É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Um Protocolo Otimizado para a Geração de Organoides Vasculares a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

231 visualizações

⸱

DOI:

10.3791/73561

⸱

3 de setembro de 2026

 ,  , 
1Center for Stem Cell and Translational Medicine, School of Life Science and Medical Engineering, Anhui University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta um método para gerar organoides vasculares utilizando células-tronco pluripotentes induzidas humanas.

Resumo

Organoides vasculares derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) surgiram como modelos tridimensionais poderosos para o estudo do desenvolvimento vascular, mecanismos de doenças e respostas a medicamentos. Os protocolos atuais de organoides vasculares permitem a geração de redes endoteliais e de pericitos autorreguláveis; no entanto, a variabilidade entre lotes, a formação inconsistente de organoides e a cobertura inadequada por pericitos podem comprometer a reprodutibilidade e a escalabilidade. Este estudo apresenta um protocolo otimizado para a geração de organoides vasculares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) com melhor reprodutibilidade e consistência estrutural. As principais modificações incluem condições refinadas para a formação de corpos embrioides, concentrações e cronometragem otimizadas de fatores de crescimento durante a indução de mesoderma e a especificação vascular, e condições de cultura tridimensional aprimoradas que promovem o recrutamento robusto de pericitos e as interações entre endotélio e pericitos. Os organoides otimizados exibem redes endoteliais altamente ramificadas positivas para CD31 consistentemente envoltas por pericitos positivos para PDGFR-β, com variabilidade significativamente reduzida entre lotes em comparação com o protocolo original. São fornecidos procedimentos detalhados, passo a passo, para a geração de organoides, caracterização por imunofluorescência em montagem inteira e avaliação de controle de qualidade. Este método otimizado permite a produção escalável de organoides vasculares de alta qualidade adequados para o estudo das interações entre células vasculares, modelagem de doenças e triagem de compostos, reduzindo assim a barreira técnica para laboratórios que desejam adotar este sistema de modelo.

Introdução

Organoides tridimensionais (3D) surgiram como ferramentas poderosas para modelar o desenvolvimento e as doenças humanas in vitro, oferecendo biomimetismo estrutural e relevância fisiopatológica superiores em comparação com modelos convencionais de cultivo celular bidimensional1,2. Nos últimos anos, organoides derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) foram estabelecidos com sucesso para múltiplos tipos de tecidos, incluindo intestino3, cérebro4,5, rim6, fígado7,8 e retina9. No entanto, um grande desafio nos estudos baseados em organoides é a vascularização insuficiente durante o cultivo de longo prazo, o que pode levar à hipóxia e necrose, impedindo assim a expansão e diferenciação dos organoides10,11. Para superar essa limitação, diversas estratégias de co-cultivo foram introduzidas, incluindo a incorporação de células endoteliais ou células-tronco mesenquimais para promover a formação de redes vasculares12,13. No entanto, os cultivos convencionais bidimensionais e os modelos animais não recapitulam plenamente a biologia vascular humana, enquanto abordagens de co-cultivo introduzem complexidade experimental adicional14. Organoides vasculares capazes de vascularização autônoma, portanto, oferecem uma promissora alternativa relevante ao ser humano15.

A formação da rede vascular envolve tanto a vasculogênese quanto a angiogênese, que são coordenadas por meio de interações entre células endoteliais e células murais, como pericitos e células musculares lisas vasculares, e são rigorosamente reguladas por múltiplas moléculas sinalizadoras, incluindo VEGF (fator de crescimento endotelial vascular), TGF-β (fator de crescimento transformador-β), PDGF (fator de crescimento derivado de plaquetas) e angiopoietinas16. Em 2019, Wimmer e colegas estabeleceram um método para gerar organoides vasculares tridimensionais autoagregáveis diretamente a partir de hPSCs17,18. Esse sistema gera simultaneamente células endoteliais e pericitos, resultando em redes microvasculares com formação de lúmen e cobertura pela membrana basal. Com base nessa plataforma, organoides vasculares têm sido utilizados para modelar vasculopatia diabética sob estimulação com glicose elevada e citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-6); esses organoides reproduzem o espessamento da membrana basal, uma característica marcante da patologia microvascular diabética17. Além disso, esse modelo tem sido usado para estudar doenças vasculares hereditárias e servir como plataforma para triagem de toxicidade vascular19. Mais recentemente, diversos estudos voltados para métodos têm buscado otimizar a geração de organoides vasculares. Por exemplo, avanços no sequenciamento de RNA de célula única identificaram fatores reguladores-chave, como MECOM e LEF1, fornecendo assim uma base molecular para caracterizar e otimizar a formação de organoides vasculares humanos. Além disso, Xu et al. introduziram micropoços para facilitar a formação homogênea de corpos embrionários e incorporaram o coquetel CEPT para melhorar a viabilidade celular, reduzindo efetivamente a variabilidade entre lotes20.

