Artigo de investigação

Alvejando a Ferroptose e a Cuproptose na Colite Ulcerativa: Descobertas a partir de Bioinformática Abrangente e Validação Experimental

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DOI:

10.3791/73656

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25 de agosto de 2026

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1Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2The Third Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

Este estudo identifica cinco biomarcadores relacionados à cuproptose e ferroptose na colite ulcerativa por meio de aprendizado de máquina integrado, sequenciamento de RNA de única célula e validação experimental, fornecendo insights para o diagnóstico clínico e imunoterapia direcionada.

Resumo

A colite ulcerativa (CU) é uma doença intestinal persistente com patogênese parcialmente definida e taxas crescentes de prevalência e hospitalização em países recentemente industrializados. Na CU, a morte excessiva de células epiteliais intestinais rompe a barreira mucosa e desencadeia respostas inflamatórias. A ferroptose e a cuproptose são duas formas recentemente descritas de morte celular regulada. A maioria dos estudos sobre CU examinou esses processos separadamente; no entanto, seus papéis combinados na progressão da CU permanecem insuficientemente caracterizados. Para investigar seus papéis sinérgicos na patogênese da CU, utilizamos uma abordagem escalonada envolvendo perfis transcriptômicos em larga escala para identificar alvos candidatos, seguida por validação em modelos in vitro. Genes diferencialmente expressos (DEGs) foram cruzados com genes relacionados à ferroptose (FRGs) e genes relacionados à cuproptose (CRGs). Os alvos comuns foram priorizados utilizando um consenso de algoritmos de aprendizado de máquina e análise de rede de coexpressão gênica ponderada (WGCNA). Cinco biomarcadores—LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 e CD274—foram significativamente superexpressos na CU. A análise de célula única caracterizou sua expressão em diferentes tipos celulares, sendo LCN2 e NOS2 principalmente enriquecidos em células epiteliais. A relevância mecanicista desses marcadores foi posteriormente avaliada por meio de ensaios in vitro. O tratamento com inibidores de ferroptose ou cuproptose atenuou a inflamação associada à CU e modulou a expressão dos biomarcadores em modelos celulares Caco-2. Esses achados identificam cinco biomarcadores associados à progressão da CU e fornecem evidências experimentais que apoiam seu potencial uso no diagnóstico clínico e na intervenção terapêutica.

Introdução

A colite ulcerativa (CU) é uma doença inflamatória intestinal recorrente associada a uma carga global crescente e a custos substanciais de tratamento a longo prazo1,2. Embora aminossaliciatos, corticosteroides, terapias biológicas e medicamentos de pequenas moléculas tenham ampliado as opções de tratamento, a remissão duradoura permanece difícil de alcançar para muitos pacientes3,4. Essa necessidade clínica não atendida destaca a importância de identificar marcadores moleculares reprodutíveis e mecanismos acessíveis que possam apoiar o diagnóstico precoce e terapias guiadas por mecanismos5.

A ferroptose é uma forma dependente de ferro de morte celular regulada, impulsionada pela peroxidação lipídica, esgotamento de glutationa e atividade prejudicada da GPX46. Níveis elevados de ferro e malondialdeído na colite ulcerativa são compatíveis com lesão epitelial ferroptótica, enquanto a ativação experimental do eixo SLC7A11–GSH–GPX4 ou a inibição direta da ferroptose pode proteger a barreira intestinal7,8.

A cuproptose, descrita em 2022, é desencadeada quando o cobre se liga a proteínas mitocondriais lipoiladas, resultando no agregamento proteico e estresse proteotóxico9. Como o intestino desempenha um papel central no metabolismo do cobre, a interrupção dessa via pode amplificar as lesões epiteliais oxidativas e inflamatórias na colite ulcerativa10.

A ferroptose e a cuproptose podem convergir por meio do desequilíbrio de íons metálicos, do metabolismo mitocondrial, do esgotamento de glutationa e do estresse oxidativo11. No entanto, permanece sem solução se essa interação produz uma assinatura molecular reproduzível na colite ulcerativa e se tal assinatura responde à inibição específica da via.

A hipótese do estudo era que a interação desregulada entre ferroptose e cuproptose na colite ulcerativa converge para uma assinatura reprodutível de biomarcadores que pode ser priorizada em conjuntos de dados transcriptômicos em bulk e de célula única, além de ser atenuada pela inibição específica da via em um modelo de lesão do epitélio intestinal. Assim, bioinformática multicohorte, aprendizado de máquina, análise de célula única e experimentos direcionados em Caco-2 foram integrados para identificar e avaliar funcionalmente os biomarcadores candidatos (Figura 1).

Diagrama de design integrado do estudo; descoberta transcriptômica, avaliação de biomarcadores, validação experimental.
Figura 1: Fluxo de trabalho do estudo. Fluxo de trabalho integrado para triagem transcriptômica multicohorte, priorização de biomarcadores baseada em aprendizado de máquina e redes, localização em célula única e validação baseada em inibidores em células Caco-2. RC: retocolite ulcerosa; GEO: Gene Expression Omnibus; WGCNA: análise de rede de coexpressão gênica ponderada; PPI: interação proteína-proteína; ROC: característica de operação do receptor; GSEA: análise de enriquecimento de conjunto de genes. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Protocolo

Este estudo utilizou conjuntos de dados de acesso público e linhagens celulares humanas comercialmente disponíveis. Nenhum participante humano, tecido humano recém-coletado ou animais vertebrados foram envolvidos; portanto, não foi necessária a aprovação do comitê de ética institucional. As ferramentas de pesquisa, softwares e recursos on-line utilizados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Processamento de dados para análise de expressão diferencial

Para estabelecer as coortes de descoberta e validação transcriptômicas, o banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) foi pesquisado utilizando o termo “colite ulcerativa”. Quatro conjuntos de dados — GSE87466, GSE92415, GSE107499 e GSE75214 — foram utilizados como conjunto de treinamento, enquanto GSE47908 foi reservado para validação externa. Os conjuntos de dados de treinamento foram normalizados e corrigidos quanto a lotes utilizando o ComBat no Sangerbox 3.0, enquanto o conjunto de dados de validação foi processado de forma independente.

