Artigo de investigação

Ingestão de Vitamina B12 e Doença Renal Diabética: Um Estudo Transversal Baseado no NHANES com Identificação Transcriptômica de P2RY14

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DOI:

10.3791/73687

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21 de outubro de 2026

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1Department of Emergency Medicine, Zibo Central Hospital

Neste artigo

Resumo

Este estudo investiga a associação entre a ingestão dietética de vitamina B12 e a doença renal diabética utilizando dados do NHANES e análises transcriptômicas. Uma ingestão mais alta de vitamina B12 esteve associada a menores chances de doença renal diabética, e P2RY14 foi identificado como um candidato com potencial para gerar hipóteses.

Resumo

A doença renal diabética (DKD) é uma complicação diabética importante, e a associação entre a ingestão de vitamina B12 e a DKD permanece incerta. Este estudo transversal incluiu 8.218 participantes da Pesquisa Nacional de Saúde e Exame Nutricional (NHANES) de 2011 a 2018. A regressão logística multivariável mostrou que os participantes no quartil mais alto de ingestão de vitamina B12 tinham menores chances de apresentar DKD do que aqueles no quartil mais baixo (razão de chances (OR): 0,70; intervalo de confiança de 95% (IC): 0,50–0,97). A análise de spline cúbica restrita indicou uma associação não linear significativa entre a ingestão de vitamina B12 e a DKD. A análise transcriptômica identificou 493 genes diferencialmente expressos (DEGs), dos quais 20 coincidiram com genes relacionados à cobalamina. P2RY14 foi significativamente superexpresso na DKD e mostrou capacidade discriminatória preliminar nos conjuntos GSE30528, GSE30529 e GSE142025. As análises de enriquecimento funcional sugeriram associações entre P2RY14 e interação entre matriz extracelular e receptor, adesão focal e desenvolvimento renal. A análise exploratória de encaixe molecular previu um modo de ligação potencial entre MC-1 e P2RY14, com um escore Vina de −6,0 kcal/mol. No geral, esses achados apoiam uma associação entre a ingestão de vitamina B12 e a DKD e identificam P2RY14 como um candidato gerador de hipóteses para investigações futuras.

Introdução

Diabetes mellitus (DM) é uma desordem metabólica caracterizada por hiperglicemia crônica, decorrente de deficiências absolutas ou relativas na secreção e/ou atividade da insulina. Afeta aproximadamente 537 milhões de pessoas em todo o mundo1. Nas últimas três décadas, a prevalência global de DM aumentou quase quatro vezes, com cerca de um em cada onze adultos diagnosticado, dos quais 90% são afetados pelo diabetes mellitus tipo 2 (DM2)2. O DM2 frequentemente leva a diversas complicações microvasculares e macrovasculares, incluindo doenças cardiovasculares, acidente vascular cerebral, nefropatia, neuropatia e retinopatia3. Essas complicações contribuem significativamente para o aumento das taxas de incapacidade, diminuição da qualidade de vida e redução da expectativa de vida4,5. É particularmente preocupante a doença renal diabética (DRD), uma complicação microvascular comum do diabetes, que se desenvolve em aproximadamente 20% dos pacientes com DM6. A DRD é caracterizada por albuminúria persistente e declínio progressivo na taxa de filtração glomerular (TFG). Se não for controlada, a DRD pode eventualmente levar à doença renal em estágio terminal (ERET), na qual a função renal fica gravemente comprometida, exigindo diálise ou transplante renal para a sobrevivência7,8. Além disso, pacientes com DRD apresentam risco aumentado de desenvolver doenças cardiovasculares, mesmo em estágios iniciais, e essa comorbidade está associada a um risco elevado de mortalidade, impondo uma carga substancial aos sistemas de saúde9,10,11. Assim, é fundamental investigar minuciosamente os fatores que contribuem para a progressão da DRD. Uma compreensão mais profunda desses fatores é essencial para elaborar estratégias terapêuticas eficazes que previnam tanto o início quanto a progressão da DRD na prática clínica.

As vitaminas do complexo B, um grupo de vitaminas hidrossolúveis, desempenham um papel crucial no metabolismo celular e na homeostase, mantendo o equilíbrio fisiológico, a defesa antioxidante e a síntese de glóbulos vermelhos12. A principal fonte de vitamina B é a ingestão alimentar. Devido à sua natureza hidrossolúvel, essas vitaminas geralmente são difíceis de armazenar no organismo humano12. O excesso de vitamina B é rapidamente excretado na urina; no entanto, a absorção, utilização e metabolismo individuais podem variar significativamente13. A deficiência de vitamina B pode prejudicar acentuadamente a função celular e o sistema imunológico, levando a inflamação associada à hiper-homocisteinemia14. Fatores como a deficiência de vitamina B podem contribuir para a progressão da doença renal crônica (ERC) ao influenciar processos inflamatórios e de estresse oxidativo associados à disfunção renal e à patologia do tecido renal15. Dentre as vitaminas do complexo B, a vitamina B12, também conhecida como cobalamina, é uma vitamina hidrossolúvel essencial que desempenha um papel significativo no metabolismo, particularmente na síntese de DNA, metilação e metabolismo mitocondrial15. Em pacientes com ERC e doença renal em estágio terminal, diversas alterações metabólicas — incluindo acidose, inflamação sistêmica e desequilíbrios hormonais — juntamente com comorbidades e polifarmácia, podem levar à desnutrição, resultando subsequentemente em deficiência de vitamina B1216. Vários estudos estabeleceram uma correlação entre baixas concentrações séricas de vitamina B12 e condições como índice de massa corporal (IMC) elevado, resistência à insulina, diabetes tipo 2 (DM2), dislipidemia e doenças cardiovasculares17. Por outro lado, a toxicidade potencial associada ao excesso de vitamina B12 pode agravar condições em pacientes com ERC18. Além disso, um estudo recente indicou que concentrações mais elevadas de vitamina B12 estão associadas a maior mortalidade por todas as causas entre pacientes submetidos à hemodiálise19. No entanto, a relação entre a ingestão de vitamina B12 e a ocorrência de nefropatia diabética (ND) ainda não foi investigada de forma abrangente. Além disso, as características moleculares que potencialmente ligam os processos biológicos relacionados à vitamina B12 à ND permanecem insuficientemente caracterizadas. Portanto, a integração de evidências epidemiológicas baseadas em populações com dados transcriptômicos pode fornecer uma estratégia complementar para identificar características moleculares candidatas relevantes para a associação observada e para priorizar alvos para investigações experimentais subsequentes.