Para melhorar a homogeneidade, reprodutibilidade e produtividade na geração de organoides vasculares, o protocolo original descrito por Wimmer et al.17,18 foi sistematicamente otimizado para superar várias limitações principais. Primeiro, o protocolo original utiliza agregação natural em placas com baixa adesão para a formação de corpos embrioides, o que pode resultar em variabilidade substancial entre lotes quanto ao tamanho dos agregados e, consequentemente, em eficiência heterogênea de diferenciação. No protocolo otimizado, o álcool polivinílico (PVA) é combinado com agitação orbital durante a formação dos agregados para promover agregação celular uniforme e melhorar a consistência no tamanho dos corpos embrioides. Segundo, o protocolo original utiliza substituição completa do meio durante a fase de formação da rede vascular, o que pode causar flutuações substanciais nas concentrações de fatores de crescimento e comprometer a brotação vascular sustentada e o recrutamento de pericitos. Em contraste, o protocolo otimizado mantém um terço do meio condicionado durante cada troca de meio, preservando fatores pró-angiogênicos endógenos e estabilizando o ambiente de cultura. Terceiro, o protocolo original exige múltiplas transferências de placas durante o isolamento e maturação dos organoides, aumentando os requisitos de manipulação e o risco de perda dos organoides. O protocolo otimizado elimina essas etapas transferindo individualmente os organoides isolados para poços de placas de 96 poços com baixa adesão, simplificando assim o procedimento e aumentando a produtividade. Em conjunto, este protocolo otimizado fornece procedimentos detalhados passo a passo e pontos críticos de controle de qualidade para reduzir a barreira técnica à adoção desse sistema modelo e facilitar a aplicação mais ampla de organoides vasculares em estudos de desenvolvimento vascular, mecanismos de doenças e triagem de fármacos em alta produtividade.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

O uso de hPSCs neste estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Biomédica da Universidade de Anhui (BECAHU_2026-010).

1. Manutenção de células-tronco pluripotentes induzidas humanas

OBSERVAÇÃO: Mantenha células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) em condições livres de camada de sustentação. Realize todos os procedimentos em uma cabine de segurança biológica Classe II utilizando técnica asséptica.

  1. Preparação de placas de cultura revestidas com matriz da membrana basal
    1. Retire um frasco de matriz da membrana basal do congelador a −20 °C e descongele-o a 4 °C durante a noite por aproximadamente 12–16 h. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
    2. Homogeneíze bem a matriz da membrana basal descongelada em condições estéreis e divida-a em alíquotas de uso único (por exemplo, 1 mL por tubo). Armazene as alíquotas a −20 °C por até 2 anos.
      NOTA: Mantenha a matriz da membrana basal, pipetas, ponteiras e tubos frios durante o manuseio para evitar solidificação prematura. Evite introduzir bolhas de ar.
    3. Descongele a alíquota necessária de matriz da membrana basal em gelo. Dilua a matriz da membrana basal na proporção de 1:200 em DMEM pré-resfriado (5 µL de matriz da membrana basal por 1 mL de DMEM; concentração final, aproximadamente 5 µg/mL).
    4. Agite suavemente a solução com a pipeta até que não restem partículas visíveis.
    5. Adicione 0,5 mL da matriz da membrana basal diluída a cada poço de uma placa de 12 poços. Incline e gire suavemente a placa para revestir toda a superfície do fundo.
    6. Incube a placa revestida a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO₂ por pelo menos 2 h ou a 4 °C durante a noite.
      NOTA: Armazene as placas revestidas e vedadas a 4 °C por 1–2 semanas. Equilibre a placa à temperatura ambiente e aspire a solução de revestimento imediatamente antes do uso.
  2. Descongelamento de hiPSCs
    1. Retire um criofrasco de hiPSCs congeladas do nitrogênio líquido e coloque-o imediatamente em banho-maria a 37 °C. Agite suavemente o frasco e remova-o em até 1 min, quando restarem apenas alguns pequenos cristais de gelo.
      NOTA: Evite exposição prolongada à dimetilsulfóxido (DMSO) a 37 °C e descongelamento incompleto, pois ambos podem reduzir a viabilidade celular.
    2. Desinfete a parte externa do criofrasco com etanol 70% e abra-o dentro da cabine de segurança biológica.
    3. Transfira lentamente a suspensão celular gota a gota para um tubo cônico de 15 mL contendo 3 mL de meio de manutenção quimicamente definido para hPSC pré-aquecido, ou um meio de manutenção quimicamente definido equivalente. Misture suavemente durante a transferência para diluir gradualmente o DMSO e minimizar o estresse osmótico.
    4. Centrifugue as células a 300 × g por 3 min à temperatura ambiente (22–24 °C) utilizando rotor de cestos oscilantes.
    5. Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Resuspenda suavemente o pellet em 1 mL de meio de manutenção quimicamente definido para hPSC pré-aquecido.
      NOTA: Use uma pipeta P1000 e pipete suavemente 2–3 vezes para minimizar o cisalhamento mecânico e a formação de bolhas.
  3. Plaqueamento e cultura de hiPSCs
    1. Retire a placa de 12 poços pré-revestida da incubadora e aspire a solução de revestimento. Não lave os poços.
    2. Semente aproximadamente 1 × 105–2 × 105 células viáveis por poço para recuperação rotineira após o descongelamento. Ajuste a densidade conforme a linhagem de hiPSCs e os requisitos experimentais.
    3. Dispense lentamente a suspensão celular ao longo da parede de cada poço, sem tocar a superfície revestida com a ponteira da pipeta.
    4. Adicione Y-27632 até uma concentração final de 5 µM para promover a sobrevivência e adesão celular após o descongelamento.
      NOTA: Use Y-27632 apenas no meio inicial de plaqueamento. Substitua-o no dia seguinte por meio de manutenção quimicamente definido para hPSC sem Y-27632.
    5. Incube as células a 37 °C com 5% de CO₂ e umidade saturada.
    6. Avalie a adesão e a morfologia celular após aproximadamente 16–24 h. Aspire o meio e substitua-o por meio fresco e pré-aquecido de manutenção quimicamente definido para hPSC sem Y-27632.
    7. Substitua o meio diariamente ou em dias alternados até que as células atinjam uma confluência de aproximadamente 70%–80% para passagem ou diferenciação.
      NOTA: Examine as culturas diariamente. Utilize colônias com bordas compactas e bem definidas, alta razão núcleo-citoplasma e mínima diferenciação espontânea.