Um total de 583 genes relacionados à ferroptose (FRGs) foi obtido do FerrDB e complementado com genes relatados na literatura para reduzir o viés de fonte única12. Um conjunto de 96 genes relacionados à cuproptose (CRGs) foi compilado a partir de estudos publicados12,13,14. A expressão diferencial foi analisada usando o limma com limiares de |log₂ razão de variação| > 1 e P ajustado por Benjamini–Hochberg < 0,05. Gráficos diagnósticos de normalização, correção de lote, expressão diferencial e agrupamento estão disponíveis na Figura Suplementar 1. A composição das amostras, plataformas e atribuições das coortes estão descritas na Tabela Suplementar 1.

2. Identificação de DEGs associados à FC na RC

Foi realizada uma análise de correlação de Pearson utilizando limiares de |r| > 0,5 e P < 0,05 para identificar FRGs e CRGs coexpressos. O conjunto de genes resultante foi intersectado com os genes diferencialmente expressos (DEGs) para identificar genes diferencialmente expressos coexpressos de cuproptose–ferroptose (CF-DEGs).

3. Análise de enriquecimento

Análises de enriquecimento de Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) foram realizadas utilizando o clusterProfiler e a plataforma Bioinformatics.com.cn. Um valor de P ajustado por Benjamini–Hochberg < 0,05 foi utilizado como limiar de significância. Os gráficos de enriquecimento estão disponíveis na Figura Suplementar 2.

4. Análise de rede de coexpressão gênica ponderada (WGCNA)

A estrutura modular subjacente aos perfis de expressão gênica foi analisada utilizando a análise de rede de coexpressão gênica ponderada (WGCNA). Amostras anormais foram identificadas e excluídas por meio de agrupamento hierárquico combinado à função goodSamplesGenes. Um parâmetro de limiarização suave adequado (β) foi posteriormente determinado para atender ao critério de topologia livre de escala na construção da rede.

Os dados de expressão processados foram utilizados para construir uma matriz de sobreposição topológica (TOM) para análise de coexpressão gênica. Utilizando a abordagem de corte dinâmico de árvores, genes com padrões de expressão altamente consistentes foram organizados em módulos gênicos, cada um contendo pelo menos 100 genes. As associações entre eigengenes dos módulos (MEs) e fenótipos foram analisadas para identificar módulos associados ao processo da doença e extrair os conjuntos gênicos correspondentes. Os diagnósticos de triagem do WGCNA estão apresentados na Figura Suplementar 3.

5. Seleção de biomarcadores

Para priorizar candidatos para acompanhamento experimental, três algoritmos de aprendizado de máquina foram aplicados em paralelo¹⁵. A regressão por seleção e redução absoluta mínima (LASSO) foi utilizada para seleção de características, a floresta aleatória com ntree = 500 foi usada para classificar a importância dos genes, e a máquina de vetores de suporte com eliminação recursiva de características (SVM-RFE) foi empregada para identificar o subconjunto de características com o menor erro de validação cruzada. Os diagnósticos completos do triagem estão apresentados na Figura Suplementar 5.

A importância dos genes foi avaliada de acordo com a contribuição individual de cada gene para a precisão da classificação, e os genes com classificação mais alta foram reunidos para gerar um conjunto preliminar de genes¹⁶. O algoritmo SVM-RFE realizou a seleção de características e a otimização do modelo por meio da eliminação iterativa de características, permitindo a identificação do subconjunto ideal de características para classificação¹⁷. Os genes comuns aos três algoritmos foram considerados biomarcadores candidatos identificados por meio de aprendizado de máquina.

Os DEGs associados à CF foram utilizados para construir uma rede de interação proteína-proteína (PPI), e o CytoHubba foi empregado para classificar os nós centrais. A intersecção dos principais módulos do WGCNA, das três saídas do aprendizado de máquina e do conjunto central da PPI definiu cinco biomarcadores candidatos integrados: LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 e CD274. Esses genes foram classificados como candidatos diagnósticos associados à RC. Experimentos subsequentes com inibidores classificaram ainda LCN2, IDO1, CXCL2 e NOS2 como marcadores responsivos à inibição da ferroptose e CD274 como marcador responsivo à inibição da cuproptose. Esses genes não foram considerados reguladores upstream comprovados de nenhuma das vias.

6. Desenvolvimento do modelo preditivo e avaliação multímétodo

Para avaliar o potencial clínico-translacional da assinatura gênica identificada, foi construído um nomograma utilizando o pacote rms para avaliar o desempenho diagnóstico. O desempenho do modelo foi avaliado por meio de uma curva de calibração, o teste de Hosmer–Lemeshow (HL) e o índice de concordância de Harrell (índice C).

A calibração do modelo foi avaliada utilizando o teste de HL e o erro absoluto médio (EAM). Um valor de P > 0,05 e um EAM < 0,1 foram estabelecidos como limiares para adequação e precisão aceitáveis do modelo, respectivamente. Curvas características de operação do receptor (ROC) foram geradas, e a área sob a curva (AUC) foi calculada para avaliar o desempenho preditivo do nomograma para colite ulcerativa (UC). Um conjunto de dados independente foi utilizado para avaliar a generalização e estabilidade do modelo.