Dado o atual desconhecimento, realizamos um estudo transversal utilizando dados do banco de dados NHANES para investigar a associação entre a ingestão de vitamina B12 e DNT, controlando uma ampla gama de possíveis fatores de confusão. Paralelamente, conjuntos de dados transcriptômicos de DNT foram analisados para identificar genes diferencialmente expressos, que subsequentemente foram cruzados com genes relacionados à vitamina B12 para selecionar moléculas candidatas potencialmente relevantes para a DNT. Essa abordagem integrada pode fornecer novas perspectivas sobre a associação entre a vitamina B12 e a DNT.

Protocolo

O presente estudo foi uma análise secundária de dados do NHANES disponíveis publicamente e desidentificados, e não envolveu recrutamento de novos participantes, intervenção ou coleta de informações pessoalmente identificáveis. Portanto, nenhum consentimento informado adicional foi necessário para a presente análise.

População do estudo e seleção dos participantes

A Pesquisa Nacional de Exame de Saúde e Nutrição (NHANES) utiliza um desenho amostral probabilístico complexo e em múltiplos estágios para coletar dados representativos em nível nacional sobre saúde e nutrição da população dos Estados Unidos.

Inicialmente, foram considerados dados de 39.156 participantes de quatro ciclos do NHANES (2011–2012, 2013–2014, 2015–2016 e 2017–2018). Os participantes foram excluídos se preenchessem qualquer um dos seguintes critérios: (1) idade < 18 anos; (2) dados ausentes sobre a ingestão dietética de vitamina B12; (3) informações incompletas necessárias para a avaliação de diabetes, incluindo histórico autorrelatado de diabetes, hemoglobina glicada (HbA1c) ou glicose plasmática em jejum (FPG); ou (4) informações incompletas necessárias para a avaliação de doença renal, incluindo a razão entre albumina urinária e creatinina (ACR) ou taxa de filtração glomerular estimada (eGFR) (Figura 1). Após essas exclusões, foram incluídos 8.218 participantes com dados completos necessários para a análise atual.

Definição de DM, DRC e DND

De acordo com os critérios estabelecidos pela Associação Americana de Diabetes e estudos anteriores, o DM foi diagnosticado com base nos seguintes critérios: (1) diagnóstico médico prévio, (2) níveis de GPF ≥ 7,0 mmol/L, (3) níveis de HbA1c ≥ 6,5% ou (4) uso autorrelatado de insulina ou medicamentos anti-hiperglicemiantes. A DRC foi identificada20,21 em participantes com ACR ≥ 30 mg/g ou TFG (TFG = 175 × (creatinina sérica em mg/dL)-1.154 × (idade em anos)-0.203 × (0,742 se mulher) × (1,21 se negro)) < 60 mL/min/1,73 m2. A DND foi definida como a presença simultânea de DM e DRC20. Os participantes que atendiam aos critérios de DM e DRC foram classificados no grupo DND, enquanto aqueles que não atendiam simultaneamente a ambos os critérios foram classificados no grupo Não-DND. O grupo Não-DND, portanto, incluiu participantes com DM, mas sem DRC, participantes com DRC, mas sem DM, e participantes sem DM nem DRC.

Covariáveis

Este estudo considerou covariáveis que poderiam influenciar a associação entre a vitamina B12 e a DND. As variáveis demográficas incluíram idade, sexo, raça/etnia, escolaridade, razão renda-pobreza (PIR), estado civil, consumo de álcool, comportamento relacionado ao tabagismo, IMC, atividade física (AF) e a presença de hipertensão e hiperlipidemia. Foram incluídos nesta análise participantes com 18 anos ou mais, estratificados em dois grupos etários: adultos jovens a de meia-idade (18–<60 anos) e adultos mais velhos (≥ 60 anos). O sexo foi classificado como masculino ou feminino. As classificações étnicas incluíram americano mexicano, outro hispânico, não hispânico branco, não hispânico negro e outro/multirracial. A escolaridade foi dividida em três níveis: menos que ensino médio, ensino médio completo e faculdade ou superior. A PIR foi classificada em três categorias: <1,5, 1,5–3,49 e ≥3,521. O estado civil foi indicado como casado/vivendo com parceiro, nunca casado ou viúvo/divorciado. O status de tabagismo foi classificado em três grupos: fumantes atuais (fumantes diários e intermitentes), ex-fumantes (aqueles que fumaram >100 cigarros na vida, mas que não fumam mais) e nunca fumantes (aqueles que fumaram <100 cigarros na vida). O status de consumo de bebidas alcoólicas foi classificado em três categorias: consumo pesado (mulheres: >3 doses por dia; homens: >4 doses por dia), consumo moderado (mulheres: 2 doses por dia; homens: 3 doses por dia) e consumo leve (mulheres: <2 doses por dia; homens: <3 doses por dia)22. O IMC foi classificado como: <25 kg/m2, 25–29,9 kg/m2 e ≥30 kg/m2. Os níveis de AF foram categorizados como baixos (<600 MET-min/semana), moderados (600 a <3000 MET-min/semana) e altos (≥3000 MET-min/semana). A hiperlipidemia foi confirmada com base nos seguintes critérios (cumprir pelo menos um): (1) níveis de colesterol total (CT) ≥200 mg/dL; (2) níveis de triglicerídeos totais (TG) ≥150 mg/dL; (3) homens: níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL) <40 mg/dL; mulheres: níveis de HDL <50 mg/dL; (4) níveis de lipoproteína de baixa densidade (LDL) ≥130 mg/dL; ou (5) uso de medicação antihiperlipidêmica.

