Este protocolo descreve um modelo ex vivo de infarto do miocárdio no coração isolado de camundongo perfundido com cristaloide. Essa abordagem contorna variáveis sistêmicas, permitindo aos pesquisadores avaliar diretamente os efeitos cardíacos na ausência de fatores extrínsecos que possam interferir na sobrevivência dos cardiomiócitos e testar intervenções farmacêuticas localizadas.
Artigo de método
Ex Vivo Modelo de Infarto do Miocárdio no Coração de Camundongo com Perfusão por Cristalóide
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O infarto do miocárdio (IM) experimental é comumente modelado em animais por meio da oclusão transitória da artéria coronária descendente anterior esquerda (DAE) ou, no nível celular, por protocolos de hipóxia-reoxigenação. Como modelo alternativo de isquemia em nível de órgão, o coração perfundido pelo método Langendorff permanece uma ferramenta fundamental para investigar os efeitos de perturbações fisiológicas e intervenções farmacológicas na cardioproteção. Aqui, apresentamos a metodologia básica e as regras fundamentais necessárias para estabelecer um modelo de isquemia/reperfusão miocárdica regional no coração isolado de camundongo. Resumidamente, após a parada cardioplégica, a DAE foi ligada após uma breve lavagem com PBS frio a 0 °C. O coração foi então montado em um aparelho Langendorff e perfundido com um tampão oxigenado rico em nutrientes a 37 °C, sob pressão constante de perfusão de 110 cmH₂O. A isquemia miocárdica foi induzida por períodos de 30, 45, 60, 90 e 120 minutos, seguidos por 90 minutos de reperfusão. A viabilidade dos cardiomiócitos e o tamanho do infarto foram avaliados por meio da coloração microscópica com cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio (TTC). Demonstramos que o modelo ex vivo de IM produziu de forma confiável lesão miocárdica reprodutível, caracterizada pela perda progressiva de cardiomiócitos viáveis na região do infarto à medida que a duração da isquemia aumentava. Além disso, foi necessário pelo menos 30 minutos de reperfusão para obter uma delimitação clara do miocárdio infartado com base na coloração com TTC. Essa abordagem contorna variáveis sistêmicas, permitindo aos pesquisadores avaliar diretamente os efeitos cardíacos na ausência de influências regulatórias extrínsecas, como fatores humorais circulantes e infiltração de células imunes, que podem confundir a evolução do IM, além de testar intervenções farmacêuticas localizadas. Assim, o modelo ex vivo de IM representa uma plataforma útil para investigar mecanismos cardioprotetores que atuam diretamente sobre os cardiomiócitos.
Introdução
Um infarto do miocárdio (IM) ocorre quando o fluxo sanguíneo coronariano para, causando morte tecidual e grave comprometimento funcional. Embora geralmente estudado em organismos inteiros, o termo pode referir-se a um IM regional restrito a estruturas cardíacas específicas, ou a modelos laboratoriais ex vivo de coração isolado (por exemplo, perfusão Langendorff) utilizados para estudar infartos na ausência de influência sistêmica1. Assim sendo, o coração perfundido pelo método de Langendorff tem servido como um modelo experimental robusto e bem estabelecido para o estudo de lesões isquêmicas miocárdicas por mais de 50 anos2.
O modelo de IM ex vivo no coração isolado oferece várias vantagens, incluindo o controle preciso do ambiente experimental e a capacidade de avaliar os efeitos diretos de intervenções, como agentes farmacológicos, sobre o miocárdio independentemente de influências sistêmicas, incluindo fatores humorais circulantes, componentes sanguíneos e regulação neuro-humoral3. Ao minimizar esses fatores de confusão, o modelo ex vivo fornece uma abordagem mais previsível e reprodutível do que os modelos in vivo e, portanto, facilita a investigação rigorosa dos processos da doença e das vias moleculares envolvidas na IM4.
Em corações isolados, a isquemia miocárdica pode ser induzida de forma global ou regional5. No modelo de IM global, o fluxo do perfusato por toda a circulação coronariana é completamente interrompido, enquanto no modelo de IM regional, apenas a artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD) é ocluída temporariamente por ligadura, resultando em lesão isquêmica restrita ao miocárdio distal ao local da ligadura. Embora o modelo de IM global seja tecnicamente simples de realizar, apresenta várias limitações que restringem sua aplicação em estudos de cardioproteção6. Uma limitação importante é que a duração da isquemia é limitada pela tolerância durável de todo o coração, dificultando a indução de isquemia prolongada e tornando improvável a ocorrência de infarto transmural comparável às situações in vivo7. Além disso, embora modelos ex vivo geralmente ofereçam excelente reprodutibilidade quando as durações de isquemia e reperfusão são cuidadosamente controladas, esses protocolos variam consideravelmente entre laboratórios. Essa variabilidade evidencia a necessidade de melhor padronização e caracterização do coração isolado de camundongo, especialmente porque muitos detalhes metodológicos críticos ainda permanecem insuficientemente descritos na literatura8.
