Um Protocolo Baseado em Inserts para Cultura Celular para a Construção de um Modelo Simplificado in vitro da Barreira Sangue-Tumor Multicelular na Metástase Cerebral do Câncer de Mama

Resumo

Este estudo estabelece um modelo simplificado in vitro da barreira sangue-tumor (BTB) multicelular que combina cultivo celular em co-cultura Transwell e esferoides tumorais tridimensionais, fornecendo uma plataforma fisiologicamente relevante para o estudo da metástase cerebral do câncer de mama e triagem de terapias direcionadas.

Resumo

Tratamentos eficazes para metástases cerebrais do câncer de mama (BCBM) ainda são limitados, principalmente porque a barreira hemato-tumoral (BTB) restringe a entrada de muitos agentes quimioterápicos e direcionados nas lesões metastáticas dentro do sistema nervoso central. Para modelar características selecionadas desse microambiente complexo in vitro, este estudo apresenta um protocolo padronizado para a construção de um modelo tridimensional simplificado da BTB multicelular. O método compreende três etapas principais. Primeiro, um compartimento da barreira hemato-encefálica (BBB) é construído utilizando inserts para cultivo celular com uma 0.4 μm tamanho dos poros Células endoteliais microvasculares do cérebro humano (HBMECs) são semeadas no lado basal da membrana porosa, e 1 dia depois, astócitos humanos (AH) e células microgliais humanas HMC3 (HMC3) são semeadas no lado apical. Usando células SK-BR-3 como exemplo, células de câncer de mama são cultivadas pelo método de gota suspensa para formar esferoides tumorais tridimensionais uniformes e com formato regular após 3 dias de cultivo. Os esferoides são então transferidos para o lado apical de uma membrana porosa revestida com matriz de membrana basal, o que proporciona separação física, ao mesmo tempo que permite comunicação química entre as células da barreira e os esferoides tumorais durante o cultivo em co-cultura. Esta plataforma permite controle preciso da linha do tempo experimental e produz alterações morfológicas e de marcadores astrocitários compatíveis com uma resposta reativa peritumoral, ao mesmo tempo que permite a avaliação da integridade da barreira endotelial e da permeabilidade paracelular.

Introdução

A metástase cerebral é uma complicação comum nas fases avançadas de diversos tumores sólidos malignos, incluindo câncer de mama e câncer de pulmão^1,2. Seu prognóstico é extremamente ruim, e as opções de tratamento são limitadas^1,2. No sistema nervoso central saudável, a barreira hematoencefálica (BHE) é uma interface altamente especializada e dinâmica formada principalmente por células endoteliais microvasculares cerebrais fortemente conectadas, enquanto sua integridade e função são sustentadas pela membrana basal vascular e interações coordenadas com pericitos, astrócitos, neurônios, micróglias, células da linhagem de oligodendrócitos e outros componentes da unidade neurovascular³. Por meio de junções firmes entre as células endoteliais e com o auxílio das células gliais periféricas, ela restringe rigorosamente a entrada de substâncias exógenas no sistema nervoso central⁴. Uma vez que as células de câncer de mama se espalham e se estabelecem no cérebro, as lesões metastáticas cerebrais se expandem, a hipóxia local aumenta, os sinais inflamatórios se intensificam e a unidade neurovascular (UNV) sofre remodelação, reconstruindo progressivamente a barreira hemato-tumoral (BHT)⁵. Embora a permeabilidade local da BHT seja maior do que a da BHE, as diferenças na permeabilidade a moléculas de diferentes tamanhos, aliadas à perfusão sanguínea desigual, levam à baixa acumulação de fármacos nos tumores cerebrais⁶. Portanto, compreender a biologia da BHT e desenvolver estratégias de entrega capazes de atravessar essa barreira tornaram-se prioridades importantes na neuro-oncologia.

Até o momento, as características e os mecanismos de transformação da BHE foram apenas parcialmente descritos, e as opções terapêuticas eficazes para metástase cerebral de câncer de mama (MCCM) ainda são limitadas na prática clínica. Um dos desafios é a disponibilidade limitada de amostras clínicas provenientes de metástases cerebrais, juntamente com a escassez e a caracterização funcional incompleta dos modelos existentes da BHE. Modelos animais in vivo, particularmente modelos de camundongo^7,8, ainda são amplamente utilizados na pesquisa da BHE. No entanto, esses modelos apresentam limitações, incluindo diferenças entre espécies, baixo rendimento e dificuldades na padronização e reprodutibilidade, o que pode dificultar estudos mecanicistas e o desenvolvimento de fármacos^9,10. Além disso, os modelos in vitro atuais da BHE geralmente utilizam culturas em co-cultivo de células tumorais e células associadas à barreira em sistemas de insertos para cultivo celular ou em chips microfluídicos.

Esses modelos existentes frequentemente carecem da estrutura tridimensional de tumores e, portanto, são limitados na reprodução de características espaciais relevantes para metástases cerebrais, incluindo gradientes de densidade celular, regiões hipóxicas/necróticas, difusão molecular restrita e distribuição celular heterogênea^11,12. Para introduzir um componente tumoral tridimensional definido, empregamos um modelo de esferoide que é simples, reprodutível e compatível com aplicações de triagem. Com base nisso, desenvolvemos um compartimento BBB humano multicelular simplificado in vitro e o integramos com esferoides tumorais para construir um modelo BTB simplificado (Figura 1A) que reproduz características estruturais e celulares selecionadas do microambiente metastático cerebral. O modelo é fácil de operar, permite medições quantitativas da barreira e possibilita a visualização de alterações espaciais nas populações astrocíticas e microgliais associadas ao tumor.