Além disso, foram considerados também indicadores bioquímicos e ingestões alimentares, incluindo a razão entre albumina e creatinina na urina (ACR), ácido úrico sérico (μmol/L), TFG (mL/min/1,73m2), creatinina sérica (Scr), nitrogênio ureico no sangue (NUS), colesterol total sérico (CT), triglicerídeos (TG), alanina aminotransferase sérica (ALT), aspartato aminotransferase sérica (AST), ingestões alimentares como ingestão energética (kcal), proteína (g), carboidrato (g), gordura total (g), sódio (mg), potássio (mg), etc.

Variável independente

A ingestão dietética de vitamina B12 foi utilizada como a variável de exposição principal. Os dados sobre a ingestão de nutrientes foram obtidos dos arquivos de Ingestão Total de Nutrientes do NHANES, que resumem a ingestão diária de nutrientes provenientes de alimentos e bebidas. A ingestão de vitamina B12 proveniente de suplementos dietéticos não foi incluída. Apenas participantes com dados válidos de recordatório alimentar para ambos os dias foram incluídos, e a média da ingestão de vitamina B12 ao longo dos dois dias de recordatório foi calculada e expressa em μg/dia. A ingestão dietética resultante de vitamina B12 foi categorizada em quartis (Q1–Q4) para as análises multivariáveis principais.

Fontes de dados e coleção de conjuntos de genes

Os conjuntos de dados de expressão de DKD GSE30528 e GSE30529 foram obtidos do banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO). Ambos os conjuntos de dados foram gerados na plataforma GPL571. O GSE30528 compreendia 9 amostras glomerulares de DKD e 13 amostras glomerulares de controle normal, enquanto o GSE30529 compreendia 10 amostras tubulares de DKD e 12 amostras tubulares de controle normal. Para ambos os conjuntos de dados de microarranjo, os dados de expressão normalizados por RMA e transformados por log2 foram obtidos diretamente do GEO. Os identificadores de sondas foram mapeados para símbolos gênicos de acordo com o arquivo de anotação da plataforma GPL571. Quando múltiplas sondas foram mapeadas para o mesmo gene, o valor médio de expressão delas foi utilizado para representar a expressão ao nível gênico.

O conjunto de dados RNA-seq GSE142025 foi adicionalmente incluído para a validação de genes candidatos. Os dados de expressão em TPM foram obtidos do GEO e transformados em log2 antes da análise subsequente. A anotação gênica foi realizada utilizando a anotação do genoma de referência hg19. Como cada conjunto de dados foi analisado de forma independente e as matrizes de expressão de diferentes conjuntos de dados não foram diretamente combinadas, nenhuma correção para efeitos de lote entre conjuntos de dados foi aplicada.

Um total de 716 genes relacionados à cobalamina (vitamina B12) foi recuperado do banco de dados GeneCards em 13 de março de 2026, utilizando a palavra-chave “COBALAMIN”. Nenhum corte no escore de relevância ou critério adicional de filtragem foi aplicado, e todos os 716 genes recuperados foram mantidos como o conjunto de genes relacionados à vitamina B12.

Análise de expressão diferencial e enriquecimento funcional

A análise de expressão diferencial entre amostras de DKD e normais foi realizada utilizando o pacote R 'limma' (versão 3.56.2)23, com genes diferencialmente expressos (DEGs) identificados com base em |log2FC| > 1 e uma taxa de falsa descoberta (FDR) < 0,05. Para identificar genes candidatos relacionados ao metabolismo da vitamina B12, o pacote R ggvenn (versão 0.1.19) foi utilizado para realizar uma análise de interseção entre os DEGs identificados e o conjunto de genes relacionados à vitamina B12 obtido no banco de dados GeneCards. Os genes com sobreposição foram visualizados por meio de um diagrama de Venn e mantidos como genes candidatos para análises subsequentes. A análise de enriquecimento funcional dos DEGs foi então conduzida utilizando o pacote R 'clusterProfiler' (versão 4.8.3)24, abrangendo termos da Ontologia Genética (GO) (processo biológico, função molecular e componente celular) e vias da Enciclopédia de Kyoto de Genes e Genomas (KEGG). Termos de enriquecimento com valor de p-ajustado < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Análise de enriquecimento de conjunto de genes (GSEA)

No conjunto de dados GSE30528, as amostras foram divididas em P2RY14-alto e P2RY14-grupos baixos de acordo com a mediana P2RY14 nível de expressão. Em seguida, foi realizada a análise de expressão diferencial entre os dois grupos, e todos os genes foram classificados em ordem decrescente de acordo com os valores de logFC resultantes. A GSEA foi posteriormente realizada utilizando o pacote clusterProfiler do R (versão 4.8.3)24. Os conjuntos de genes GO e KEGG foram obtidos utilizando o pacote msigdbr do banco de dados MSigDB (versão v2025.1.Hs). Conjuntos de genes enriquecidos com valor de p ajustado < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Redes de interação proteína-proteína (IPP)

As associações funcionais de proteínas e as redes de interação proteína-proteína (PPI) foram analisadas utilizando o banco de dados STRING (versão 11.0) (https://string-db.org/)25, com Homo sapiens selecionado como o organismo e um escore mínimo de confiança de interação de 0,4. A rede de interações proteína-proteína resultante foi visualizada utilizando o Cytoscape26Além disso, os mesmos 20 genes candidatos sobrepostos foram submetidos à plataforma online GeneMANIA para caracterizar ainda mais suas associações funcionais. O GeneMANIA integrou múltiplos tipos de evidências, incluindo coexpressão gênica, interações físicas, interações genéticas, domínios proteicos compartilhados e informações de vias metabólicas, com Homo sapiens selecionado como o organismo e os demais parâmetros mantidos nos valores padrão.

Triagem de fármaco-alvo

Para identificar compostos potenciais associados ao P2RY14, as informações sobre fármaco-alvo foram obtidas a partir do banco de dados GeneCards, resultando em cinco compostos candidatos. Esses candidatos foram posteriormente confrontados com o banco de dados DGIdb. O MC-1 (ID do DrugBank: DB05315; CID do PubChem: 1051) foi identificado em ambos os bancos de dados e, portanto, selecionado para análise exploratória subsequente de docking molecular.