7. Análise de enriquecimento de conjuntos de genes (GSEA)

No conjunto de treinamento, foi realizada uma análise de correlação de Spearman entre cada biomarcador e todos os demais genes. Os resultados de correlação foram ordenados para gerar um conjunto de genes classificados. A análise de enriquecimento de conjuntos de genes (GSEA) foi realizada utilizando o conjunto de genes c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs.symbols da Base de Dados de Assinaturas Moleculares (MSigDB) como referência. As vias biológicas com P < 0,05 foram consideradas significativamente enriquecidas.

8. Análise da paisagem imunológica

A ferramenta CIBERSORT e a matriz de assinatura LM22 foram utilizadas para realizar a análise de desconvolução dos dados de expressão e estimar as proporções de 22 subtipos de células imunes. Em seguida, foi realizada uma análise de correlação de Spearman para avaliar as associações entre os cinco biomarcadores e os subtipos de células imunes.

9. Análise da rede regulatória

As informações sobre a regulação de fatores de transcrição (TF) e microRNAs (miRNAs) relacionados a genes foram obtidas a partir dos bancos de dados integrados ChEA3 e TarBase 9.0 por meio da plataforma NetworkAnalyst. Os miRNAs associados a pelo menos dois nós foram incluídos na rede regulatória.

10. RNA-seq de única célula

Os conjuntos de dados de células únicas de UC GSE116222, compreendendo três amostras saudáveis e três amostras de UC, e GSE214695, compreendendo seis amostras saudáveis e seis amostras de UC, foram integrados. As células foram mantidas quando continham entre 200 e 5.000 genes detectados, >1.000 identificadores moleculares únicos, < 30% dos transcritos mitocondriais, < 3% dos transcritos de hemoglobina, e < 50% dos transcritos ribossômicos. A função NormalizeData foi utilizada para normalização, e o Harmony foi utilizado para correção de lote antes do agrupamento e anotação.

Após a filtragem, os dados foram normalizados utilizando a função NormalizeData. O Harmony foi utilizado para minimizar os efeitos de lote entre as amostras. A aproximação uniforme de variedades e projeção (UMAP) e o t-SNE (t-distributed stochastic neighbor embedding) foram usados para redução de dimensionalidade e agrupamento celular, a fim de caracterizar as estruturas locais e globais dentro da população celular. Um total de 31.712 células de alta qualidade foi mantido para análises adicionais. Os tipos celulares foram anotados de acordo com genes marcadores canônicos das células.

A análise de pseudotempo foi realizada utilizando o Monocle 2 para investigar alterações nos estados das células epiteliais e mieloides de tecidos com DC. As trajetórias de desenvolvimento celular e as diferenças entre grupos foram avaliadas, e os padrões de expressão de biomarcadores ao longo da trajetória de pseudotempo foram visualizados.

O CellChat foi utilizado para avaliar a comunicação célula-célula entre subpopulações de células epiteliais e mieloides. Padrões de expressão específicos de subpopulações foram integrados para inferir probabilidades de interação e vias de sinalização-chave entre células epiteliais e mieloides e para caracterizar suas potenciais redes regulatórias intercelulares.

11. Experimentos com células

Células humanas de adenocarcinoma de cólon Caco-2 foram cultivadas em meio Eagle modificado de Dulbecco contendo 10% de soro bovino fetal, 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina a 37 °C em 5% de CO₂. As células Caco-2 foram selecionadas como um modelo reprodutível de monocamada epitelial para ensaios de barreira intestinal e de lesão inflamatória; no entanto, sua origem maligna limita a generalização direta ao epitélio colônico não maligno. As informações sobre a passagem celular não estavam disponíveis nos registros experimentais arquivados.

Um modelo in vitro de inflamação e lesão foi estabelecido mediante exposição das células a 1 µg/mL de lipopolissacarídeo (LPS) durante 24 h. As células foram alocadas em um grupo controle com veículo de dimetilsulfóxido, um grupo somente com LPS, um grupo com LPS + 4 µM de ferrostatina-1 ou um grupo com LPS + 40 µM de tetratiomolibdato, com concentrações finais de solvente equivalentes. O grupo somente com LPS serviu como controle positivo de lesão/modelo para as comparações de resgate com inibidores.

  1. Viabilidade celular
    A viabilidade celular foi avaliada utilizando um ensaio de viabilidade celular de acordo com as instruções do fabricante. Após incubação a 37 °C por aproximadamente 2 h, a absorbância em 450 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas.
  2. Medição dos níveis de MDA e Fe²⁺
    Os níveis intracelulares de malondialdeído (MDA) e Fe2⁺ foram medidos utilizando os kits de ensaio correspondentes, de acordo com as instruções dos fabricantes. A proteína total foi quantificada utilizando um ensaio de ácido bicinconínico, e cada resultado foi normalizado em relação ao conteúdo proteico da amostra correspondente.
  3. Ensaio com sonda fluorescente para íons cobre
    Após a remoção do meio de cultura, uma sonda fluorescente específica para Cu2⁺ foi adicionada numa concentração final de 1 µM e incubada por 30 min a 37 °C. As imagens foram adquiridas imediatamente, sem lavagem, utilizando um microscópio de fluorescência invertido com comprimentos de onda de excitação e emissão de 510 e 578 nm, respectivamente. As configurações de aquisição foram mantidas constantes entre os grupos, e a barra de escala da imagem foi calibrada em 50 µm.
  4. RT-qPCR
    O RNA total foi isolado utilizando um reagente de extração de RNA baseado em fenol–guanidínio. O DNA complementar foi sintetizado a partir de 1 µg de RNA utilizando um kit de síntese de primeira fita de DNA complementar, e reagentes baseados em SYBR Green foram utilizados para PCR em tempo real. Cada reação foi realizada em triplicata técnica. As sequências dos iniciadores estão indicadas na Supplementary Table 2, e a abundância relativa de RNA mensageiro foi calculada utilizando o método 2⁻ΔΔCt.