2. Geração e diferenciação de agregados de hiPSC

OBSERVAÇÃO: Mantenha as hiPSCs em condições livres de células de apoio em meio de manutenção de hPSC quimicamente definido, em placas revestidas com matriz de membrana basal. Passe as células a cada 4–5 dias utilizando EDTA 0,02%. Utilize culturas com densidade de semeadura e tamanho de colônia apropriados e com diferenciação espontânea mínima para maximizar a eficiência de diferenciação vascular.

  1. Preparação de uma suspensão de células isoladas
    1. Aspire o meio de manutenção quimicamente definido para hPSC e lave as hiPSCs com 0,5 mL de DMEM por poço de uma placa de 6 poços.
    2. Aspire o DMEM e adicione 0,5 mL de EDTA 0,02% por poço. Incube à temperatura ambiente por 2–4 min e acompanhe as células até que comecem a se arredondar.
    3. Desprenda as células usando uma pipeta P1000. Pipete suavemente 2–3 vezes para dissociar os agregados em uma suspensão de células isoladas.
    4. Resuspenda as células em 5 mL de meio de manutenção quimicamente definido para hPSC e transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL.
    5. Misture 10 µL da suspensão celular com 10 µL de solução de azul de tripano 0,1%. Carregue 10 µL da mistura em uma câmara de contagem e determine o número de células viáveis.
    6. Calcule o volume de suspensão celular necessário para obter 5 × 105 células viáveis por poço.
    7. Centrifugue as células a 300 × g durante 5 min à temperatura ambiente (22–23 °C). Aspire o sobrenadante.
    8. Resuspenda as células em meio de manutenção quimicamente definido para hPSC fresco contendo 50 µM Y-27632, em um volume de 3 mL por poço.
  2. Formação de agregados
    1. Adicione 3 mL da suspensão celular a cada poço de uma placa de 6 poços com superfície de baixa adesão. Adicione PVA até uma concentração final de 0,25%.
    2. Coloque a placa em um agitador orbital a 50 rpm e incube a 37 °C por 1 dia.
    3. Confirme a formação de agregados com bordas lisas e diâmetro aproximado de 50–100 µm ou maior antes de prosseguir.
    4. NOTA: Otimize o período de agregação para cada linhagem individual de hiPSC. Prolongue a incubação para 2–3 dias quando necessário para obter agregados do tamanho desejado.
  3. Indução de mesoderma
    1. No Dia 0, transfira os agregados para um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta descartável estéril de 10 mL. Mantenha a placa original de baixa adesão para o replante.
    2. Deixe os agregados sedimentarem por gravidade por aproximadamente 15–20 min.
    3. NOTA: Manipule os agregados com cuidado e utilize sedimentação por gravidade em vez de centrifugação para minimizar danos mecânicos.
    4. Aspire cuidadosamente o sobrenadante após os agregados terem sedimentado.
    5. Resuspenda os agregados em 3 mL por poço de meio N2B27 suplementado com 12 µM CHIR99021 e 30 ng/mL de BMP-4.
    6. Transfira os agregados de volta para a placa de baixa adesão e incube a 37 °C.
    7. Pipete os agregados suavemente uma vez ao dia com uma pipeta P1000 para minimizar a fusão excessiva dos agregados. Continue a indução de mesoderma por 3 dias.
  4. Indução da linhagem vascular
    1. No Dia 3, transfira os agregados para um tubo cônico de 15 mL e deixe-os sedimentarem por gravidade. Mantenha a placa de 6 poços original.
    2. Aspire cuidadosamente o sobrenadante após os agregados terem sedimentado.
    3. Resuspenda os agregados em 3 mL por poço de meio N2B27 suplementado com 100 ng/mL de VEGF-A e 2 µM de forskolina.
    4. Transfira os agregados de volta para a placa de 6 poços com superfície de baixa adesão e incube por mais 2 dias.