Este protocolo detalha os passos críticos desde o preparo e semeadura das células até a geração de esferoides tumorais, sobreposição com matriz de membrana basal, preparo de controles pareados e transferência dos esferoides, fornecendo um fluxo de trabalho padronizado para a construção deste modelo simplificado da BHE.

Protocolo

Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e foi aprovado pelo Comitê de Ética do Segundo Hospital da Universidade Médica de Dalian (Número de Aprovação: JW2026-019-01). Todos os dados relacionados aos pacientes foram anonimizados antes da análise. As ferramentas de pesquisa utilizadas neste protocolo estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Preparação do modelo de barreira hematoencefálica (BHE)

1. Requisitos gerais
   1. Realize todas as operações em uma cabine de fluxo laminar estéril e siga rigorosamente a técnica asséptica.
   2. Utilize inserts para cultivo celular de 12 poços com membranas de PET com porosidade de 0,4 µm e área efetiva da membrana de 1,12 cm².
2. Revestimento com colágeno tipo I
   1. Adicione 1–2 mL de solução de revestimento com colágeno tipo I a cada frasco ou placa de cultivo celular e distribua uniformemente sobre a superfície inferior.
   2. Adicione 200 µL e 800 µL da solução de revestimento aos lados apical e basal de cada insert para cultivo celular, respectivamente. Agite suavemente a placa para garantir contato completo da membrana, evitando bolhas sob a membrana.
   3. Incube os recipientes e inserts revestidos a 37 °C com 5% de CO₂ por 1 h. Remova a solução de revestimento e lave duas vezes com PBS.
   4. Mantenha os frascos, placas e inserts para cultivo celular revestidos a 37 °C com 5% de CO₂ e utilize-os dentro de 3 dias. Enxágue uma vez com PBS imediatamente antes do uso.
   5. Revesta os recipientes de cultivo para HBMEC e HA com colágeno tipo I antes do cultivo celular. As células HMC3-RFP não requerem revestimento com colágeno tipo I.
3. Preparação da solução de revestimento com colágeno tipo I
   1. Dissolva 60 µL de ácido acético glacial em 50 mL de água ultrapura e resfrie a solução a 4 °C.
      ATENÇÃO: O ácido acético glacial é corrosivo. Manipule-o em uma cabine de exaustão química, utilizando equipamento de proteção individual apropriado, incluindo luvas, jaleco de laboratório e proteção ocular. Descarte os resíduos de ácido acético conforme os procedimentos institucionais de descarte de resíduos químicos.
   2. Filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,22 µm, adicione 500 µL de colágeno tipo I (9,45 mg/mL), homogeneíze bem e armazene a 4 °C até o uso.
4. Preparação das células
   1. Cultive as células HBMEC, HA e HMC3-RFP até atingirem 80%–90% de confluência antes do uso.
      ATENÇÃO: Linhagens celulares derivadas de humanos e materiais associados a tecidos humanos devem ser manipulados como potencialmente biohazard. Siga os procedimentos institucionais de biossegurança e utilize equipamento de proteção individual apropriado. Descarte os materiais de cultivo contaminados como resíduo biohazard.
5. Plaquetação de HBMECs no Dia 0
   1. Desprenda as HBMECs utilizando protease recombinante tipo tripsina (1×), centrifugue as células e re-suspenda o pellet para obter uma suspensão unicelular.
   2. Determine a densidade celular e ajuste a suspensão para que 120 µL contenha 1,5 × 10⁵ HBMECs para cada insert de cultivo celular.
   3. Inverta a placa e adicione 120 µL da suspensão de HBMEC ao lado basal da membrana porosa. Evite a formação de bolhas de ar durante a semeadura (Figura 1B).
   4. Cubra os poços, mantenha a placa de 12 poços invertida e incube por 6 h.
   5. Retorne a placa à posição normal, adicione 200 µL e 800 µL de meio de cultura completo ECM às câmaras superior e inferior, respectivamente, e continue a incubação.
6. Plaquetação de HA e células HMC3-RFP no Dia 1
   1. Desprenda as células HA com protease recombinante tipo tripsina (1×) e as células HMC3-RFP com tripsina-EDTA 0,25%. Centrifugue e re-suspenda os dois tipos celulares separadamente.
   2. Determine as densidades celulares e combine 2,0 × 10⁵ células HA com 4,0 × 10³ células HMC3-RFP para cada insert de cultivo celular.
   3. Centrifugue as células misturadas, descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 200 µL de meio completo misto (meio completo AM : meio completo MEM = 5:1). Adicione a suspensão de 200 µL uniformemente à câmara superior, evitando bolhas de ar (Figura 1B). 
   4. Adicione 800 µL de meio de cultura completo ECM à câmara inferior, mantenha a placa na posição normal no incubador e troque o meio diariamente.