Análise de docking molecular

Para explorar o modo de ligação potencial entre MC-1 e P2RY14, realizou-se o encaixe molecular utilizando a plataforma online CB-Dock2, que integra a detecção de cavidades com o mecanismo de encaixe AutoDock Vina. A estrutura tridimensional de MC-1 (PubChem CID: 1051) foi obtida do PubChem, e o modelo tridimensional previsto de P2RY14 foi obtido do Banco de Dados de Estruturas Proteicas AlphaFold (AF-Q15391-F1-model_v4). A pontuação média de pLDDT do modelo de P2RY14 foi de 87,12, enquanto a pontuação local de pLDDT da região prevista do sítio de ligação foi > 90, indicando alta confiança na estrutura local prevista. Foi empregada uma estratégia de encaixe cego orientada por cavidade. Foram pesquisadas cavidades de ligação candidatas em toda a estrutura de P2RY14, e as cinco cavidades com os maiores volumes previstos foram avaliadas. Átomos de hidrogênio foram adicionados durante o preparo do receptor e do ligante para aproximar os estados de protonação sob condições fisiológicas (aproximadamente pH 7,4). O receptor foi tratado como rígido, enquanto o ligante foi tratado como flexível, permitindo ligações rotatórias. Oito corridas independentes de encaixe foram realizadas. A conformação com a menor pontuação Vina foi selecionada como o modo de ligação previsto representativo. O complexo receptor–ligante resultante foi visualizado e analisado utilizando o Discovery Studio (versão 4.5).

Análise estatística

Dado o desenho complexo, multietápico e de amostragem probabilística estratificada do NHANES, todas as análises baseadas no NHANES incorporaram os pesos amostrais apropriados, estratos e unidades primárias de amostragem (PSUs). Como a ingestão de vitamina B12 foi calculada a partir de dois dias de recordatório alimentar, foi utilizado o peso amostral dietético de dois dias (WTDR2D). Para os quatro ciclos combinados do NHANES (2011–2018), o peso amostral dietético de oito anos foi calculado como WTDR2D/4, com SDMVSTRA e SDMVPSU incorporados para levar em conta a estratificação e o agrupamento. As variáveis contínuas foram expressas como média ± desvio padrão (DP), e as variáveis categóricas como contagens e porcentagens. As diferenças entre grupos foram avaliadas utilizando testes t ponderados e testes qui-quadrado ponderados. A regressão logística multivariável foi usada para avaliar a associação entre a ingestão de vitamina B12 e DKD. O Modelo 1 foi não ajustado; o Modelo 2 foi ajustado por idade, sexo, raça/etnia, estado civil e nível educacional; e o Modelo 3 foi ajustado para todas as covariáveis, incluindo ingestão total de energia e outras covariáveis dietéticas. Todas as análises de regressão incorporaram WTDR2D/4, SDMVSTRA e SDMVPSU. Os quartis da ingestão de vitamina B12 (Q1–Q4) foram usados como exposição principal, com a ingestão contínua de vitamina B12 analisada adicionalmente como exposição suplementar. Análises subgrupadas foram realizadas de acordo com idade, sexo, IMC, eGFR, ACR, hipertensão e hiperlipidemia. A análise de spline cúbica restrita (RCS) foi realizada utilizando o Modelo 3 totalmente ajustado para avaliar possível não linearidade. Quatro nós foram posicionados nos percentis 5º, 35º, 65º e 95º da ingestão de vitamina B12, com 3,24 μg/dia usado como valor de referência para apresentação gráfica. Esse valor de referência foi derivado da análise exploratória subsequente de ponto de inflexão e não foi interpretado como um nível clinicamente recomendado de ingestão. As análises RCS também incorporaram WTDR2D/4, SDMVSTRA e SDMVPSU, e a não linearidade foi avaliada utilizando um teste de Wald. Quando detectada não linearidade significativa, pontos de inflexão potenciais foram identificados por meio de um procedimento de busca recursiva combinado com o critério mínimo de informação de Akaike (AIC), seguido por uma análise de regressão segmentada em três partes. Análises de sensibilidade foram realizadas utilizando especificações alternativas de RCS com três e cinco nós27. A análise da curva ROC foi realizada para avaliar preliminarmente a capacidade discriminatória de P2RY14, com intervalos de confiança de 95% informados para as AUCs. Um valor de  p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software R (versão 4.4.1).

Resultados

Características basais

Um total de 8.218 participantes do NHANES 2011–2018 foi incluído, dos quais 623 foram classificados como tendo DRC e 7.595 como Não-DRC. Diferenças significativas entre os grupos DRC e Não-DRC foram observadas em idade, sexo, raça/etnia, estado civil, escolaridade, PIR, IMC, pressão arterial, hipertensão, consumo de álcool, tabagismo, ingestão de vitamina B12 e ingestão alimentar (todos p < 0,05). Diferenças significativas também foram observadas em ACR, TFG, Scr, BUN, CT e TG (Tabela 1).

Foram observadas diferenças significativas entre os quartis de ingestão de vitamina B12 em relação ao nível educacional, hipertensão, estado de DNT e ingestão energética. Em contraste, nenhuma diferença significativa foi observada entre os quartis em relação à idade, estado civil, IMC, pressão arterial, consumo de álcool, TFG, RAC, ácido úrico sérico, Scr ou TG (Table 2).

Associação entre vitamina B12 e DNT

A ingestão de vitamina B12 foi categorizada em quartis (Q1–Q4), e os resultados das análises de regressão logística multivariável são apresentados na Tabela 3. No Modelo 3 completamente ajustado, os participantes no quartil mais alto de ingestão de vitamina B12 (Q4) apresentaram odds significativamente menores de DNT do que aqueles no quartil mais baixo (Q1) (OR = 0,70, IC 95%: 0,50–0,97, p = 0,034), enquanto nenhuma associação significativa foi observada para Q2 (OR = 1,14, IC 95%: 0,85–1,53, p = 0,386) ou Q3 (OR = 0,94, IC 95%: 0,69–1,28, p = 0,684). Além disso, a tendência linear no modelo completamente ajustado não atingiu significância estatística (p para tendência = 0,086), embora a direção geral da associação fosse inversa. Esses achados sugerem que uma ingestão mais alta de vitamina B12, particularmente no quartil mais elevado, esteve associada a menores odds de DNT, mas os resultados não apoiam uma relação dose-resposta linear estável entre a ingestão de vitamina B12 e a DNT.