3. Geração de redes vasculares e organoides

  1. Preparação da matriz de colágeno I–membrana basal
    1. Coletar os agregados gerados em uma placa de 6 poços para inclusão em uma placa de 12 poços. Utilizar aproximadamente 40–60 agregados por poço.
    2. Preparar uma quantidade suficiente da mistura de matriz de colágeno I–membrana basal para adicionar duas camadas de 0,5 mL a cada poço da placa de 12 poços.
    3. Preparar 12 mL de matriz para uma placa de 12 poços. Manter todos os componentes em gelo, preparar a mistura imediatamente antes do uso e evitar a introdução de bolhas de ar.
    4. Adicionar 0,5 mL de matriz a cada poço da placa de 12 poços. Agitar suavemente a placa para distribuir a matriz uniformemente.
    5. Incubar a placa a 37 °C por 2 h para permitir a solidificação da primeira camada da matriz.
  2. Inclusão dos agregados
    1. Transferir os agregados para um tubo cônico de 15 mL utilizando uma pipeta descartável estéril de 10 mL e deixá-los sedimentar por gravidade.
    2. Aspirar o sobrenadante e lavar os agregados duas vezes com 1 mL de meio N2B27. Remover o máximo possível do meio residual após a lavagem final.
    3. Preparar uma nova mistura de matriz de colágeno I–membrana basal e mantê-la em gelo.
    4. Res suspender suavemente os agregados lavados na matriz recém-preparada.
    5. Retirar a placa de 12 poços contendo a primeira camada solidificada do incubador.
    6. Adicionar 0,5 mL da matriz contendo os agregados a cada poço.
    7. Balançar suavemente a placa por não mais de 1 min para distribuir os agregados uniformemente.
    8. Incubar imediatamente a placa a 37 °C por 2 h para permitir a solidificação da segunda camada.
  3. Indução da brotação vascular
    1. Pré-aquecer o meio N2B27 suplementado com 15% de FBS, 100 ng/mL de VEGF-A e 100 ng/mL de FGF-2 até 37 °C.
    2. Adicionar o meio suplementado pré-aquecido a cada poço para induzir a diferenciação vascular.
    3. Monitorar as culturas quanto à brotação vascular nos próximos 1–3 dias.
    4. NOTA: Pré-aquecer o meio a 37 °C antes de adicioná-lo às culturas para minimizar a desestabilização da matriz em gel.
  4. Troca de meio e manutenção da cultura
    1. Realizar a primeira troca de meio 3 dias após a inclusão.
    2. Substituir o meio a cada dois dias a partir de então, utilizando meio N2B27 fresco contendo 15% de FBS, 100 ng/mL de VEGF-A e 100 ng/mL de FGF-2.
    3. Manter um terço do meio condicionado durante cada troca de meio e substituir os dois terços restantes por meio suplementado fresco.
  5. Prosseguir com o isolamento de organoides vasculares no Dia 10.

4. Estabelecimento de organoides vasculares e preparação para coloração

  1. Isolamento de redes vasculares individuais
    1. Insira a extremidade arredondada de uma espátula estéril ao longo da borda do poço e desprenda suavemente a matriz gelificada do fundo.
    2. Continue movendo a espátula da borda do poço em direção ao centro até que toda a matriz gelificada flutue livremente.
    3. Utilize duas agulhas estéreis para excisar redes vasculares individuais do gel. Remova o máximo de matriz excedente possível sem danificar a rede vascular.
  2. Cultivo de organoides isolados
    1. Transfira cada organoide isolado diretamente para um poço individual de uma placa de 96 poços com superfície não aderente, utilizando uma pipeta descartável estéril.
    2. Adicione 100 µL de meio N2B27 suplementado com 15% de FBS, 100 ng/mL de VEGF-A e 100 ng/mL de FGF-2 a cada poço.
    3. Incube os organoides por mais 5 dias e substitua o meio suplementado diariamente.
    4. Confirme que os organoides exibem morfologia arredondada e completamente encapsulada no Dia 5 da maturação.
  3. Fixação de organoides vasculares
    1. Transfira os organoides morfologicamente maduros para tubos microcêntrifugos de 2 mL. Processe não mais do que aproximadamente 60 organoides por tubo.
    2. Aspire cuidadosamente o meio e adicione paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS.
    3. Fixe os organoides à temperatura ambiente por 1 h.
      ATENÇÃO: O PFA é tóxico e suspeito de ser carcinogênico. Manipule o PFA em capela de exaustão química, utilizando equipamento de proteção individual apropriado.
    4. Aspire o PFA e substitua por PBS.
      PONTO DE PAUSA: Armazene os organoides vasculares fixados em PBS a 4 °C por até 1 mês.