12. Análise estatística

A normalidade e a homogeneidade da variância foram avaliadas utilizando os testes de Shapiro–Wilk e de Levene centrado na mediana, respectivamente. Os dados que atendiam a ambas as suposições foram analisados usando um teste t não pareado bicaudal ou uma análise de variância de um fator seguida pelo teste de diferença significativa honesta de Tukey. Quando qualquer uma das suposições não foi atendida, utilizou-se o teste t de Welch ou a análise de variância de Welch seguida pelas comparações de Games–Howell.

Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão. As contagens reais de réplicas biológicas, os valores P exatos bicaudais e as verificações de pressupostos são relatados na Tabela Suplementar 3. A planilha-fonte arquivada da Figura 13 contém menos réplicas controle para os painéis A (n = 4), C (n = 4) e F (n = 2), enquanto todas as outras combinações de painel/grupo contêm n = 6.

As análises computacionais foram realizadas utilizando R e os fluxos de trabalho limma, WGCNA, clusterProfiler, glmnet, randomForest, e1071, pROC, rms, Seurat v4, Harmony, Monocle 2, CellChat e Cytoscape/CytoHubba. Os recursos online incluíram FerrDB, GEO, STRING, ChEA3, TarBase 9.0, NetworkAnalyst, CIBERSORT/LM22, MSigDB, Bioinformatics.com.cn e Sangerbox 3.0.

Resultados

Identificação e anotação funcional de genes coexpressos em cuproptose e ferroptose

Quatro conjuntos de dados de treinamento, compreendendo 421 amostras de UC e 97 controles saudáveis, foram integrados. Um total de 551 genes diferencialmente expressos, incluindo 362 genes superexpressos e 189 genes subexpressos, foram identificados. A análise de correlação gerou 444 genes correlacionados à ferroptose–cuproptose, e a interseção com os genes diferencialmente expressos resultou em 32 genes diferencialmente expressos coexpressos à cuproptose–ferroptose (CF-DEGs).

Os 32 CF-DEGs foram enriquecidos em respostas a lesões, íons cobre, transporte de ácidos graxos, lipopolissacarídeo, doença inflamatória intestinal, sinalização NF-κB, sinalização TNF e ferroptose (Supplementary Table 4).

Priorização de biomarcadores centrais por meio de aprendizado de máquina integrado e WGCNA

A análise de rede de coexpressão gênica ponderada (WGCNA) identificou MEpurple, MEbrown e MEblack como os módulos mais fortemente associados à DC. Juntos, os módulos selecionados continham 1.426 genes (Supplementary Table 5).

O operador de seleção e redução por mínimos absolutos (LASSO), a máquina de vetores de suporte com eliminação recursiva de características (SVM-RFE) e a floresta aleatória selecionaram 21, 32 e 19 características, respectivamente. Treze genes foram compartilhados pelos três modelos. A integração do consenso de aprendizado de máquina, do núcleo de interação proteína-proteína classificado pelo CytoHubba e dos módulos WGCNA selecionados resultou em cinco biomarcadores candidatos associados à colite ulcerativa: LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 e CD274.

Avaliação diagnóstica e enriquecimento de vias da assinatura de biomarcadores

Todos os cinco biomarcadores candidatos foram positivamente correlacionados e regulados para cima na DC na coorte de treinamento (Figura 2A, B). Cada marcador alcançou uma área sob a curva característica de operação do receptor > 0,80 na coorte de treinamento e > 0,75 na coorte de validação independente GSE47908 (Figura 2C–E).

O nômograma de cinco genes apresentou boa calibração, com um valor de P de Hosmer–Lemeshow > 0,05 e erro médio absoluto < 0,1, além de boa discriminação na coorte analisada, com uma área sob a curva e índice de concordância de 0,945 e um intervalo de confiança de 95% para o índice de concordância de 0,922–0,968 (Figura 3).

A análise de enriquecimento de conjuntos de genes associou os cinco candidatos às vias de sinalização JAK–STAT, interferon–RIPK1/3 e receptor tipo Toll–NF-κB (Figura 4).

Gráficos de análise de expressão gênica; gráficos de setores, curvas ROC e gráficos de caixa para comparação entre RC e saudáveis.
Figura 2: Expressão dos biomarcadores candidatos e desempenho diagnóstico. (A) Mapa de calor de correlação. (B, C) Expressão dos biomarcadores e curvas de característica operacional do receptor na coorte de treinamento. (D, E) Expressão dos biomarcadores e curvas de característica operacional do receptor na coorte de validação GSE47908. ROC: característica operacional do receptor; AUC: área sob a curva; UC: colite ulcerativa. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Diagrama de nomograma, curva de calibração e análise ROC para avaliação do modelo preditivo.
Figura 3: Desenvolvimento e avaliação do nomograma para colite ulcerativa. (A) Nomograma de cinco genes. (B) Gráfico de calibração. (C) Curva característica de operação do receptor. ROC: característica de operação do receptor; UC: colite ulcerativa; AUC: área sob a curva; C-index: índice de concordância. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráficos de análise de enriquecimento de conjuntos de genes; posições vs. escores de enriquecimento; conjuntos de dados comparativos.
Figura 4: Análise de enriquecimento de conjuntos de genes dos cinco biomarcadores candidatos. (A–E) Resultados da análise de enriquecimento de conjuntos de genes para LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 e CD274, respectivamente. GSEA: análise de enriquecimento de conjuntos de genes. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Análise da paisagem do microambiente imune e da rede regulatória

As amostras de RC mostraram proporções aumentadas de neutrófilos, linfócitos T CD4⁺ de memória ativados, macrófagos M1 e mastócitos ativados, com diminuições recíprocas em macrófagos M2, mastócitos em repouso e células dendríticas em repouso. Esses padrões foram reproduzidos na coorte de validação (Figura 5A–E).