2. Preparação de esferoides tridimensionais de tumor

1. Preparação de células SK-BR-3
   1. Cultive as células SK-BR-3 até atingirem 80%–90% de confluência antes de prosseguir para a formação de esferoides.
   2. Desprenda as células SK-BR-3 com tripsina-EDTA a 0,25%, centrifugue as células e ressuspenda o pellet para obter uma suspensão unicelular.
   3. Determine a densidade celular e ajuste a suspensão para que cada gota de 30 µL contenha 2 × 10⁴ células.
2. Formação de gotas suspensas
   1. Inverta uma placa de cultura celular de 10 cm e dispense gotas de 30 µL da suspensão celular na tampa da placa. Coloque aproximadamente 20 gotas em cada tampa.
   2. Recoloque a base da placa e inverta rapidamente a placa montada (Figura 1B). Prepare novamente as gotas caso escorram da tampa ou percam sua forma.
3. Cultivo de esferoides
   1. Adicione 5 mL de PBS à placa e coloque-a no incubador. Não perturbe a placa durante os primeiros 2 dias de cultivo.
   2. Para cultivo de longo prazo, adicione 10 µL de meio de cultura completo a cada gota a cada 2 dias.
   3. Adicione o meio a partir da borda de cada gota com a ponteira da pipeta e evite o contato com os esferoides tumorais.

3. Preparação do modelo simplificado da barreira sangue-tumor (BTB)

1. Preparação dos materiais
   1. Revestir os recipientes para cultivo celular e os insertos de cultivo celular (membrana PET, 0,4 µm de diâmetro de poro) com colágeno tipo I e mantê-los no incubador até o uso.
   2. Cortar as pontas de pipetas de 200 µL com tesoura e esterilizar as pontas modificadas por autoclave.
2. Estabelecimento do modelo
   1. Dia 0–1: Construir o modelo de BHE e preparar esferoides tumorais conforme descrito acima.
   2. Dia 2: Descongelar a matriz da membrana basal em gelo. Remover o meio de cultura de ambas as câmaras e lavar ambas as câmaras com PBS.
   3. Adicionar 800 µL de meio completo de ECM à câmara inferior e 30 µL de matriz da membrana basal descongelada à câmara superior. Espalhar uniformemente a matriz da membrana basal sobre a membrana porosa.
   4. Incubar a placa a 37 °C por 20 min, depois adicionar lentamente 200 µL de meio completo misto (AM:MEM = 5:1) ao longo da parede lateral da câmara superior. Retornar a placa ao incubador (Figura 1B).
   5. Manter a matriz da membrana basal em gelo e trabalhar rapidamente. Usar uma ponta de pipeta pré-resfriada ao aspirar a matriz da membrana basal.
3. Controle combinado sem esferoide/matriz da membrana basal
   1. Preparar insertos de controle usando o mesmo volume de matriz da membrana basal (30 µL), composição do meio, etapas de lavagem, tempos de incubação e cronograma diário de troca de meio da condição de BHE, mas omitir a transferência de esferoides tumorais no Dia 3. Assim, o controle combinado difere da condição de BHE pela presença ou ausência de esferoides tumorais, e não pela exposição ou manipulação da matriz da membrana basal.
4. Transferência de esferoides tumorais no Dia 3
   1. Examinar os esferoides tumorais sob microscópio invertido e confirmar que possuem formato regular e formaram esferoides compactos.
   2. Aspirar os esferoides tumorais para tubos microcêntrifugos de 1,5 mL usando uma ponta de pipeta cortada e lavá-los duas vezes com PBS. Manipular os esferoides com cuidado para evitar sua desintegração.
   3. Substituir o meio na câmara inferior e remover o meio de cultura da câmara superior.
   4. Transferir cinco esferoides tumorais para cada câmara superior usando uma ponta de pipeta cortada.
   5. Adicionar 200 µL de meio completo de cultura misto (AM:MEM = 5:1) à câmara superior e agitar suavemente a placa para evitar que os esferoides entrem em contato ou se fundam (Figura 1B).
   6. Manter a placa no incubador e trocar o meio diariamente.
5. Coleta de amostras
   1. Coletar amostras no Dia 7 para experimentos subsequentes, ou ajustar o tempo de coleta conforme as exigências experimentais.

4. Medição da resistência elétrica transendotelial (TEER)

1. Preparação dos eletrodos
   1. Carregue completamente o medidor de TEER e imerja os eletrodos tipo "chopstick" em etanol 75% por 15 min.
      ATENÇÃO: O etanol é inflamável. Mantenha o etanol 75% afastado de chamas abertas, faíscas e outras fontes de ignição, e manipule-o de acordo com os procedimentos institucionais de segurança química.
   2. Exponha a cabine de segurança biológica à luz ultravioleta por 30 min para esterilização. Não exponha diretamente os eletrodos à irradiação ultravioleta.
   3. Remova os eletrodos do etanol, equilibre-os em PBS por 15 min e seque-os em condições estéreis.
2. Equilíbrio dos suportes de cultura celular
   1. Retire a placa de 12 poços contendo os suportes de cultura celular do incubador e deixe-a em repouso à temperatura ambiente por 15 min antes da medição.
3. Medição da resistência
   1. Prepare um suporte de cultura celular em branco, sem células, com 200 µL e 800 µL do mesmo meio de cultura completo nas câmaras superior e inferior, respectivamente.
   2. Insira cuidadosamente os eletrodos tipo "chopstick" ao longo da borda do suporte de cultura celular, sem tocar na membrana porosa ou no fundo do poço.
   3. Lave os eletrodos com PBS e seque-os. Meça cada suporte contendo células utilizando o mesmo procedimento e registre a resistência como R₍medida₎.
4. Cálculo do TEER
   1. Calcule o valor da resistência elétrica transepitelial (TEER) utilizando a seguinte fórmula¹³:
      TEER (Ω·cm²) = (R₍medida₎ − R₍branco₎ × S    (1.1)
   2. R₍medida₎ é a resistência através da membrana porosa contendo a camada celular (Ω); R₍branco₎ é a resistência através de uma membrana porosa sem células (Ω); e S é a área efetiva da membrana (cm²). A área efetiva da membrana utilizada neste estudo é de 1,12 cm².