5. Coloração e imagem confocal de organoides vasculares

  1. Bloqueio e permeabilização
    1. Adicione 2 mL de tampão de bloqueio a cada tubo contendo organoides vasculares fixados.
    2. Posicione os tubos verticalmente em um agitador orbital e incube com agitação à temperatura ambiente por 2 h para bloquear e permeabilizar os organoides.
  2. Incubação com anticorpo primário
    1. Aspire o tampão de bloqueio e adicione 50–100 µL de anticorpo primário diluído 1:100 em tampão de bloqueio.
    2. Posicione os tubos na posição vertical em um agitador e incube com agitação a 4 °C durante a noite.
  3. Lavagem e incubação com anticorpo secundário
    1. Lave as amostras três vezes com PBST por 10–15 min a cada lavagem. Agite os tubos posicionados verticalmente durante cada lavagem.
    2. Adicione anticorpo secundário fluorescente diluído 1:300 em tampão de bloqueio.
    3. Incube as amostras à temperatura ambiente por 2 h.
  4. Contracoloração nuclear e lavagem final
    1. Lave as amostras duas vezes com PBST por 10–15 min a cada lavagem.
    2. Adicione solução de Hoechst diluída 1:5.000 em PBS e incube à temperatura ambiente por 10–15 min.
    3. Lave as amostras com PBS por 10–15 min.
  5. Imagem confocal
    1. Transfira os organoides corados para placas de imagem confocal.
    2. Adquira imagens confocais utilizando parâmetros de imagem consistentes entre os grupos experimentais.
  6. Análise quantitativa de imagens de organoides vasculares
    NOTA: Realize a análise quantitativa de imagens utilizando o Fiji/ImageJ e o AngioTool. Mantenha configurações idênticas de aquisição no microscópio para todos os grupos experimentais.
    1. Medição do diâmetro de agregados
      1. Adquira imagens de campo claro de agregados de hiPSC no Dia 0 utilizando um microscópio invertido com escala calibrada. Capture imagens de agregados bem separados e inclua uma barra de escala.
      2. Importe cada imagem para o Fiji/ImageJ. Trace uma linha ao longo da barra de escala utilizando a ferramenta Linha Reta e selecione Analisar > Definir escala.
      3. Insira a distância e a unidade conhecidas (por exemplo, 100 µm) e selecione Global para aplicar a calibração a todas as imagens da sessão.
      4. Trace uma linha através do diâmetro mais largo de cada agregado utilizando a ferramenta Linha Reta. Selecione Analisar > Medir ou pressione Ctrl+M e registre o diâmetro em µm.
      5. Meça pelo menos 30 agregados por lote.
      6. Para agregados não esféricos, contorne cada agregado utilizando a ferramenta de Seleção Oval ou Poligonal. Selecione Analisar > Definir medições > Diâmetro de Feret e registre a medição.
      7. Exporte as medições da tabela de Resultados e compile os dados em uma planilha.
      8. Calcule a média, o desvio padrão (DP) e o coeficiente de variação (CV) como CV = DP/média × 100% para cada lote.
    2. Medição do diâmetro de organoides
      1. Adquira imagens de campo claro de organoides vasculares maduros no Dia 15 utilizando um microscópio invertido com escala calibrada. Inclua uma barra de escala em cada imagem.
      2. Importe cada imagem para o Fiji/ImageJ e calibre a escala conforme descrito no passo
      3. Trace uma linha através do diâmetro mais largo de cada organoide utilizando a ferramenta Linha Reta. Selecione Analisar > Medir ou pressione Ctrl+M e registre o diâmetro em µm.
      4. Meça pelo menos 30 organoides por lote.
      5. Para organoides com formato irregular, meça os diâmetros mais longo e mais curto e calcule a média, ou determine o diâmetro de Feret conforme descrito no passo 5.6.1.6.
      6. Exporte as medições e calcule a média, o DP e o CV para cada lote.
    3. Quantificação da área vascular positiva para CD31
      1. Adquira imagens em z-stack confocal de organoides completos no Dia 15 corados para CD31. Utilize potência do laser, ganho, offset e configurações de pinhole idênticas para todas as amostras.
      2. Gere projeções de intensidade máxima (MIPs) a partir dos z-stacks utilizando o software do microscópio ou o Fiji/ImageJ.
      3. Aplique um limiar de intensidade para segmentar a rede vascular positiva para CD31, excluindo o sinal de fundo.
      4. Selecione Processar > Ruído > Remover Outliers e utilize um raio de 2–5 pixels para remover pequenos artefatos. Selecione Processar > Binário > Preencher Buracos para preencher pequenas lacunas dentro da rede vascular.
      5. Selecione Analisar > Definir medições e habilite Área e Fração de área. Selecione Analisar > Medir para determinar a área vascular.
      6. Calcule a área vascular positiva para CD31 como porcentagem da área total do organoide.
      7. Analise pelo menos três organoides por lote provenientes de três lotes independentes. Exporte as medições para análise estatística.
    4. Quantificação da cobertura de pericitos positivos para PDGFR-β
      1. Adquira imagens em z-stack confocal de organoides completos no Dia 15 corados para CD31 e PDGFR-β. Gere MIPs a partir dos z-stacks.
      2. Importe as MIPs de CD31 e PDGFR-β para o Fiji/ImageJ e verifique o alinhamento das imagens.
      3. Defina o limiar no canal CD31 para gerar uma máscara binária que defina a rede vascular.
      4. Defina o limiar no canal PDGFR-β utilizando a mesma abordagem de segmentação para gerar uma máscara binária do sinal de pericitos.
      5. Selecione Processar > Calculadora de Imagens e aplique a operação E às máscaras de CD31 e PDGFR-β para identificar pixels sobrepostos.
      6. Meça a área do sinal sobreposto.
      7. Calcule a cobertura de pericitos como (área positiva para PDGFR-β dentro dos vasos positivos para CD31/área vascular total positiva para CD31) × 100%.
      8. Analise pelo menos três organoides por lote provenientes de três lotes independentes. Exporte as medições para análise estatística.
    5. Análise do índice de ramificação utilizando o AngioTool
      1. Adquira imagens em z-stack confocal de organoides completos no Dia 15 corados para CD31. Gere MIPs a partir dos z-stacks.
      2. Inicie o AngioTool e carregue a imagem MIP.
      3. Defina o diâmetro dos vasos de acordo com o diâmetro típico observado nas imagens.
      4. Ajuste o limiar de intensidade para segmentar a rede vascular, excluindo o sinal de fundo. Defina o tamanho mínimo do vaso para excluir pequenos artefatos.
      5. Execute a análise e registre a área vascular, densidade vascular, comprimento total dos vasos, número de junções e índice de ramificação.
      6. Verifique a imagem de saída confirmando que a vasculatura está delineada em amarelo, o esqueleto vascular é exibido em vermelho e os pontos de ramificação são marcados com pontos azuis.
      7. Exporte os resultados quantitativos do AngioTool.
      8. Analise pelo menos três campos de visão por lote provenientes de três lotes independentes e compile os dados para análise estatística.