Os cinco candidatos apresentaram correlação positiva com neutrófilos, linfócitos T CD4⁺ de memória ativados e macrófagos M1, e correlação inversa com mastócitos em repouso e macrófagos M2 (Figura 5F–J). A rede gênica de miRNA continha 98 nós e 146 arestas. hsa-miR-34a-5p e hsa-miR-16-5p apresentaram a maior conectividade como biomarcadores, enquanto AR e RELA foram os fatores de transcrição mais conectados (Figura 6).

Composição de células imunes e mapas de calor de correlação; gráficos de análise visualizando dados de expressão gênica.
Figura 5: Análise de infiltração imune. (A) Composição de células imunes. (B) Diferenças entre grupos nas proporções de células imunes. (C) Mapa de calor de correlação entre células imunes. (D, E) Infiltração de células imunes nas coortes de treinamento e validação. (F–J) Correlações entre biomarcadores candidatos e populações de células imunes. UC: colite ulcerativa. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Diagrama de interação de rede gênica; destaca a análise de interações proteicas e vias regulatórias.
Figura 6: Redes preditas de microRNA e fatores de transcrição. (A) Rede gene–microRNA. Círculos indicam biomarcadores candidatos e quadrados indicam microRNAs. (B) Rede fator de transcrição–gene. Losangos indicam biomarcadores candidatos e triângulos invertidos indicam fatores de transcrição. microRNA: microRNA; TF: fator de transcrição. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Dinâmica de expressão espaciotemporal em resolução de única célula

Após o controle de qualidade, 31.712 células formaram 22 agrupamentos que foram anotados como nove populações celulares principais (Figura 7A–C). As proporções de células epiteliais e plasmáticas foram maiores na colite ulcerativa (UC). LCN2 e NOS2 estavam enriquecidos nas células epiteliais, enquanto IDO1, CXCL2 e CD274 estavam enriquecidos nas células mieloides (Figura 7D–G).

A subagrupamento de células epiteliais identificou 11 subconjuntos, com expansão de colonócitos inflamatórios e enriquecimento de LCN2 e NOS2 nesse subconjunto (Figura 8). O subagrupamento de células mieloides identificou sete subconjuntos, com aumento de monócitos, redução de macrófagos e enriquecimento de IDO1, CXCL2 e CD274 nos monócitos (Figura 9).

Os colonócitos inflamatórios acumularam-se tardiamente na trajetória epitelial, com aumento da expressão de LCN2 e NOS2 (Figura 10). Os monócitos exibiram uma trajetória distinta associada à RC, com expressão dinâmica de IDO1, CXCL2 e CD274 (Figura 11).

Os colonócitos inflamatórios apresentaram a sinalização de saída mais intensa e uma comunicação proeminente com monócitos. O par ligante–receptor APP–CD74 foi o principal entre esses subconjuntos (Figura 12).

Diagrama de agrupamento UMAP e gráfico de pontos mostrando a distribuição de tipos celulares e expressão gênica nas amostras.
Figura 7: Expressão de biomarcadores candidatos entre populações celulares. (A) Agrupamentos celulares. (B) Marcadores de anotação. (C) Nove populações celulares anotadas. (D, E) Distribuições e proporções celulares em amostras saudáveis e de colite ulcerativa. (F, G) Expressão de biomarcadores candidatos visualizada por UMAP e gráfico de bolhas. UC: colite ulcerativa; UMAP: uniform manifold approximation and projection. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Agrupamento e análise de tipos de células epiteliais por t-SNE; gráfico e mapa de calor exibindo padrões de dados.
Figura 8: Subagrupamento de células epiteliais e expressão de candidatos. (A) Agrupamentos iniciais de células epiteliais. (B) Marcadores de anotação. (C) Subconjuntos de células epiteliais anotados. (D) Proporções dos subconjuntos em amostras saudáveis e de colite ulcerativa. (E) Expressão de LCN2 e NOS2 nos subconjuntos de células epiteliais. t-SNE: incorporação estocástica de vizinhos com distribuição t; UC: colite ulcerativa. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Análise de agrupamento t-SNE e gráfico de barras de agrupamentos mieloides; expressão imune; sequenciamento de RNA de célula única.
Figura 9: Subagrupamento de células mieloides e expressão de candidatos. (A) Agrupamentos iniciais de células mieloides. (B) Marcadores de anotação. (C) Subconjuntos de células mieloides anotados. (D) Proporções de subconjuntos em amostras saudáveis e de DC. (E) Expressão de IDO1, CXCL2 e CD274 nos subconjuntos de células mieloides. t-SNE: incorporação estocástica de vizinhos com distribuição t; DC: colite ulcerativa. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Resultados de redução de dimensionalidade e agrupamento, mostrando gráficos de mapeamento de componentes e análise de pseudotempo.
Figura 10: Análise de pseudotempo em células epiteliais. (A) Trajetória de pseudotempo e atribuições de estado. (B) Distribuição de células epiteliais saudáveis e de colite ulcerativa ao longo da trajetória. (C) Dinâmica de expressão de LCN2 e NOS2 ao longo do pseudotempo. UC: colite ulcerativa. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráfico de ajuste espectral; análise de dados das relações entre componentes; resultados do ajuste da análise global.
Figura 11: Análise de pseudotempo de células mieloides. (A) Trajetória de pseudotempo e atribuições de estado. (B) Distribuição de células mieloides saudáveis e de colite ulcerativa ao longo da trajetória. (C) Dinâmica de expressão de IDO1, CXCL2 e CD274 ao longo do pseudotempo. UC: colite ulcerativa. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Redes de interação proteica e intensidade da interação; resultados dos dados em gráficos de dispersão e mapas de calor.
Figura 12: Comunicação epitelial–mieloide. (A) Número e intensidade de interações. (B) Intensidades de sinalização de saída e de entrada. (C) Interações envolvendo colonócitos inflamatórios. (D) Mapa de calor da intensidade da comunicação. (E) Pares ligante–receptor envolvendo colonócitos inflamatórios. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

in vitro validação experimental de intervenções na ferroptose e cuproptose

A exposição ao lipopolissacarídeo (LPS) reduziu a viabilidade das células Caco-2 e aumentou a expressão de IL-6 e IL-1β em relação ao controle com veículo (Figura 13A–C e Figura Suplementar 5).