5. Ensaio de permeabilidade paracelular com FITC-dextrana (direção apical para basal)

1. Preparação do dextran-FITC
   1. Prepare uma solução estoque de dextran-FITC (4 kDa) a 2 mg/mL antes do experimento e proteja-a da luz.
2. Interpretação da direção do ensaio
   1. Interprete o presente ensaio como uma leitura da integridade da barreira paracelular de ápice para basal, pois as HBMECs estão aderidas à face basal da membrana, enquanto astrócitos, micróglia e esferoides tumorais ocupam o compartimento apical.
      NOTA: Para estudos destinados a simular exposição sistêmica, introduza o dextran-FITC ou um composto em teste no compartimento inferior/basal voltado para o endotélio e colete amostras do compartimento superior/apical utilizando um esquema de coleta separadamente validado e cálculo de Papp.
3. Lavagem e equilibração
   1. Remova todo o meio de cultura de ambas as câmaras. Adicione 400 µL e 1 mL de meio basal DMEM sem glicose pré-aquecido ao compartimento superior e inferior, respectivamente, lave suavemente uma vez e descarte o meio.
   2. Adicione 400 µL e 1 mL de meio basal DMEM sem glicose fresco e pré-aquecido ao compartimento superior e inferior, respectivamente. Equilibre a 37 °C com 5% de CO₂ por 15 min e, em seguida, aspire todo o líquido.
4. Medição da permeabilidade
   1. Adicione 200 µL da solução estoque de dextran-FITC a 2 mg/mL ao lado apical e 800 µL de meio basal DMEM sem glicose ao compartimento inferior. Incube a 37 °C com 5% de CO₂ por 30 min no escuro.
   2. Após 30 min, colete 100 µL de meio do compartimento inferior de cada inserto experimental. Transfira três alíquotas de cada inserto para uma placa preta de 96 poços e proteja-as da luz.
5. Preparação da curva-padrão de dextran-FITC
   1. Prepare padrões de dextran-FITC nas concentrações de 0, 0,5, 1,0 e 1,5 mg/mL. Adicione 100 µL de cada padrão a uma placa preta de 96 poços em triplicata e proteja a placa da luz.
6. Medição de fluorescência e cálculo de Papp
   1. Meça a intensidade de fluorescência utilizando um leitor multifuncional de microplacas com comprimento de onda de excitação de 492 nm e comprimento de onda de emissão de 520 nm. Registre os dados e calcule o coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) utilizando as seguintes equações¹⁴.
   2. Primeiro, faça o ajuste linear das concentrações das soluções padrão de dextran-FITC (C) em relação às intensidades de fluorescência correspondentes (A) para gerar uma curva-padrão:
       A = kC + b    (1.2)
   3. Aqui, k representa a inclinação da curva-padrão e b representa o intercepto.
   4. Em seguida, substitua a intensidade de fluorescência da amostra (A_t) medida no tempo t na equação da curva-padrão para obter a concentração de dextran-FITC (C_a) no lado basolateral no tempo t. Depois, substitua C_a na seguinte fórmula para calcular o Papp (cm/s):
   5. Papp = (C_a × V_a)/(t × S × C₀)  (1.3)
   6. Aqui, V_a é o volume total basolateral (mL); t é o tempo de permeação (s); S é a área efetiva da membrana porosa (cm²); e C₀ é a concentração inicial no lado apical.

6. Coloração por imunofluorescência

1. Fixação, lavagem e permeabilização
   1. Remova todo o meio de cultura dos insertos de cultura celular, lave duas vezes com PBS e aspire todo o líquido residual.
   2. Adicione 200 µL e 800 µL de paraformaldeído a 4% nas câmaras superior e inferior, respectivamente, e fixe as células durante a noite a 4 °C.
      ATENÇÃO: O paraformaldeído é perigoso e deve ser manipulado em uma capela química certificada, utilizando luvas, jaleco de laboratório e proteção ocular. Colete os resíduos de paraformaldeído separadamente e descarte de acordo com os procedimentos institucionais para resíduos perigosos.
   3. Remova o paraformaldeído e adicione 200 µL e 800 µL de PBS nas câmaras superior e inferior, respectivamente. Lave em agitador por três vezes, durante 5 min cada.
   4. Adicione 200 µL e 800 µL de surfactante não iônico a 0,5% nas câmaras superior e inferior, respectivamente, e permeabilize por 10 min à temperatura ambiente.
   5. Remova a solução de surfactante não iônico e lave com PBS três vezes, durante 5 min cada.
2. Ressecção da membrana e bloqueio
   1. Inverta os insertos de cultura celular sobre a tampa de uma placa de cultura celular, resseque cuidadosamente as membranas porosas ao longo da borda com um bisturi e transfira-as para uma placa de 24 poços.
   2. Adicione 200 µL de BSA a 3% em PBS para cobrir cada membrana e realize o bloqueio por 90 min à temperatura ambiente. Se necessário, corte as membranas em pedaços menores para coloração separada.
3. Incubação com anticorpo primário
   1. Dilua os anticorpos primários com diluente padrão para anticorpos e adicione volume suficiente para cobrir completamente cada membrana.
   2. Adicione água ultrapura aos poços vazios ao redor para reduzir a evaporação e incube as amostras durante a noite a 4 °C. Utilize amostras sem anticorpo primário específico como controles negativos.
   3. No dia seguinte, remova a solução de anticorpo primário e lave as membranas com 1 mL de PBS em agitador por três vezes, durante 10 min cada.
4. Coloração com anticorpo secundário e DAPI
   1. Dilua os anticorpos secundários com diluente para anticorpos fluorescentes em condições protegidas da luz, cubra completamente as membranas e incube por 90 min à temperatura ambiente. Lave com PBS três vezes, durante 10 min cada, mantendo proteção contra a luz.
   2. Adicione solução de coloração com DAPI pronta para uso para cobrir as membranas e incube por 15 min à temperatura ambiente. Lave com PBS três vezes, durante 10 min cada, mantendo proteção contra a luz.
5. Clareamento, montagem e obtenção de imagens
   1. Adicione volume apropriado de reagente de clareamento para cultivo celular tridimensional para cobrir as membranas e incube por 15 min à temperatura ambiente em condições protegidas da luz.
   2. Transfira as membranas para lâminas de vidro com pinça oftálmica, adicione meio de montagem com agente antidesvanecimento e monte as amostras em condições protegidas da luz. Observe e obtenha imagens das amostras utilizando um microscópio confocal de varredura a laser.