6. Análise de PCR quantitativa em tempo real de organoides vasculares

OBSERVAÇÃO: Realize todos os procedimentos de isolamento de RNA e procedimentos subsequentes em condições livres de RNase.

  1. Extração de RNA
    1. Coletar 5–10 organoides vasculares maduros do Dia 15 em um tubo microcentrífugo de 1,5 mL livre de RNase. Remover completamente o meio residual.
      NOTA: Agrupar múltiplos organoides quando necessário para obter quantidade suficiente de RNA.
    2. Adicionar 350 µL de tampão de lise suplementado com 1% de β-mercaptoetanol.
    3. Pipetar as amostras 10–15 vezes até que os organoides estejam completamente lisados.
    4. Transferir o lisado para uma coluna de centrifugação para eliminação de DNA genômico posicionada em um tubo de coleta. Centrifugar a 11.000 × g durante 30 s à temperatura ambiente.
    5. Descartar a coluna e manter o fluxo passante.
    6. Adicionar volume igual de etanol 70%, aproximadamente 350 µL, ao fluxo passante e misturar completamente por pipetagem.
    7. Transferir até 700 µL da mistura para uma coluna de RNA posicionada em um tubo de coleta. Centrifugar a 11.000 × g durante 30 s e descartar o fluxo passante.
    8. Adicionar 350 µL do tampão de lavagem 1 à coluna. Centrifugar a 11.000 × g durante 30 s e descartar o fluxo passante.
    9. Preparar a mistura de DNase I combinando 10 µL de DNase I com 70 µL de tampão de digestão de DNase por amostra.
    10. Adicionar 80 µL da mistura de DNase I diretamente à membrana da coluna e incubar à temperatura ambiente por 15 min.
    11. Adicionar 350 µL do tampão de lavagem 1 à coluna. Centrifugar a 11.000 × g durante 30 s e descartar o fluxo passante.
    12. Adicionar 500 µL do tampão de lavagem 2 à coluna. Centrifugar a 11.000 × g durante 30 s e descartar o fluxo passante.
    13. Repetir a lavagem com 500 µL do tampão de lavagem 2.
    14. Centrifugar a coluna vazia a 11.000 × g durante 2 min para secar a membrana.
    15. Transferir a coluna para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mL livre de RNase. Adicionar 30–50 µL de água livre de RNase diretamente à membrana e incubar à temperatura ambiente por 1 min.
    16. Centrifugar a 11.000 × g durante 1 min para eluir o RNA. Armazenar o RNA a −80 °C até o uso.
      NOTA: Avaliar a concentração e pureza do RNA por espectrofotometria. Utilizar uma razão A260/A280 entre 1,8 e 2,1 como faixa aceitável.
  2. Síntese de cDNA
    1. Preparar a mistura de reação de transcrição reversa em gelo.
    2. Combinar 600 ng de RNA total com 4 µL do mix mestre de RT contendo transcriptase reversa, tampão, dNTPs e primers aleatórios. Adicionar água livre de RNase até um volume final de 20 µL.
    3. Incubar a reação a 37 °C por 15 min, seguido de 85 °C por 5 s.
    4. Armazenar o cDNA resultante a −20 °C até o uso.
  3. PCR quantitativa em tempo real
    1. Preparar 9 µL do mix mestre de qPCR por reação combinando 5 µL do mix mestre 2× SYBR Green, 3 µL de água livre de RNase e 1 µL de primers direto e reverso pré-misturados a 10 µM cada.
    2. Distribuir 9 µL do mix mestre em cada poço de uma placa de qPCR de 96 poços.
    3. Adicionar 1 µL de cDNA a cada poço para obter um volume final de reação de 10 µL.
    4. Selar a placa com filme adesivo óptico e centrifugar a 1.000 × g por 1 min.
    5. Realizar a desnaturação inicial a 95 °C por 30 s.
    6. Realizar 40 ciclos de amplificação de 95 °C por 5 s seguidos de 60 °C por 30 s.
    7. Realizar análise de curva de dissociação para confirmar a especificidade do amplicon.
      NOTA: Executar cada amostra em duplicata ou triplicata.
    8. Calcular a expressão relativa do gene-alvo utilizando o método 2−ΔΔCt. Normalizar os valores de Ct ao gene de referência (por exemplo, GAPDH) e calibrar a expressão em relação às amostras de hiPSCs indiferenciadas.

7. Análise estatística

  1. Apresente dados quantitativos como média ± desvio padrão (DP) de pelo menos três réplicas biológicas independentes (n ≥ 3) por condição.
  2. Considere cada lote independente como uma réplica biológica para medições de diâmetro de agregados e organoides, e calcule a média dos 30 estruturas individuais medidos dentro de cada lote para obter uma média única por lote.
  3. Calcule a média das medições de área vascular, cobertura de pericitos e índice de ramificação de múltiplos organoides ou campos dentro de cada lote para obter um único valor por lote, e utilize esses valores por lote para comparações estatísticas.
  4. Compare o protocolo otimizado com o protocolo original de Wimmer utilizando um teste t de Student não pareado bicaudal.
  5. Defina significância estatística como p < 0,05. Indique os níveis de significância como p < 0,05, p < 0,01 e p < 0,001, conforme aplicável.
  6. Realize todas as análises estatísticas utilizando o software de análise estatística versão 10.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