Por outro lado, o modelo regional de infarto do miocárdio (MI) é tecnicamente mais desafiador de estabelecer. Aqui, apresentamos várias modificações e estratégias práticas para otimizar a indução de um infarto do miocárdio ex vivo confiável no coração isolado de camundongo, particularmente para avaliar intervenções farmacológicas voltadas à cardioproteção9,10. Assim, este protocolo modificado de infarto do miocárdio ex vivo, utilizando o coração de camundongo perfundido pelo método Langendorff, fornece uma plataforma eficaz para avaliar diretamente a sobrevivência miocárdica após intervenções terapêuticas.
Protocolo
O modelo de coração isolado e perfundido descrito aqui é um experimento agudo, sem sobrevida, e foi aprovado pelas autoridades locais (O1019/25, LANUV da Renânia do Norte-Vestfália, Alemanha). Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes ARRIVE e com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os equipamentos e produtos químicos necessários para os experimentos estão listados na Tabela de Materiais.
1. Configuração de um sistema de retroperfusão de Langendorff para coração isolado de camundongo
OBSERVAÇÃO: Um sistema não recirculante, impulsionado pela gravidade, foi projetado para fornecer um perfusato cristaloide oxigenado (tampão Krebs-Henseleit, KHB) ao coração isolado de camundongo, a uma pressão constante de 110 cmH2O (Figura 1A).
- Limpe o material de vidro do sistema Langendorff com HCl 0,1 M/L, etanol a 100% e, posteriormente, enxágue com água destilada antes de montar o sistema.
- Pese todos os produtos químicos necessários para o preparo de 2 L de KHB modificado de acordo com as seguintes concentrações finais (mM): 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO4·7H2O, 1,21 KH2PO4, 2,52 CaCl2·2H2O, 24,88 NaHCO3, 8,30 D-glucose, 2,0 pyruvato de sódio.
- Dissolva todos os produtos químicos, exceto o CaCl₂, em água bidestilada em um frasco de 2 L, borbulhando continuamente com Carbogênio (95% O₂/5% CO₂) por pelo menos 10 min para equilibrar o pH a 7,4.
- Adicione posteriormente o CaCl₂ à solução para evitar precipitação.
- Continue borbulhando a solução com Carbogênio por mais 10 min.
- Filtre a solução de KHB sob vácuo através de um filtro de membrana de 0,2 µm para eliminar partículas pequenas que possam obstruir a microvasculatura coronária.
- Transfira a solução de KHB filtrada para um reservatório de vidro de 2 L colocado em um banho-maria pré-aquecido mantido a 37 °C.
- Conecte o reservatório de KHB à coluna de vidro sob pressão, permitindo que o KHB oxigenado encha continuamente a coluna pela pressão gerada pelo gás Carbogênio no reservatório.
- Assegure-se de que o sistema de tubulação de saída esteja livre de bolhas de ar.
- Equilibre a solução de KHB com Carbogênio por mais 30 min antes do início do experimento.
2. Isolamento e cânulação do coração
OBSERVAÇÃO: Foram utilizados camundongos machos C57BL/6J pesando entre 20–25 g nos experimentos atuais. Todos os procedimentos experimentais devem ser devidamente documentados de acordo com as regulamentações locais, incluindo a justificativa, a data e o método de eutanásia.
- Coloque suavemente o camundongo em uma câmara de indução contendo 5% de isoflurano (v/v) para indução da anestesia.
- Confirme a profundidade anestésica pela ausência completa de resposta a um aperto firme no dedo do pé e, em seguida, transfira para a mesa cirúrgica. Eutanazie imediatamente o camundongo por dislocação cervical, conforme indicado pela ausência de respiração e perda do tônus muscular na parte inferior do corpo.
- Corte bilateralmente a caixa torácica em direção ao esterno para expor completamente o coração e a aorta ascendente.
- Segure o tecido extracardíaco com pinça e excise o coração.
- Coloque o coração em um pequeno béquer pré-resfriado contendo 50 mL de solução de KHB gelada por pelo menos 30 s para induzir o arresto cardioplégico.
NOTA: Como a atividade cardíaca é altamente sensível à temperatura, o coração é completamente arrestado pela imersão na solução de KHB gelada. - Transfira o coração para uma almofada de algodão pré-resfriada e umedecida com KHB, colocada em um recipiente metálico, onde foi montado um sistema de cânula conectado a uma válvula de três vias. (Figura 1B).
