método deve, portanto, ser considerado principalmente como uma plataforma padronizada de entrada, e não como um modelo completo de todas as consequências cognitivas da privação de sono. Seu valor reside na ligação explícita entre uma intervenção controlada com GH após a aprendizagem, uma leitura comportamental projetada para minimizar o manuseio físico em relação aos paradigmas de locomoção forçada, a coleta de hipocampo no mesmo animal e controles de qualidade transparentes. O NOR fornece uma abordagem consolidada de um único ensaio para avaliar a memória de reconhecimento7,8, e a privação de sono já foi previamente associada a prejuízos no reconhecimento de objetos9, alterações neuroinflamatórias no hipocampo10 e estresse oxidativo no hipocampo com déficits de memória11. Assim, esta estrutura pode facilitar comparações entre coortes e fornecer uma base prática para estudos mecanicistas e triagem de intervenções destinadas a atenuar os prejuízos cognitivos associados à privação de sono; trabalhos anteriores também investigaram intervenções direcionadas aos prejuízos cognitivos e à neuroinflamação associados à privação de sono12. Em consonância com este escopo, a presente submissão foca em estabelecer e padronizar um fluxo de trabalho reprodutível, ao mesmo tempo que fornece dados representativos que demonstram o desempenho do protocolo; um conjunto de dados mais abrangente e uma interpretação biológica mais ampla podem ser relatados separadamente em trabalhos futuros.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Cultivo Jovem do Hospital Nanjing Drum Tower, pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (número do convênio 82502706) e pelo Programa de Pesquisa Básica de Jiangsu (número do convênio BK20250258). Ferramentas assistidas por IA foram utilizadas durante a preparação e revisão do manuscrito, incluindo a redação e aprimoramento de texto e a geração e aprimoramento de figuras esquemáticas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Etanol 70%Qualquer fornecedorN/ALimpeza da arena NOR e dos objetos
Camundongos machos adultos C57BL/6J (8–12 semanas)Zhejiang AILIMO Biotechnology Co., Ltd.N/AAnimais experimentais
Kit de ensaio de proteína BCAThermo Fisher Scientific (Pierce)23225Determinação e normalização de proteína total
Software de análise comportamentalNoldus Information Technology B.V.EthoVision XT versão 17.5Classificação e análise da exploração NOR
Centrífuga capaz de 14.000 × g a 4 °CEppendorfCentrífuga 5424 R; Cat. 5404000610Clarificação de homogeneizados de hipocampo
Tubos de papel limposQualquer fornecedorN/AIntervenção de manipulação suave
Equipamento de proteção individual criogênicoQualquer fornecedorN/AManuseio seguro de nitrogênio líquido
Kit de ensaio de glutationa peroxidaseAbcamab102530Quantificação de GPx
Homogeneizador de tecido de hipocampoIKA-Werke GmbH & Co. KGT 10 basic ULTRA-TURRAX; Cat. 0003737000Homogeneização de tecido de hipocampo em tampão de lise
Nitrogênio líquidoQualquer fornecedorN/ACongelamento rápido de hipocampos dissecados
Kit de ensaio de MDASigma-AldrichMAK085Quantificação de MDA
Leitor de microplacasAgilent Technologies / BioTekBioTek Epoch 2 Microplate SpectrophotometerMedição de absorbância nos comprimentos de onda especificados pelos kits
MicroespátulasQualquer fornecedorN/ADissecação de hipocampo; usadas geladas
Kit ELISA de IL-1β de camundongoR&D SystemsMLB00CQuantificação de IL-1β
Kit ELISA de IL-6 de camundongoR&D SystemsM6000BQuantificação de IL-6
Kit ELISA de TNF-α de camundongoR&D SystemsMTA00BQuantificação de TNF-α
Conjuntos de objetos A/A′ e BQualquer fornecedorN/AFases de familiarização e teste NOR
Arena NOR opaca (40 cm × 40 cm × 40 cm)Qualquer fornecedorN/ATeste comportamental
Sistema de gravação de vídeo superiorBasler AGacA1300-60gmGravação em vídeo das sessões de familiarização e teste NOR
Cocktail de inibidores de protease/fosfataseThermo Fisher Scientific (Thermo Scientific)78440Adicionado ao tampão de lise na concentração de trabalho 1× (10 µL/mL a partir de um estoque 100×)
Tampão de lise RIPAThermo Fisher Scientific89900Homogeneização de tecido de hipocampo
Tubos de amostra adequados para armazenamento criogênicoThermo Fisher Scientific (Nunc)Nunc CryoTube, 1,8 mL; Cat. 375418Manutenção de identificações específicas por animal e armazenamento de tecido de hipocampo dissecado
Pincel macioQualquer fornecedorN/AIntervenção de manipulação suave
Kit de ensaio de SODSigma-Aldrich19160Quantificação de SOD
Software estatístico e de análise de poderG*Power; Python Software FoundationG*Power versão 3.1; Python versão 3.12 (SciPy 1.17; statsmodels 0.14)Análise de poder a priori e análises estatísticas descritas na Seção 7 do Protocolo
Ração padrão para roedoresJiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co., Ltd.Dieta de manutenção irradiada para rato/camundongo; XTI01WC-010Alimentação ad libitum dos animais
Freezer −80 °CHaier BiomedicalDW-86L626Armazenamento de longo prazo de tecido de hipocampo congelado rapidamente

Referências

  1. Walker MP, Stickgold R. Sleep, memory, and plasticity. Annual Review of Psychology. 2006;57:139-166.
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  5. Hagewoud R, et al. Sleep deprivation impairs spatial working memory and reduces clearance of hippocampal β-amyloid in rats. Neurobiology of Aging. 2013;34(1):22-30.
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  11. Silva RH, et al. Role of hippocampal oxidative stress in memory deficits induced by sleep deprivation in mice. Neuropharmacology. 2016;104:1-8.
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