O protocolo otimizado descrito aqui permite a geração de organoides vasculares maduros a partir de hiPSCs em aproximadamente 15 dias, utilizando uma estratégia de diferenciação em etapas (Figura 1A). Resumidamente, agregados de hiPSCs foram gerados em placas com superfície não aderente suplementadas com 0,25% de PVA em agitador orbital (Dia −1). A indução de mesoderma foi iniciada no Dia 0 com CHIR99021 (12 µM) e BMP-4 (30 ng/mL) por 3 dias, seguida pela especificação da linhagem vascular co...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O protocolo otimizado descrito aqui introduz diversas melhorias-chave no sistema de diferenciação de organoides vasculares originalmente estabelecido por Wimmer et al.18, com o objetivo de aprimorar a homogeneidade, reprodutibilidade e integridade estrutural da geração de organoides vasculares. Em comparação com o protocolo original, o método otimizado apresenta melhorias significativas nos seguintes aspectos. Primeiro, a otimização das condições de formação de agregados melhora substancialmente a...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC) por meio do Fundo para Cientistas Jovens (C) (nº 32200655) e do Programa Geral (nº 32270847). Os autores também agradecem à Plataforma de Serviços Públicos da Universidade de Anhui pelo apoio prestado.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Filtro de frasco com tampa de 0,22 μmNalgeneFPE204030Para filtração estéril de meios e tampões
Tubo cônico de 15 mLSparkJadeGD0001Estéril
Tubo microcentrífugo de 2 mLEppendorf22363204Estéril
2-Mercaptoetanol (1000×)Gibco21985023Utilizar em capela de exaustão
Alexa Fluor 488 AffiniPure F2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)LableadY1104Anticorpo secundário; diluir 1:300
Alexa Fluor 594 AffiniPure F(ab′)2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)LableadY1007Anticorpo secundário; diluir 1:300
Anticorpo anti-CD31Cell Signaling3528sAnticorpo primário; diluir 1:100 em tampão de bloqueio
Anticorpo anti PDGFR βZenbio347269Anticorpo primário; diluir 1:100 em tampão de bloqueio
Contador Automatizado de CélulasLife TechnologiesCountess™ IIInclui lâminas com câmara de contagem
Suplemento B27 (50×)Gibco17504044Para meio N2B27; descongelar a 4ºC, fracionar e armazenar a −20ºC, evitar ciclos de congelamento-descongelamento
Centrífuga de bancadaZonkiaSC-3610Com rotor de balde oscilante
Capa de Segurança Biológica (Classe II)Thermo FisherNANA
BMP4ProteintechHZ-1045Reconstituir em ddH2O estéril até 100 ng/μL, fracionar e armazenar a −20 °C
Albumina Sérica Bovina (BSA)Biosharp9048-46-8Para tampão de bloqueio
CHIR99021MCEHY-10182Preparar estoque de 10 mM em DMSO, armazenar a −20ºC por até 1 ano
Incubadora de CO2Fisher ScientificLS-CO15037 ºC, 5% CO2, umidificada
Placa para Imagem ConfocalBiosharpBS-20-GJMPara imagem após coloração
Microscópio ConfocalLEICANAEquipado com objetivas de 10×, 20×, 63× e software ZEN
DMEMVivacellC3113-0500Para diluição de Matrigel e solução de colágeno I
DMEM/F-12, com Suplemento GlutaMAXGibco10565018Para diluição de Matrigel e meio N2B27
EDTA (0,5 M, pH 8,0)InvitrogenAM9260GDiluir com PBS até 0,02% para passagem
Soro Fetal Bovino (FBS)Gibco10270-106Para meio de diferenciação completo N2B27 (15% final)
FGF-2NovoproteinC046Preparar estoque de 1 mg/mL em PBS estéril, fracionar e armazenar a −20ºC
ForskolinaR&D Systems1099Preparar estoque de 10 mM em DMSO, armazenar a −20ºC
HEPES (1M)Gibco15630080Para solução de colágeno I
HoechstBeyotimeC1071S-4Preparar estoque de 1 mg/mL em água desionizada, fracionar e armazenar a −20ºC
Microscópio InvertidoLEICADMIL LEDObservação rotineira de células
Matrigel (com fatores de crescimento reduzidos)STEEMABM05Armazenar a −20ºC após fracionamento, evitar ciclos de congelamento-descongelamento; manipular em gelo
Solução de Aminoácidos Não Essenciais MEM (NEAA, 100×)Gibco11140035Para meio N2B27
Suplemento N2 (100×)Gibco17502048Para meio N2B27; armazenar a −20ºC protegido da luz
Meio NeurobasalGibco21103049Para meio N2B27
Água Livre de Nucleases (Livres de DNase/RNase)LableadDoo55WJPara preparação de RNA/cDNA e qPCR
Agitador OrbitalJoan LabNAPara etapas de lavagem
Paraformaldeído (solução a 4%)ServicebioG1101Diluir com PBS até 4% para fixação; usar em capela de exaustão
Penicilina-Estreptomicina (100×)Gibco15140122Para meio N2B27
Meio PGM1CellapyA1517001Meio de expansão de hiPSC; armazenar a 4ºC protegido da luz, estável por 2 semanas
Suplemento PGM1 (25×)CellapyA1517101Para uso com Meio Básico PGM1
Álcool Polivinílico (PVA)Sigma-AldrichP8136Dissolver no PGM1 a 0,25% (p/v) para promover agregação
PureCol (Colágeno Tipo I Bovino, 3 mg/mL)Advanced BioMatrix5005Para mistura de colágeno I-Matrigel; testar lote quanto à capacidade de polimerização
Ciclador Térmico para qPCRThermo FisherStepOnePlus™Com capacidade de curva de dissociação; para detecção de PCR em tempo real
Kit de Transcrição ReversaAccurate BiologyAG11706Para síntese de cDNA a partir de RNA total; contém mix mestre de RT com transcriptase reversa, tampão, dNTPs e primers aleatórios
Kit de Extração de RNAYeasen19221ES50Para isolamento de RNA total de organoides vasculares; inclui colunas de eliminação de DNA genômico e DNase I livre de RNase
Bicarbonato de Sódio (7,5%)Gibco25080094Para solução de colágeno I
Desoxicolato de SódioSigma-AldrichD6750Preparar solução a 1% (p/v) em água desionizada para tampão de bloqueio
Hidróxido de Sódio (1,0 N)Sigma-AldrichS2770Para ajuste de pH da solução de colágeno I
Pipetas Descartáveis Estéreis (10 mL)Bkmamlab110205007Individualmente embaladas, estéreis
Pontas de Pipeta Filtradas Estéreis (1000, 200, 20 μL)BiozymVT0270/VT0250/VT0220Estéreis, com filtro
Agulha Estéril (30 G)NANAPara dissecção de redes vasculares
Esátula Estéril (ponta redonda)Fisher Scientific21-401-5Aço inoxidável
SYBR Green Master MixAccurate BiologyAG11733Concentração 2× para qPCR; contém DNA polimerase com ativação térmica, tampão, dNTPs e corante SYBR Green
Placa de 12 poços tratada para cultura de tecidosBD Falcon353043Para incorporação em gel e cultura de rede vascular
Placa de 6 poços tratada para cultura de tecidosEppendorf30720113Tratamento padrão TC
Triton X-100Sigma-AldrichT9084Para tampão de bloqueio
Azul de Tripano (0,4%)Thermo Fisher15250061Para contagem celular
Tween 20Sigma-AldrichP7949Para solução de lavagem PBS-T a 0,05%
Placa de 6 poços com aderência ultra baixaCorning3471Para formação de agregados e diferenciação
Placa de 96 poços com fundo redondo e aderência ultra baixaBeyotimeFULA962-6pcsPara cultura em suspensão de organoides vasculares
VEGF-AProteintechHZ-1038Preparar estoque de 1 mg/mL em PBS estéril, fracionar e armazenar a −20ºC
Banho-mariaBlue pardHWS-2437ºC
Y-27632MCEHY-10071Preparar estoque de 10 mM em PBS estéril ou DMSO, armazenar a −20ºC; concentrações de trabalho: 5 μM (descongelamento), 50 μM (formação de agregados)