7. Relatório estatístico

1. Para as comparações funcionais, n = 3 indica três réplicas biológicas independentes por condição, e cada réplica biológica foi considerada como unidade experimental. Pontos de dados individuais para as três réplicas biológicas. Os dados são apresentados como média ± DP. Realize as comparações utilizando testes t de Student não pareados bicaudais, com valores exatos de t e p.

Figura 1: Ilustração esquemática e fluxo de construção do modelo BTB. (A) HBMECs foram semeadas no lado basal da membrana porosa do inserto de cultura celular, enquanto células HA e células HMC3-RFP foram distribuídas no lado apical. Uma camada de matriz da membrana basal foi utilizada para separar os esferoides tumorais do compartimento celular da barreira. Para o controle isento de esferoides correspondente, foi utilizada a mesma cobertura de matriz da membrana basal e o mesmo manuseio, mas os esferoides tumorais foram omitidos. (B) Os números circulados na parte superior indicam os respectivos dias de cultivo. A construção da BBB e o preparo dos esferoides tumorais foram realizados simultaneamente. Após a adição de uma camada de matriz da membrana basal na superfície superior do inserto de cultura celular, os esferoides tumorais foram transferidos para a câmara superior utilizando uma ponteira de pipeta cortada. O modelo BTB foi então mantido em cultivo por até 1 semana antes da coleta das amostras. Normalmente, as amostras podem ser coletadas no Dia 7 para experimentos subsequentes. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Resultados

In the matched spheroid-free BBB control overlaid with the same amount of basement membrane matrix, HMC3-RFP signals were distributed relatively broadly across the apical cell layer (Figure 2). In the BTB condition, endpoint images showed HMC3-RFP signals mainly in regions not covered by tumor spheroids, with reduced signal beneath the spheroids and in immediately adjacent regions (Figure 2). These data demonstrate a spatial association between the presence of tumor spheroids and the endpoint distribution of HMC3-RFP cells. Because baseline HMC3-RFP distribution before spheroid introduction and longitudinal cell tracking were not assessed, the present data do not establish active microglial migration, repulsion, or tumor-driven exclusion.

Astrocytes also showed differences in marker signal and morphology in the BTB condition (Figure 2). Compared with the matched spheroid-free/basement membrane matrix control, representative images suggested stronger GFAP fluorescence in both peri-spheroid and distal regions. Astrocytes at the spheroid margin displayed enlarged cell bodies, thicker and elongated processes, and processes oriented toward the spheroid edge (Figure 2). These endpoint features are consistent with a reactive astrocyte-like phenotype, but they do not by themselves establish a specific reactive-astrogliosis program or its underlying mechanism. Morphologically similar peritumoral astrocytic structures were observed in human breast cancer brain-metastasis tissue sections, where immunofluorescence staining showed features consistent with peritumoral reactive astrogliosis (Figure 3A). To further characterize AQP4-associated astrocytic features, AQP4 immunofluorescence staining was performed in the matched spheroid-free BBB model and in the distal and peri-spheroid regions of the BTB model (Figure 3B). Representative images of the BBB model, the distal region of the BTB model, and the peri-spheroid region adjacent to the tumor spheroids are shown in the first, second, and third rows, respectively (Figure 3B). Within the BTB model, peri-spheroid astrocytes showed morphological differences compared with distal astrocytes. Taken together, the GFAP/AQP4 and morphological observations support tumor-spheroid-associated astrocytic remodeling within this model; the resemblance to patient tissue should be interpreted as phenotypic similarity rather than evidence that the model fully reproduces human peritumoral astrogliosis.