Análises de subgrupo da associação entre vitamina B12 e DKD

Análises de subgrupos foram realizadas para verificar se a associação entre a ingestão de vitamina B12 e DNT era consistente entre diferentes características dos participantes. No Modelo 1, participantes no quartil mais alto de ingestão de vitamina B12 (Q4) apresentaram odds significativamente menores de DNT do que aqueles no Q1, tanto no subgrupo de homens quanto no de mulheres (p < 0,05; Tabela 4). As associações nos subgrupos de TRA foram mais heterogêneas. Entre participantes com TRA < 30 mg/g, associações significativas foram observadas em alguns quartis intermediários de ingestão de vitamina B12, enquanto o padrão foi atenuado após estratificação por níveis mais altos de TRA. Nenhuma associação significativa foi observada nos subgrupos de TFGe.

Relação não linear entre a vitamina B12 e a DNT

A análise de RCS completamente ajustada mostrou uma associação não linear significativa entre a ingestão de vitamina B12 e DTD (Figura 2, p para não linearidade = 0,037). O modelo RCS utilizou quatro nós localizados nos percentis 5, 35, 65 e 95 da distribuição da ingestão de vitamina B12, com 3,24 μg/dia usado como valor de referência. A análise subsequente de pontos de quebra identificou dois pontos de quebra baseados nos dados em 3,24 μg/dia (IC 95%: 2,86–3,62) e 8,36 μg/dia (IC 95%: 7,52–9,20), dividindo a ingestão de vitamina B12 em três faixas. Para ingestão de vitamina B12 < 3,24 μg/dia, nenhuma associação significativa com DTD foi observada (OR = 1,07, p = 0,575). Na faixa de 3,24–8,36 μg/dia, a ingestão de vitamina B12 foi inversamente associada à DTD (OR = 0,87, p = 0,025). Para ingestão > 8,36 μg/dia, nenhuma associação significativa foi observada (OR = 1,00, p = 0,995) (Tabela 5). Esses achados foram consistentes com um padrão não linear, com uma associação inversa significativa observada apenas na faixa intermediária de ingestão. Para avaliar a robustez desses achados, foram realizadas análises de sensibilidade utilizando especificações alternativas de RCS com três e cinco nós. Padrões de associação gerais semelhantes foram observados, com associações gerais estatisticamente significativas em todos os Modelos 1–3 sob ambas as especificações de nós, enquanto os modelos com cinco nós forneceram apoio adicional a uma relação não linear (Figura Suplementar 1).

Identificação de genes candidatos relacionados à vitamina B12 na DNT

No conjunto de dados GSE30528, identificamos 493 genes diferencialmente expressos (GDEs) entre amostras de DKD e normais, compreendendo 126 genes superexpressos e 367 genes subexpressos (|log₂FC| > 1, FDR < 0,05; Figura 3A,B, Tabela Suplementar 1). A análise de vias KEGG revelou enriquecimento significativo desses GDEs nas vias de interação entre matriz extracelular (MEC) e receptor, adesão focal, sinalização por integrina e regulação do citoesqueleto de actina (Figura 3C, Tabela Suplementar 2). A análise de enriquecimento de GO indicou ainda que os GDEs estavam predominantemente associados à matriz extracelular contendo colágeno, desenvolvimento do glomérulo, adesão focal e desenvolvimento do néfron (Figura 3D, Tabela Suplementar 2).

A análise de interseção entre os genes diferencialmente expressos (DEGs) e o conjunto de genes relacionados à vitamina B12 identificou 20 genes candidatos com sobreposição (Figura 3E). Esses genes foram posteriormente utilizados para construir uma rede de interação proteína-proteína (PPI) utilizando o banco de dados STRING, com as interações filtradas por um escore mínimo de confiança de 0,4. A rede resultante consistiu em 11 nós e 20 arestas, representando proteínas e suas interações, respectivamente (Figura 3F). As relações entre os 20 genes candidatos foram ainda visualizadas utilizando o GeneMANIA (Figura 3G).

Caracterização exploratória de P2RY14 como um gene candidato relacionado à vitamina B12 na DN

Com base na associação observada entre a ingestão de vitamina B12 e o estado de DNT, em seguida buscamos identificar genes-chave relacionados à vitamina B12 implicados na patogênese da DNT por meio de análise transcriptômica. Dentre os 20 genes candidatos sobrepostos, comparamos ainda seus padrões de expressão em diferentes conjuntos de dados de DNT. Nos conjuntos de dados GSE30528 e GSE30529, a expressão de P2RY14 foi significativamente aumentada em amostras de DNT em comparação com controles normais (Figura 4A,B). P2RY14 codifica um receptor acoplado à proteína G e já foi relatado como envolvido na quimiotaxia de células imunes, reorganização do citoesqueleto, respostas inflamatórias e estresse oxidativo28,29. No entanto, seu papel na DNT ainda não foi diretamente investigado. Considerando sua regulação positiva consistente em diferentes conjuntos de dados independentes de DNT e sua relevância biológica potencial, P2RY14 foi priorizado para validação subsequente e análises funcionais. A análise da curva ROC foi posteriormente realizada para avaliar preliminarmente a capacidade discriminatória de P2RY14. No conjunto de dados de descoberta GSE30528, a AUC foi de 0,923 (IC 95%: 0,807–1,000), enquanto no conjunto de dados de validação externa preliminar GSE30529, a AUC foi de 0,883 (IC 95%: 0,744–1,000). No conjunto de dados adicional de validação GSE142025, a AUC foi de 0,663 (IC 95%: 0,478–0,847), indicando capacidade discriminatória limitada (Figura 4C–E). Em conjunto, esses achados fornecem evidências preliminares sobre o valor discriminatório potencial de P2RY14, embora seu desempenho diagnóstico exija validação adicional em coortes independentes maiores.