O LPS aumentou os níveis de Fe2⁺, malondialdeído e a abundância de RNA mensageiro de LCN2, IDO1, CXCL2 e NOS2, enquanto o ferrostatina-1 reverteu cada alteração associada ao LPS (Figura 13D–I). Para as comparações entre LPS e LPS + ferrostatina-1, os valores exatos de P bicaudais variaram de 9,45 × 10⁻5 a 0,0027 após a média das réplicas técnicas dentro de cada réplica biológica.

O LPS reduziu a viabilidade e aumentou a IL-6, IL-1β, FDX1/DLAT, CD274 e a fluorescência sensível ao cobre, enquanto a tetratiomolibdata reverteu essas alterações (Figura 14 A–E). Para as comparações entre LPS e LPS + tetratiomolibdata, os valores P exatos bicaudais variaram de < 1 × 10⁻15 a 0,0008.

Em conjunto, as análises identificaram cinco candidatos diagnósticos associados à colite ulcerativa, localizaram sua expressão em populações epiteliais e mieloides e mostraram que LCN2, IDO1, CXCL2 e NOS2 responderam à inibição da ferroptose, enquanto CD274 respondeu à quelacão de cobre em células Caco-2.

Diagramas de viabilidade celular e expressão de mRNA comparando os tratamentos controle, LPS e LPS+Fer.
Figura 13: O ferrostatina-1 atenua alterações associadas ao LPS relacionadas à inflamação e à ferroptose em células Caco-2. (A) Viabilidade celular. (B, C) Expressão de RNA mensageiro de IL-6 e IL-1β. (D, E) Níveis intracelulares de malondialdeído e Fe2⁺. (F–I) Expressão de RNA mensageiro de LCN2, IDO1, CXCL2 e NOS2. As réplicas técnicas em triplicata foram médias dentro de cada réplica biológica independente; as barras de erro indicam o desvio padrão. Os números disponíveis de réplicas biológicas foram: Controle n = 4 em A e C, Controle n = 2 em F, e n = 6 para todas as outras combinações de painel/grupo. Os valores exatos de P bicaudais e as verificações de pressupostos estão relatados na Tabela Suplementar 5. Fer-1: ferrostatina-1; LPS: lipopolissacarídeo; MDA: malondialdeído. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Gráficos de barras de viabilidade celular e expressão de mRNA; microscopia mostrando a distribuição da sonda de cobre.
Figura 14: O tetratiomolibdato atenua alterações inflamatórias e relacionadas à cuproptose associadas ao LPS em células Caco-2. (A) Viabilidade celular. (B, C) Expressão de RNA mensageiro de IL-6 e IL-1β. (D) Expressão de RNA mensageiro de FDX1 e DLAT. (E) Expressão de RNA mensageiro de CD274. (F) Fluorescência intracelular de Cu2⁺; barra de escala = 50 µm. As réplicas técnicas triplas foram médias dentro de seis réplicas biológicas independentes por grupo; as barras de erro indicam o desvio padrão. Os valores de P exatos bicaudais e as verificações de pressupostos estão relatados na Tabela Suplementar 5. TTM: tetratiomolibdato; LPS: lipopolissacarídeo. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Os dados brutos e processados, scripts de análise e planilhas-fonte dos experimentos com células estão disponíveis publicamente em https://doi.org/10.5281/zenodo.21202720.