To evaluate tumor-spheroid-associated changes in endothelial junctional organization, we performed immunofluorescence staining of the tight-junction protein ZO-1 in the basal HBMEC layer of the simplified BBB and BTB models, using matched spheroid-free and spheroid-containing conditions overlaid with equal amounts of basement membrane matrix. Confocal imaging was focused on the region corresponding to the tumor spheroids (Figure 4A). In the matched spheroid-free control, ZO-1 signals between HBMECs showed a relatively continuous, linear distribution with clearly defined intercellular borders. In the BTB condition, ZO-1 fluorescence in regions corresponding to tumor spheroids appeared sparser, with focal disruption and discontinuity (Figure 4A). These endpoint images are consistent with local loss of tight-junction organization. However, without additional BTB-specific molecular markers or mechanistic perturbation experiments, the present data cannot distinguish specific BTB remodeling from nonspecific tumor-associated endothelial injury or barrier disruption.

At the functional level, TEER measurement and FITC-dextran permeability assays were performed simultaneously on Day 7 in the matched spheroid-free/basement membrane matrix control and the spheroid-containing BTB condition (Figure 4B). Individual values from all three independent biological replicates are displayed as scatter points in Figure 4B, with summary data presented as mean ± SD. The TEER value of the BTB condition (106.0 ± 9.5255 Ω·cm², n = 3 independent biological replicates) was lower than that of the matched control (168.0 ± 5.1325 Ω·cm², n = 3 independent biological replicates). Consistently, the apparent permeability coefficient (Papp) measured in the apical-to-basal FITC-dextran assay was higher in the BTB condition (5.851 ± 1.2080 × 10⁻³ cm/s, n = 3 independent biological replicates) than in the matched control (2.656 ± 1.0937 × 10⁻³ cm/s, n = 3 independent biological replicates). Two-tailed unpaired Student’s t-tests showed statistically significant differences [TEER: t(4) = 9.920, p = 0.0006; Papp: t(4) = 3.395, p = 0.0274] (Figure 4B). Within this experimental configuration, the concordant reduction in electrical resistance and increase in FITC-dextran permeability demonstrate reduced barrier integrity in the presence of tumor spheroids. These measurements alone do not establish a specific BBB-to-BTB remodeling mechanism, and the apical-to-basal FITC-dextran assay should not be interpreted as a physiological blood-to-tumor drug-delivery experiment.

Figure 2: Immunofluorescence staining in the BTB model. Representative immunofluorescence images of Pan-CK and GFAP staining in the apical cell layers of the matched spheroid-free BBB control and BTB model, both overlaid with equal amounts of basement membrane matrix, with the HMC3-RFP signal also shown. The first column presents schematic illustrations, and the black square indicates the viewing area for confocal imaging. The first row shows the matched control without a spheroid (No Spheroid); the second row shows regions distal to the tumor spheroids in the BTB model (Distal Region); and the third row shows regions adjacent to the tumor spheroids in the BTB model (Peri-spheroid Region). Arrows indicate regions showing astrocytic morphological features consistent with a reactive phenotype. Cell nuclei were counterstained with DAPI (blue), tumor cells were labeled with pan-cytokeratin (Pan-CK; green), RFP-expressing microglia are shown in red, and GFAP staining is shown in cyan. Scale bar = 100 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 3: Immunofluorescence staining reveals morphological features consistent with peritumoral reactive astrogliosis in the BTB model. (A) Brain tissue sections from patients with breast cancer brain metastases were subjected to H&E staining. Astrocytic structures at the interface between tumor tissue and brain parenchyma or blood vessels showed morphological features consistent with peritumoral reactive astrogliosis. Black arrows indicate representative regions. Immunofluorescence staining further showed astrocytic morphological features consistent with a reactive phenotype; the red arrow highlights a representative region. Scale bars: 50 µm for the H&E-stained images in the first row, 10 µm for the H&E-stained images in the second row, and 50 µm for the immunofluorescence images in the third row. (B) AQP4 immunofluorescence staining was performed in the matched spheroid-free BBB model and in the distal and peri-spheroid regions of the BTB model. The first row shows representative images of the BBB model, the second row shows representative images of the distal region of the BTB model, and the third row shows representative images of the peri-spheroid region adjacent to the tumor spheroids. Arrows indicate astrocytic morphological changes in the peri-spheroid region. Nuclei were stained with DAPI and are shown in blue, while AQP4 is shown in yellow. Scale bar = 100 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 4: Functional characterization of the BTB model. (A) Immunofluorescence staining of ZO-1 in the basal endothelial cell layer of the BBB and BTB models overlaid with an equal amount of basement membrane matrix. The first column shows schematic diagrams, with black boxes indicating the regions selected for confocal imaging. The first row shows representative images of the basal cell layer in the BBB model without tumor spheroids (No Spheroid), and the second row shows representative images of the basal cell layer in the BTB model with tumor spheroids (With Spheroid). The red arrow highlights a region with sparse ZO-1 fluorescence and focal discontinuities. Nuclei were stained with DAPI and are shown in blue, while ZO-1 is shown in green. Scale bar = 50 µm. (B) TEER values and FITC-dextran (4 kDa) apparent permeability coefficients (Papp) of the matched spheroid-free BBB control (No Spheroid) and the BTB condition (With Spheroid), both overlaid with an equal amount of basement membrane matrix. n = 3 independent biological replicates per condition. Individual data points for all three biological replicates are shown, and summary data are presented as mean ± SD. FITC-dextran Papp values were obtained in the apical-to-basal direction. Please click here to view a larger version of this figure.