Para explorar funções biológicas e vias associadas a P2RY14 expressão em DKD, as amostras de GSE30528 foram divididas em P2RY14-alto e P2RY14-baixos de acordo com o nível mediano de expressão de P2RY14. A análise de expressão diferencial foi realizada entre os dois grupos. Em seguida, foram realizadas análises de enriquecimento GO e KEGG para caracterizar as funções biológicas e vias associadas à expressão de P2RY14. A análise de enriquecimento GO revelou que P2RY14 foi associado ao ECM contendo colágeno, desenvolvimento do glomérulo, componente estrutural do ECM e desenvolvimento renal (Figura 4F, Tabela Suplementar 3). A análise KEGG implicou ainda P2RY14 na interação entre matriz extracelular e receptor, adesão focal e cascatas do complemento e da coagulação (Figura 4G, Tabela Suplementar 3).

Além disso, a GSEA mostrou que a via de sinalização de NF-κB e a via de sinalização de TNF estavam significativamente enriquecidas no grupo com alta expressão de P2RY14 , sugerindo que a alta expressão de P2RY14 pode estar associada à sinalização inflamatória na DNT (Figura 4H, Tabela Suplementar 3).

Ensaio exploratório de docking molecular de MC-1 com P2RY14

Cinco compostos candidatos associados ao P2RY14 foram identificados por meio da triagem no GeneCards e no DGIdb, e MC-1 foi selecionado para análise exploratória de docking molecular (Figura 5A). Utilizando MC-1 como ligante e P2RY14 como receptor, a análise de docking previu uma possível conformação de ligação de MC-1 dentro de um sítio candidato do P2RY14, com um escore Vina de −6,0 kcal/mol. A conformação prevista envolveu interações com resíduos de Tyr, Lys, Asn, Asp e Glu e a formação de sete ligações de hidrogênio (Figura 5B–D).

Declaração sobre Disponibilidade de Dados

Os dados utilizados neste estudo estão disponíveis publicamente. Os dados do NHANES dos ciclos de pesquisa de 2011–2018 estão disponíveis no National Center for Health Statistics. Os conjuntos de dados transcriptômicos GSE30528, GSE142025 e GSE30529 estão disponíveis publicamente no banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO). Os resultados processados de expressão diferencial, enriquecimento funcional e GSEA gerados neste estudo são fornecidos nos Arquivos Suplementares.

figure-results-1
Figura 1: Fluxograma da seleção de participantes para a análise do NHANES. O fluxograma mostra os critérios de exclusão sequenciais aplicados aos participantes dos ciclos do NHANES de 2011 a 2018 e a população final do estudo incluída na análise. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Associação não linear entre a ingestão de vitamina B12 e DNT utilizando um modelo de spline cúbico restrito. A linha sólida representa a razão de chances estimada para DNT ao longo da ingestão dietética de vitamina B12, e a área sombreada representa o intervalo de confiança de 95%. O modelo foi ajustado utilizando as covariáveis incluídas no Modelo 3. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Identificação de genes candidatos relacionados à vitamina B12 na doença renal diabética (DKD). (A,B) Gráfico de dispersão e mapa de calor mostrando os perfis de expressão dos genes diferencialmente expressos (DEGs) entre amostras de doença renal diabética (DKD) e amostras normais no conjunto de dados GSE30528. (C,D) As 15 vias KEGG e termos GO mais enriquecidos entre os DEGs. (E) Análise cruzada entre DEGs e genes relacionados à vitamina B12. (F) Rede de interação proteína-proteína (PPI). (G) Rede GeneMANIA dos 20 genes relacionados à vitamina B12. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Caracterização exploratória de P2RY14 como gene candidato relacionado à vitamina B12 na DN. (A,B) Gráficos de caixa mostrando os níveis de expressão dos genes candidatos sobrepostos em amostras de DN e controles normais nos conjuntos de dados GSE30528 e GSE30529, respectivamente. (C–E) Análises da curva ROC (característica operacional do receptor) de P2RY14 nos conjuntos de dados GSE30528, GSE30529 e GSE142025, respectivamente. (F) Análise de enriquecimento da Ontologia Genética (GO). (G) Análise de enriquecimento de vias do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). (H) GSEA dos grupos com alta e baixa expressão de P2RY14, mostrando enriquecimento das vias de sinalização NF-κB e TNF em GSE30528. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Triagem de fármaco-alvo e análise exploratória de encaixe molecular de P2RY14. (A) Rede de interação entre fármacos e alvos dos medicamentos associados ao P2RY14. (B–D) Encaixe molecular da MC-1 com a proteína P2RY14. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Características básicas da população do estudo. Apresentam-se as características demográficas, clínicas, bioquímicas e dietéticas dos participantes de acordo com o status de DNT. Variáveis contínuas e categóricas são resumidas utilizando análise ponderada por inquérito. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Características básicas dos participantes de acordo com os quartis de ingestão de vitamina B12. As características demográficas, clínicas, bioquímicas e dietéticas da população do estudo são apresentadas conforme os quartis de ingestão dietética de vitamina B12. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Associação entre a ingestão de vitamina B12 e o estado de DNT em adultos dos Estados Unidos. São apresentadas as razões de chances (ORs) e os intervalos de confiança de 95% (ICs) para a associação entre a ingestão dietética de vitamina B12 e o estado de DNT em modelos de regressão logística progressivamente ajustados, sendo o quartil mais baixo de ingestão de vitamina B12 (Q1) o grupo de referência. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 4: Associação entre a ingestão de vitamina B12 e o estado de DNT em análises de subgrupos. São apresentadas as razões de chances (ORs) e os intervalos de confiança de 95% (ICs) para DNT nos quartis de ingestão de vitamina B12, estratificados por subgrupos de idade, sexo, IMC, TFGe, RCA, hipertensão e hiperlipidemia, e ajustados para os modelos especificados. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 5: Análise de regressão segmentada em três partes da associação entre a ingestão de vitamina B12 e DNT. As associações entre a ingestão dietética de vitamina B12 e DNT são apresentadas para as três faixas de ingestão definidas pelos dois pontos de corte determinados pelos dados, em 3,24 e 8,36 μg/dia. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figura Suplementar 1: Análises de sensibilidade da associação entre a ingestão dietética de vitamina B12 e DNT utilizando modelos de spline cúbico restrito. (A–C) Modelos com três nós. (D–F) Modelos com cinco nós. A linha sólida representa a OR estimada, a área sombreada representa o IC de 95% e a linha tracejada indica OR = 1. Valores de p para a associação geral e não linearidade são apresentados em cada painel.Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Genes diferencialmente expressos entre doenças renais diabéticas (DKD) e amostras normais no conjunto de dados GSE30528. Os resultados de expressão diferencial para genes identificados com |log₂FC| > 1 e FDR < 0,05 são apresentados juntamente com o conjunto de genes relacionados à cobalamina utilizado para triagem de genes candidatos.Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Análise de enriquecimento funcional dos genes diferencialmente expressos na DN. Apresentam-se os resultados do enriquecimento da Ontologia Genética (GO) e da Enciclopédia de Quioto de Genes e Genomas (KEGG) para os genes diferencialmente expressos identificados no conjunto de dados GSE30528.Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 3: Resultados da análise de enriquecimento funcional e da análise de enriquecimento de conjuntos de genes associados ao P2RY14 no conjunto de dados GSE30528. Apresentam-se os resultados do GO, KEGG e GSEA utilizados para caracterizar as funções biológicas e vias associadas ao P2RY14.Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Nesta análise transversal representativa a nível nacional de 8.218 adultos dos Estados Unidos, uma ingestão mais alta de vitamina B12 esteve associada a menores chances de DRC, embora a associação não tenha seguido um padrão simples de dose-resposta linear. Os participantes com ingestão mais elevada de vitamina B12 também tenderam a ter maior nível educacional, menor prevalência de hipertensão e DRC, e maior ingestão energética. Essas diferenças sugerem que a ingestão de vitamina B12 pode estar acompanhada por características demográficas, de saúde e dietéticas mais amplas, as quais devem ser consideradas ao interpretar a associação observada. No geral, nossos achados apoiam uma associação entre a ingestão de vitamina B12 e o estado de DRC.