Figura Suplementar 1: Pré-processamento de dados e diagnósticos de expressão diferencial. (A–F) Distribuições das amostras antes (A–C) e após (D–F) a correção de lote. (G) Gráfico de vulcão dos genes diferencialmente expressos. (H) Mapa de calor dos padrões de expressão normalizados. DEGs: genes diferencialmente expressos; GEO: Gene Expression Omnibus.Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2: Análise de enriquecimento dos CF-DEGs. (A) Enriquecimento da Ontologia Genética. (B) Enriquecimento do Enciclopédia de Kyoto de Genes e Genomas. CF-DEGs: genes diferencialmente expressos coexpressos por cuproptose-ferroptose; GO: Ontologia Genética; KEGG: Enciclopédia de Kyoto de Genes e Genomas.Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Diagnósticos de triagem do WGCNA. (A) Seleção do limiar suave. (B) Agrupamento de eigengenes de módulo. (C) Dendrograma gene-módulo. (D) Associações entre módulo e característica. (E–G) Relações entre significância gênica e pertencimento ao módulo para os módulos roxo, marrom e preto. WGCNA: análise de rede de coexpressão gênica ponderada; UC: colite ulcerativa.Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: Triagem multietapas de biomarcadores. (A, B) Seleção de características pelo LASSO. (C, D) Seleção de características pelo SVM-RFE. (E, F) Classificação de características pela floresta aleatória. (G) Consenso entre os três modelos. (H, I) Rede de interação proteína-proteína e nós centrais do CytoHubba. (J) Integração dos resultados de aprendizado de máquina, WGCNA e PPI. (K) Localizações cromossômicas dos cinco candidatos. LASSO: operador de redução e seleção absoluta mínima; SVM-RFE: eliminação recursiva de características por máquina de vetores de suporte; RF: floresta aleatória; PPI: interação proteína-proteína; WGCNA: análise de rede de coexpressão gênica ponderada.Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 5: Validação do modelo de LPS em células Caco-2. (A) Viabilidade celular. (B, C) Expressão de RNA mensageiro de IL-6 e IL-1β. As réplicas técnicas triplas foram médias de seis réplicas biológicas independentes por grupo; as barras de erro indicam o desvio padrão. LPS: lipopolissacarídeo.Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Conjuntos de dados GEO utilizados para descoberta e validação. Números de acesso dos conjuntos de dados, plataformas, composição das amostras e atribuições das coortes para os conjuntos de dados GEO incluídos nas análises de descoberta e validação. GEO: Gene Expression Omnibus.Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Sequências dos iniciadores para PCR quantitativa de transcrição reversa. Sequências de iniciadores utilizadas na análise por PCR quantitativa de transcrição reversa dos genes avaliados neste estudo.Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 3: Detalhes estatísticos para as Figuras 13, 14 e a Figura Suplementar 1. Números de réplicas biológicas, verificações de pressupostos, métodos de análise estatística e valores P exatos para as comparações experimentais indicadas.Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 4: Genes diferencialmente expressos coexpressos em cuproptose e ferroptose. Lista de GD-EDC identificados pela interseção entre genes correlacionados à ferroptose e cuproptose e genes diferencialmente expressos.Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 5: Genes nos módulos WGCNA selecionados para triagem de biomarcadores. Lista de genes contidos nos módulos WGCNA selecionados para a triagem subsequente de biomarcadores. WGCNA: análise de rede de coexpressão gênica ponderada.Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este estudo integrou transcritômica em massa, aprendizado de máquina, análise de célula única e experimentos celulares direcionados para investigar a interação entre ferroptose e cuproptose na colite ulcerativa (UC). Cinco candidatos diagnósticos associados à UC foram reprodutíveis nas coortes de descoberta e validação, localizaram-se principalmente em compartimentos epiteliais e mieloides e mostraram expressão responsiva à inibição de vias em células Caco-2. Esses achados apoiam um fluxo de trabalho em etapas no qual a priorização computacional orienta a validação biológica focada, evitando, ao mesmo tempo, a afirmação mais forte de que os cinco genes são reguladores upstream estabelecidos da ferroptose ou da cuproptose.

Os DEGs associados à FC foram enriquecidos em respostas ao lipopolissacarídeo, ao manuseio de cobre, ao transporte de lipídios, à sinalização NF-κB/TNF e à ferroptose, fornecendo uma ligação coerente entre estresse oxidativo dependente de metais e inflamação da mucosa10,19.

Os cinco candidatos ocupam contextos complementares de inflamação e estresse metálico. A LCN2 liga o sequestro de ferro, a disbiose microbiana e o eixo de ferroptose LCN2–ALOX1520,21,22,23; a IDO1 conecta o metabolismo do triptofano, a inflamação da mucosa e a disfunção no manuseio do ferro24,25,26; e a CXCL2 liga a sinalização IL-17/IL-22, o recrutamento de neutrófilos e a peroxidação lipídica27,28,29,30. A NOS2 apresenta efeitos dependentes do contexto, mas pode amplificar a lesão oxidativa e a susceptibilidade à ferroptose quando excessivamente induzida31,32,33,34,35,36. A CD274 é um marcador epitelial imunorregulatório cuja relação com FDX1 e com a sensibilidade ao ionóforo de cobre sugere resposta à cuproptose, em vez de controle estabelecido da via37,38,39. Os experimentos com inibidores foram consistentes com essas classificações: o ferrostatina-1 reduziu LCN2, IDO1, CXCL2 e NOS2, enquanto a tetratiomolibdato reduziu CD274.

A análise imunológica conectou ainda mais a assinatura candidata aos macrófagos M1, neutrófilos, linfócitos T CD4⁺ de memória ativados e mastócitos ativados, todos os quais podem manter a lesão epitelial por meio de citocinas, espécies reativas de oxigênio e sinalização que compromete a barreira40,41,42,43,44. RELA, hsa-miR-34a-5p e hsa-miR-16-5p surgiram como reguladores upstream plausíveis, enquanto as evidências de um papel direto do receptor de andrógeno na colite ulcerativa permanecem limitadas45,46,47,48,49,50. Esses achados devem ser interpretados como hipóteses em nível de rede para futuros experimentos de perturbação, e não como prova de regulação direta.

A análise de célula única localizou LCN2 e NOS2 em colonócitos inflamatórios e IDO1, CXCL2 e CD274 em populações ricas em monócitos de origem mieloide. Prevê-se que os colonócitos inflamatórios atuem como centros de comunicação, com o par ligante–receptor APP–CD74 entre os principais pares epitélio–mieloides51,52,53,54,55,56. Essa resolução por tipo celular restringe o contexto biológico no qual os cinco candidatos devem ser testados e apoia sistemas de co-cultura ou de organoides com células imunes como próximo passo experimental.