Discussão

Um modelo de esferoide foi utilizado para introduzir um componente tridimensional de tumor que fornece organização espacial e restrições de difusão não capturadas pelo cultivo convencional de células tumorais em duas dimensões. Sua simplicidade e reprodutibilidade também o tornam compatível com fluxos de trabalho orientados para triagem. Os esferoides foram combinados com um compartimento de barreira humano de três células contendo células endoteliais microvasculares cerebrais, astrócitos e micróglia para construir um modelo simplificado in vitro humano multicelular da BHE. O sistema é fácil de operar, compatível com cultivo em placas de múltiplos poços e com medições quantitativas da barreira (Figura 1) e permite a visualização da morfologia celular e da distribuição espacial por meio de coloração por imunofluorescência. As alterações astrogliais associadas à GFAP/AQP4 observadas e sua semelhança morfológica com astrócitos peritumorais em tecido de metástase cerebral de câncer de mama apoiam a relevância do modelo para o estudo de interações tumorais–gliais–endoteliais selecionadas⁵, embora esses achados não estabeleçam equivalência com a BHE humana completa.

O método da gota suspensa foi utilizado para gerar esferoides tumorais, os quais foram co-cultivados com células endoteliais microvasculares humanas do cérebro, astrócitos humanos e microglia humana para estabelecer uma plataforma in vitro humana multicelular simplificada da BBT. Nas condições testadas, os esferoides tumorais estiveram associados à redução da resistência elétrica transepitelial (TEER), aumento da permeabilidade apical para basal ao dextrano-FITC, alteração na organização da ZO-1 e mudanças nos marcadores e na morfologia dos astrócitos. As medições de TEER e permeabilidade são abordagens estabelecidas para avaliar a integridade da barreira em sistemas de barreira in vitro^13,14. Esses achados demonstram prejuízo da barreira associado aos esferoides tumorais e remodelamento glial dentro desse sistema definido. No entanto, esta plataforma da BBT não estabelece a transformação completa da BBB para BBT, a migração ativa de microglia nem um mecanismo molecular específico do remodelamento da BBT. A plataforma deve, portanto, ser considerada como um modelo experimental viável para geração de hipóteses e estudos controlados das interações tumorais–gliais–endoteliais, sendo necessários ensaios de transporte com direcionalidade apropriada ao modelar a administração sistêmica de fármacos.