A análise baseada em quartis mostrou que os participantes no Q4 tinham chances significativamente menores de DNT do que aqueles no Q1, enquanto nenhuma associação significativa foi observada para Q2 ou Q3. A tendência linear ao longo dos quartis também não foi estatisticamente significativa (p para tendência = 0,086), sugerindo que a associação pode não seguir um padrão simples de dose-resposta linear. De forma consistente com esse achado, a análise RCS demonstrou uma associação não linear significativa (p para não linearidade = 0,037). A análise subsequente de pontos de quebra identificou dois pontos de corte definidos pelos dados em 3,24 e 8,36 μg/dia. Uma associação inversa significativa foi observada apenas na faixa intermediária de 3,24–8,36 μg/dia, enquanto nenhuma associação significativa foi observada abaixo ou acima desse intervalo. É importante destacar que esses pontos de quebra foram derivados do conjunto de dados atual e devem ser considerados valores estatísticos exploratórios, e não limiares clinicamente estabelecidos. Assim, o intervalo de 3,24–8,36 μg/dia não deve ser interpretado como uma faixa ideal ou recomendada de ingestão sem validação externa. No geral, esses achados apoiam uma associação potencialmente não linear entre a ingestão de vitamina B12 e DNT, em vez de uma relação dose-resposta linear estável.

As vitaminas são micronutrientes essenciais envolvidos em múltiplos processos metabólicos e têm sido associadas à saúde cardiometabólica30,31. Estudos anteriores também sugeriram que diversas vitaminas podem ser relevantes para o diabetes e suas complicações. Por exemplo, o estado da vitamina B6 tem sido inversamente associado ao diabetes e às complicações diabéticas31, enquanto níveis alterados de vitamina D foram relatados na DQD e na nefropatia diabética32,33. Esses achados destacam a importância potencial do estado nutricional em micronutrientes nas anormalidades metabólicas e renais relacionadas ao diabetes e fornecem uma justificativa para investigar mais a fundo a relação entre a ingestão de vitamina B12 e a DQD.

Estudos epidemiológicos relataram achados inconsistentes quanto à relação entre o estado ou a ingestão de vitamina B12 e desfechos relacionados ao diabetes. Uma análise recente do NHANES relatou uma associação positiva entre a duração do diabetes e os níveis séricos de vitamina B1234. Em contraste, um estudo conduzido no Uganda descobriu que o agravamento da doença renal em pacientes com DM2 foi acompanhado por menor ingestão de vitamina B12 e maiores concentrações de homocisteína35. Wu et al. relataram ainda que a suplementação combinada com ácido fólico e vitamina B12 em pacientes com diabetes e nefropatia diabética reduziu os níveis séricos de homocisteína e malondialdeído, aumentou a atividade do óxido nítrico e da superóxido dismutase, e diminuiu a excreção urinária de microalbumina36. Outros estudos também relataram uma prevalência relativamente alta de deficiência de vitamina B12 entre pacientes com DM237,38,39,40,41. De acordo com a possibilidade de que o estado da vitamina B12 possa ser relevante para complicações diabéticas, nosso estudo encontrou que uma ingestão dietética mais elevada de vitamina B12 estava associada a menores chances de DNT.

A associação inversa observada entre a ingestão de vitamina B12 e a DND pode ser biologicamente plausível, considerando os papéis da vitamina B12 no metabolismo da homocisteína, na regulação do estresse oxidativo, nas respostas inflamatórias e no metabolismo energético celular42,43. A deficiência de vitamina B12 também tem sido associada a anormalidades metabólicas, e um desequilíbrio caracterizado pela ingestão excessiva de folato combinada com deficiência de vitamina B12 pode contribuir para o comprometimento do metabolismo da glicose e para o DM244,45. Essas observações destacam a importância de manter uma ingestão adequada e equilibrada de micronutrientes na saúde metabólica. De acordo com esse contexto, nosso estudo constatou que uma ingestão dietética mais elevada de vitamina B12 estava associada a menores chances de DND. São necessários mais estudos para esclarecer a relação dose-resposta entre a ingestão de vitamina B12 e a saúde renal em indivíduos com diabetes, validar as faixas de ingestão observadas no presente estudo em populações independentes e determinar se a suplementação com vitamina B12 é clinicamente relevante nessa população.