Várias limitações restringem a interpretação. Caco-2 é uma linhagem celular de adenocarcinoma colorretal e não recapitula completamente o epitélio colônico não maligno, a heterogeneidade entre pacientes, as interações estroma-imunes ou a colite ulcerativa crônica; portanto, é necessário validar os resultados em células epiteliais intestinais primárias, organoides derivados de pacientes, sistemas de co-cultura e modelos de colite in vivo. A planilha de origem do Figura 13 arquivada também apresentava falta de alguns registros de réplicas controle nos painéis A, C e F, reduzindo a precisão dessas comparações; todas as contagens de réplicas disponíveis e os valores exatos de P são divulgados no Suplemento Tabela 5. Por fim, idade, sexo, exposição ao tratamento e outras covariáveis clínicas não estavam uniformemente disponíveis em todas as coortes públicas. Serão necessárias coortes prospectivas multicêntricas e a perturbação direta dos cinco candidatos para estabelecer utilidade diagnóstica e papéis causais. Dentro dessas limitações, o estudo fornece um conjunto transparente e ancorado experimentalmente de hipóteses que ligam a morte celular dependente de metais, a comunicação epitélio-mieloide e a colite ulcerativa. Pesquisas comparáveis de farmacologia em rede no câncer de próstata ilustram o valor gerador de hipóteses da priorização computacional de alvos, mas não constituem validação específica para a colite ulcerativa57. Da mesma forma, a discussão recente sobre a ferroptose na osteoartrite e na degeneração óssea reflete o interesse terapêutico mais amplo na modulação da ferroptose, embora os mecanismos específicos da doença não possam ser diretamente extrapolados para a colite ulcerativa58. A validação em coortes externas e experimentos com inibidores foram, portanto, utilizados para fortalecer, mas não exagerar, as associações bioinformáticas.

Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Projeto Jovem Erudito Qihuang da Administração Nacional de Medicina Tradicional Chinesa (Termo de Doação nº 2022256). Agradece-se a todos os membros das equipes de pesquisa da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Liaoning e do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Liaoning pelo apoio técnico e pelas contribuições na curadoria de dados e na análise bioinformática.

O OpenAI Codex (OpenAI) foi utilizado durante a revisão exclusivamente para auxiliar na edição em língua inglesa, formatação do documento e verificação da qualidade das figuras. Todo o conteúdo científico, análises, citações e a apresentação final foram revisados e verificados pelos autores, que assumem total responsabilidade pelo manuscrito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de ensaio de proteína BCABeyotime Institute of BiotechnologyP0010Quantificação de proteína para normalização.
Bioinformatics.com.cnBioinformatics.com.cnPlataforma online; acesso em 2026Plataforma de visualização e análise GO/KEGG.
Linhagem celular Caco-2ATCCHTB-37Linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano utilizada para o modelo de lesão epitelial.
Kit Cell Counting Kit-8GLPBioGK10001Ensaio de viabilidade celular medido a 450 nm.
CIBERSORT com assinatura LM22Desenvolvedores do CIBERSORTLM22Desconvolução de 22 frações de células imunes.
ChEA3Laboratório Ma'ayanPlataforma online; acesso em 2026Enriquecimento de fatores de transcrição e predição de rede regulatória.
Incubadora de CO2 Não registradoN/AIncubadora umidificada utilizada para cultura a 37 °C e 5% de CO2.
Probe fluorescente de Cu2+ BIOFOUNTCAS 98907-26-7Detecção fluorescente intracelular de Cu2+ .
Cytoscape com CytoHubbaConsortium CytoscapeVersão não registradaVisualização de interações proteína-proteína e classificação de nós centrais.
Meio de Eagle modificado por DulbeccoGibco11965092Meio de cultura para células Caco-2.
Dissulfóxido de dimetilaNão registradoN/AControle veicular.
Soro bovino fetalNão registradoN/ASuplemento do meio a 10%.
Kit de ensaio de Fe2+ Abcamab83366Medição de Fe2+ intracelular.
FerrDBDesenvolvedores do FerrDBBanco de dados online; acesso em 2026Fonte de genes relacionados à ferroptose.
Ferrostatina-1Sigma-AldrichSML0583Inibidor de ferroptose; concentração final de 4 µM.
HarmonyBroad Institute/comunidadeVersão não registradaCorreção de lote em células únicas.
Microscópio invertido de fluorescênciaOlympusIX71Imagem de fluorescência de Cu2+ com excitação/emissão em 510/578 nm.
LipopolissacarídeoNão registradoN/AEstímulo de lesão inflamatória a 1 µg/mL por 24 h.
Kit de ensaio de malondialdeídoBeyotime Institute of BiotechnologyS0131SMedição de peroxidação lipídica.
Leitor de microplacasNão registradoN/AMedição de absorbância a 450 nm.
MonocleBioconductor/comunidadeVersão 2Análise de pseudotempo em células únicas.
Banco de Dados de Assinaturas MolecularesBroad Institutec2.cp.kegg_medicus.v2025.1.HsConjunto de genes de referência para GSEA.
NetworkAnalystDesenvolvedores do NetworkAnalystPlataforma online; acesso em 2026Integração de redes de fatores de transcrição e miRNA.
Penicilina–estreptomicinaNão registradoN/A100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina.
RFoundation R para Computação EstatísticaVersão não registradaAmbiente de análise bioinformática.
Conjunto de pacotes RCRAN/BioconductorVersões dos pacotes não registradasFluxos de trabalho com limma, WGCNA, clusterProfiler, glmnet, randomForest, e1071, pROC e rms.
Sistema de PCR em tempo realNão registradoN/AAparelho de RT-qPCR com SYBR Green.
Kit RevertAid para Síntese de cDNA de Primeiro FioThermo Fisher ScientificK1622Síntese de cDNA de primeiro fio a partir de 1 µg de RNA.
SangerboxDesenvolvedores do Sangerbox3.0Normalização e correção de lote com ComBat.
SeuratSatija Lab/comunidadeVersão 4Controle de qualidade, normalização, agrupamento e visualização em células únicas.
Software de análise estatísticaNão registradoN/AAnálise estatística dos experimentos celulares originais.
STRINGConsortium STRINGBanco de dados online; acesso em 2026Construção de rede de interação proteína–proteína.
Reagentes de PCR em tempo real com SYBR GreenTakaraRR820APCR quantitativa em tempo real.
TarBaseDIANA Tools9.0Interações miRNA–gene com suporte experimental.
TetratiomolibdatoSigma-Aldrich323446Quelante de cobre; concentração final de 40 µM.
Reagente TRIzolTakara9108Extração de RNA total.

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