Referências

  1. Lancaster MA, Knoblich JA. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014;345:1247125.
  2. Clevers H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 2016;165:1586-1597.
  3. Spence JR, et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 2011;470:105-109.
  4. Lancaster MA, et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013;501:373-379.
  5. Quadrato G, et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 2017;545:48-53.
  6. Takasato M, et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 2015;526:564-568.
  7. Takebe T, et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 2013;499:481-484.
  8. Huch M, et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 2015;160:299-312.
  9. Nakano T, et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 2012;10:771-785.
  10. Mansour AA, et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 2018;36:432-441.
  11. Ham O, et al. Blood vessel formation in cerebral organoids formed from human embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2020;521:84-90.
  12. Sun XY, et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 2022;11:e76707.
  13. Grebenyuk S, Ranga A. Engineering organoid vascularization. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:39.
  14. Parikh M, Pierce GN. Considerations for choosing an optimal animal model of cardiovascular disease. Can J Physiol Pharmacol. 2024;102:75-85.
  15. Krug A, et al. Three-dimensional spheroid models for cardiovascular biology and pathology. Mechanobiol Med. 2025;3:100144.
  16. Carmeliet P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 2003;9:653-660.
  17. Wimmer RA, et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 2019;565:505-510.
  18. Wimmer RA, et al. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2019;14:3082-3100.
  19. Naderi-Meshkin H, et al. Vascular organoids: unveiling advantages, applications, challenges, and disease modelling strategies. Stem Cell Res Ther. 2023;14:292.
  20. Xu C, et al. Vascular organoid generation from human-induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 2024;214:e67125.
  21. Frenz-Wiessner S, et al. Generation of complex bone marrow organoids from human induced pluripotent stem cells. Nat Methods. 2024;21:868-881.
  22. Sun D, et al. Matrix viscoelasticity controls differentiation of human blood vessel organoids into arterioles and promotes neovascularization in myocardial infarction. Adv Mater. 2025;37:e2410802.
  23. Hoffmann A, et al. Animal-origin-free method for generating blood vessel organoids. Sci Rep. 2026;16:12096.
  24. Nikolova MT, et al. Fate and state transitions during human blood vessel organoid development. Cell. 2025;188:3329-3348.e31.
  25. Quintard C, et al. A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip. Nat Commun. 2024;15:1452.
  26. Sun L, Wang P, Lin X, Qiu Y. Microfluidic vascular organoids-on-chips: a promising platform for advancing plastic and reconstructive surgery. Chinese Journal of Plastic and Reconstructive Surgery. 2025.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Células-Tronco Pluripotentes HumanasGeração de OrganoidesFormação de Corpos EmbrioidesIndução do MesodermaEspecificação VascularRecrutamento de PericitosRedes EndoteliaisCaracterização por Imunofluorescência
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.