Este modelo simplificado apresenta várias limitações importantes. Primeiro, ele não contém a unidade neurovascular completa nem o microambiente cérebro-tumor. Pericitos, neurônios, uma membrana basal/matriz extracelular fisiologicamente completa e células imunes circulantes estão ausentes. Os pericitos são reguladores importantes da função neurovascular e da barreira^15,16,17, mas sua incorporação em um modelo humano in vitro padronizado permanece desafiadora devido à disponibilidade limitada e à variabilidade lote-a-lote dos pericitos humanos primários. Portanto, este modelo não deve ser descrito como uma BHE (barreira hematoencefálica) tumoral humana completa, mas sim como uma plataforma experimental simplificada. Segundo, o presente estudo utiliza a linhagem celular SK-BR-3 como um único modelo de câncer de mama. Os fenótipos observados, portanto, não podem ser generalizados para a biologia geral das metástases cerebrais de câncer de mama (BCBM). A validação com subtipos adicionais de câncer de mama, modelos com tropismo cerebral e esferoides ou organoides derivados de pacientes será importante para estabelecer a generalização e a relevância clínica. Terceiro, os dados atuais com HMC3-RFP são observações de ponto final e não permitem determinar se o padrão espacial resulta de migração ativa, sobrevivência diferencial ou distribuição pré-existente. Seria necessário um acompanhamento longitudinal por imagem em tempo real para distinguir essas possibilidades. Quarto, os dados de ZO-1, TEER e FITC-dextrano comprovam a alteração da barreira, mas não distinguem um remodelamento específico da BHE de uma lesão endotelial inespecífica; caracterizações moleculares adicionais e controles mecanicistas são necessários. Quinto, como os HBMECs são semeados na face basal da membrana nesta configuração, o ensaio de FITC-dextrano apical-a-basal relatado é uma medida da integridade da barreira, e não um ensaio fisiológico de transporte do sangue para o tumor. Estudos de administração sistêmica devem introduzir o traçador ou fármaco no compartimento inferior/basal voltado para o endotélio e validar o transporte em direção ao compartimento tumoral superior/apical. Por fim, as medidas funcionais atuais foram baseadas em três réplicas biológicas independentes por condição. Embora este delineamento permita distinguir replicação biológica de replicação técnica, aumentar o número de réplicas biológicas independentes fortaleceria ainda mais a avaliação da reprodutibilidade. A incorporação desses aperfeiçoamentos, incluindo pericitos e materiais derivados de pacientes, poderia aumentar progressivamente a relevância fisiológica e translacional da plataforma.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tripsina-EDTA 0,25% (1×) (para destacar células HMC3-RFP)	NCM Biotech	C100C1	Utilizado para destacar células HMC3-RFP durante a preparação celular.
Tubos de centrífuga de 1,5 mL	Jet Biofil	CFT001015	Utilizados para coletar, lavar e manipular esferoides tumorais.
Placa de cultura celular de 12 poços	Jet Biofil	TCP011012	Utilizada para acomodar inserts de cultura celular de 12 poços durante a construção do modelo BBB/BTB.
Reagente de clareamento para cultura celular 3D	Thermo Fisher	V11326	Utilizado para clarear membranas de cultura celular coradas antes do montagem e da imagem confocal.
Anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor 488 anti-coelho	Proteintech	RGAR002	Anticorpo secundário fluorescente utilizado para detecção por imunofluorescência de anticorpos primários de coelho.
Anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor 647 anti-rato	Proteintech	RGAM005	Anticorpo secundário fluorescente utilizado para detecção por imunofluorescência de anticorpos primários de rato.
Diluente para anticorpos	Solarbio	A1800	Utilizado para diluir anticorpos primários em coloração por imunofluorescência.
Meio de montagem com proteção contra desvanecimento	Solarbio	S2100	Utilizado para montar membranas coradas e reduzir o desvanecimento da fluorescência durante a imagem.
Suplemento de Crescimento para Astrócitos (AGS)	ScienCell	1852	Suplemento utilizado no cultivo de astrócitos humanos.
Meio para Astrócitos (AM)	ScienCell	1801	Meio de cultura utilizado para astrócitos humanos e como componente do meio misto da câmara superior.
Placa de cultura celular	Servicebio	CCD-100	Utilizada para cultura celular de rotina e preparação de esferoides tumorais por método de gota suspensa.
Colágeno Tipo I	Corning	354249	Utilizado para revestir recipientes de cultura e inserts de cultura celular antes da semeadura celular.
Cobrimentos	Citotest	10212450C	Utilizados para montagem e preparação para microscopia.
Solução de coloração com DAPI	Servicebio	G1012-10ML	Utilizada para contracoloração nuclear durante a coloração por imunofluorescência.
DMEM básico (1×)	Gibco	C11995500BT	Utilizado como meio basal no ensaio de permeabilidade com dextrano-FITC.
Suplemento de Crescimento para Células Endoteliais (ECGS)	ScienCell	1052	Suplemento utilizado no cultivo de células endoteliais microvasculares cerebrais humanas.
Meio para Células Endoteliais (ECM)	ScienCell	1001	Meio de cultura utilizado para HBMECs e para a câmara inferior do modelo BBB/BTB.
Soro Fetal Bovino (FBS)	Gibco	A5669701	Suplemento sérico utilizado em meios completos de cultura celular.
Dextrano marcado com FITC (PM 4.000)	Beyotime	ST2930-50mg	Rastreador fluorescente utilizado para avaliar a permeabilidade paracelular e calcular o Papp.
Diluente para anticorpos fluorescentes	Solarbio	A1840	Utilizado para diluir anticorpos secundários fluorescentes em coloração por imunofluorescência.
Ácido acético glacial	Sigma	27225	Utilizado para preparar a solução de revestimento com colágeno tipo I.
HA	Astrócito humano	NA	Componente astrocítico para avaliação de respostas morfológicas e de marcadores associadas ao tumor
HBMEC	Células endoteliais microvasculares cerebrais humanas	NA	Componente da barreira endotelial BBB/BTB
HMC3-RFP	Linhagem celular de micróglia humana HMC3 marcada com RFP	NA	Componente microglial para rastreamento por fluorescência
Matrigel	Corning	354230	Matriz da membrana basal utilizada como camada superior para separar esferoides tumorais do compartimento celular da barreira.
Meio Completo MEM (com NEAA) (10)	Procell System	PM150410B	Meio utilizado como componente do meio de cultura misto da câmara superior.
Lâminas de microscópio	Citotest	188105	Utilizadas para montar membranas coradas removidas para imagem confocal.
Anticorpo anti-GFAP humano de rato	EMD Millipore	MAB360-25μL	Anticorpo primário utilizado para detectar GFAP em astrócitos por imunofluorescência.
Paraformaldeído	Servicebio	G1101-500ML	Utilizado para fixar células antes da coloração por imunofluorescência.
Pó de PBS (tampão fosfato salino)	Servicebio	G0002-2L	Utilizado em etapas de lavagem, equilíbrio e preparação ao longo do protocolo.
Solução de Penicilina-Estreptomicina (P/S)	Servicebio	G4003-100ML	Suplemento antibiótico utilizado em meios completos de cultura celular.
Pipeta	Eppendorf	3123000250	Utilizada para manipulação de líquidos ao longo dos procedimentos de cultura celular e ensaios.
Pontas de pipeta	MWM Bio	800201	Utilizadas para manipulação rotineira de líquidos; pontas modificadas com corte são usadas para transferência de esferoides tumorais.
Anticorpo policlonal anti-PAN-CK humano de coelho	MedChemExpress	HY-P81164	Anticorpo primário utilizado para identificar células tumorais por imunofluorescência.
Anticorpo anti-ZO-1 humano de coelho	Proteintech	21773-1-AP	Anticorpo primário utilizado para avaliar a organização das junções firmes endoteliais por imunofluorescência.
SK-BR-3	Linhagem celular de câncer de mama humano	NA	Componente de esferoide tumoral para construção da BTB
Insert de Placa de Cultura Tecidual (membrana PET, 0,4 μm), placas de 12 poços	Jet Biofil	TCS016012	Insert poroso de cultura celular utilizado para construir o modelo de cocultura BBB/BTB.
Medidor de Resistência Elétrica Transepitelial (TEER)	Millicell	ERS-2	Utilizado para medir a resistência elétrica através do insert de cultura celular como indicador de integridade da barreira.
TrypLE Express (1×) (para destacar células HBMEC e HA)	Gibco	12605-010	Utilizado para destacar células HBMEC e HA durante a preparação celular.