A análise transcriptômica identificou ainda P2RY14 como um gene candidato associado à DNT. P2RY14 apresentou valores relativamente altos de AUC em GSE30528 e GSE30529, enquanto sua capacidade discriminatória foi mais modesta em GSE142025. Devido aos tamanhos limitados das amostras, esses achados devem ser considerados preliminares e exigem validação em coortes independentes maiores. Além disso, análises de enriquecimento funcional sugeriram que P2RY14 pode estar associado à organização da MEC, adesão focal e desenvolvimento renal, apoiando investigações adicionais sobre seu possível papel na DNT.

De forma mais ampla, a integração da epidemiologia nutricional baseada em populações com a análise transcriptômica fornece um arcabouço complementar para vincular exposições dietéticas a características moleculares relacionadas a doenças. Essa abordagem pode facilitar a geração de hipóteses na epidemiologia nutricional e na pesquisa de DKD e ajudar a priorizar alvos moleculares candidatos para validação experimental subsequente. No entanto, esses achados permanecem exploratórios e não estabelecem utilidade clínica, diagnóstica ou terapêutica.

Uma limitação importante do presente estudo é a composição heterogênea do grupo sem DNR, que incluiu participantes com diferentes estágios de DM e DRC, em vez de se restringir a indivíduos com DM sem DRC. Diferenças residuais no estado diabético, na função renal e na saúde geral podem, portanto, ter influenciado as associações observadas. Além disso, o delineamento transversal impede inferências sobre relações temporais ou causais. Assim, os achados epidemiológicos devem ser interpretados como associações em nível populacional com o estado de DNR, sendo justificada a realização de futuros estudos prospectivos focados em indivíduos com diabetes. Ademais, a ingestão dietética de vitamina B12 foi estimada a partir de dois recordatórios alimentares de 24 horas, os quais podem ser afetados pela variação diária da dieta e por erros de recordação, podendo, portanto, não refletir plenamente a ingestão habitual de longo prazo de vitamina B12. Isso pode ter introduzido algum grau de erro na medição da exposição. Várias limitações das análises transcritômicas e de docking molecular também devem ser reconhecidas. Os dados do NHANES e do GEO foram obtidos de populações independentes, e a regulação direta de P2RY14 pela vitamina B12 não foi avaliada experimentalmente. A sobreposição entre genes diferencialmente expressos relacionados à DNR e genes relacionados à cobalamina foi utilizada para triagem exploratória de candidatos, e seu enriquecimento além do esperado ao acaso não foi formalmente testado. Assim, P2RY14 deve ser considerado um candidato gerador de hipóteses, cuja relevância biológica exige validação adicional. Além disso, a interação prevista entre MC-1 e P2RY14 baseou-se apenas em docking molecular e deve ser considerada exploratória. Estudos futuros que incluam intervenção com vitamina B12, análises funcionais de P2RY14 e ensaios diretos de ligação ou de função do receptor, como ressonância de plasmones de superfície ou termoforese em microescala, são necessários para avaliar mais profundamente essas relações previstas.

Conclusão

Em conclusão, nosso estudo apoia uma associação entre a ingestão de vitamina B12 e o estado de DNT, sendo uma ingestão mais alta de vitamina B12 associada a menores chances de DNT e uma relação potencialmente não linear. A análise transcriptômica identificou ainda P2RY14 como um candidato gerador de hipóteses associado à DNT, enquanto a análise exploratória de encaixe molecular previu um modo de ligação potencial entre P2RY14 e MC-1. Esses achados fornecem uma base para investigações futuras sobre a relação entre a ingestão de vitamina B12 e DNT, bem como a relevância biológica potencial de P2RY14.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Contribuições dos autores:
A.Z. escreveu o texto principal do manuscrito. G.Z. e J.D. prepararam figuras e tabelas. J.L. revisou e editou o manuscrito. Todos os autores revisaram o manuscrito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Matriz Affymetrix Human Genome U133A 2.0Affymetrix; indexado pelo NCBI GEOhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL571GPL571 (HG-U133A_2)
AlphaFoldGoogle DeepMind / EMBL-EBIhttps://alphafold.ebi.ac.uk//
AutoDockLaboratório Olson, The Scripps Research Institutehttps://autodock.scripps.edu/Versão 4.2.6 (AutoDock 4.2.6)
autoRegPacote RVersão 0.3.3 (autoReg)
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CytoscapeConsortium Cytoscapehttps://cytoscape.org/Versão 3.7.2 (PMID: 14597658)
DGldb/https://dgib.org/DGldb
GeneMANIAEquipe GeneMANIAhttp://genemania.org/GeneMANIA
Gene Expression Omnibus (GEO)Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI), Biblioteca Nacional de Medicina dos EUAhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/GEO
GSE30528NCBI GEOhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE30528Série pública GEO (GSE30528; BioProject PRJNA154757)
GSE30529NCBI GEOhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE30529Série pública GEO (GSE30529)
GeneCards – O Banco de Dados de Genes HumanosInstituto Weizmann de Ciência / LifeMap Scienceshttps://www.genecards.org/GeneCards
GSEA / MSigDB/https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jspv2025.1.Hs (GSEA / MSigDB)
Ontologia Genética (GO)Consortium da Ontologia Genéticahttps://geneontology.org/GO
Enciclopédia de Kyoto de Genes e Genomas (KEGG)Laboratórios Kanehisahttps://www.kegg.jp/KEGG
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nhanesAPacote RVersão 1.0 (nhanesA)
pROCPacote RVersão 1.18.5 (pROC)
PubChemNCBI, Biblioteca Nacional de Medicina dos EUAhttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/PubChem
rmsPacote RVersão 8.1-0 (rms)
Software RFoundation R para Computação Estatísticahttps://www.r-project.org/Versão 4.4.1
segmentedPacote RVersão 2.1-4 (segmented)
STRINGConsortium STRINGhttps://string-db.org/Versão 11.0 (PMID: 30476243)
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