NOTA: O sistema de perfusão deve estar livre de bolhas de ar. - Prenda previamente um nó solto em meia-quina usando um fio de seda 5-0 na extremidade distal da cânula.
- Disseque cuidadosamente o timo, o tecido conjuntivo e os tecidos extracardíacos residuais (incluindo pulmões e esôfago) para expor e aparar a raiz aórtica.
NOTA: Certifique-se de que o comprimento da aorta ascendente seja adequado para uma canulação bem-sucedida. - Monte o coração na cânula e fixe-o com uma sutura previamente colocada.
- Lave o coração com 5 mL de PBS gelado para remover o sangue residual da circulação coronária.
3 Isquemia e reperfusão miocárdica ex vivo
OBSERVAÇÃO: A isquemia miocárdica global foi induzida simplesmente interrompendo a perfusão do coração, enquanto a isquemia miocárdica regional foi criada por ligadura transitória da artéria descendente anterior (LAD) sob um estereomicroscópio.
- Posicione a AD (artéria descendente anterior) no centro do campo de visão girando suavemente o coração mediante ajuste da almofada de algodão subjacente. A AD torna-se transparente e claramente distinguível do miocárdio circundante durante a perfusão com PBS.
- Passe uma agulha cônica, carregando um fio de polipropileno 8–0, sob a AD, 1 mm abaixo da margem inferior do átrio esquerdo.
OBSERVAÇÃO: Certifique-se de que a AD esteja posicionada no meio entre os dois pontos de punção para evitar lesão vascular causada pela ligadura. - Coloque um pedaço de compressa macia sobre a AD.
- Aperte firmemente o fio para interromper a perfusão distal ao local da ligadura.
- Transfira o coração canulado para o aparelho de Langendorff e inicie uma perfusão retrógrada.
- Imersa o coração no banho de órgãos com jaqueta de água para manter uma temperatura constante (37 °C) durante todo o período experimental.
- Monitore o fluxo coronariano no pico e em estado estável (Tabela 1).
- Nos pontos de tempo designados de isquemia miocárdica (ver seção de resultados), interrompa a perfusão e remova o coração canulado do aparelho de perfusão.
- Imersa imediatamente o coração em KHB gelado (4 °C) para interromper completamente a contração cardíaca.
- Coloque o coração novamente sobre a almofada de algodão na bandeja metálica pré-resfriada e libere a ligadura da AD.
- Para estudos com intervenção farmacológica, injete 5 µL de Interleucina-6 (IL-6, 0,1 mg/mL) na parede anterior infartada usando uma seringa de insulina 30 G nesta etapa.
- Remonte o coração canulado no aparelho de perfusão e retome a perfusão cardíaca (reperfusão).
4. Avaliação da lesão miocárdica e sobrevivência
OBSERVAÇÃO: A coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) marca o miocárdio viável com uma tonalidade vermelho-escura, enquanto o tecido infartado ou necrótico aparece bege após a fixação com solução de Zamboni.
ATENÇÃO: O TTC é geralmente considerado perigoso e requer manipulação cuidadosa, pois pode causar leve irritação na pele, irritação grave nos olhos e é tóxico se inalado. Descarte resíduos e sobras de acordo com os requisitos das autoridades locais.
- Interrompa a perfusão 90 min após a reperfusão e imediatamente imerja o coração em KHB gelado para interromper a contração cardíaca.
- Conecte a cânula a uma seringa de 3 mL pré-cheia com solução de coloração TTC (TTC 1% dissolvido em PBS) por meio de uma torneira de três vias.
- Infunda 1 mL da solução de TTC no coração, repita a infusão três vezes e administre um volume total de 3 mL ao longo de 15 min.
- Cubra o coração com papel de tecido umedecido para evitar secagem da superfície.
- Coloque o coração em um tubo de centrífuga contendo 3 mL de solução de TTC a 4 °C durante a noite.
- Prepare um bloco tecidual com composto de Temperatura de Corte Ótima (OCT).
NOTA: O bloco tecidual pode ser armazenado a −80 °C por vários meses até a análise posterior. - Monte o bloco tecidual no porta-blocos do criostato utilizando composto OCT.
- Seccione o coração consecutivamente em cortes de 50 µm de espessura e colete a cada 10º corte; geralmente são obtidos cerca de 8 fatias teciduais por coração.
- Alinhe todas as 8 fatias em uma única lâmina de microscópio e seque com um secador de cabelo por 2–3 min.
- Imersa as fatias em uma câmara de coloração contendo solução de Zamboni (um fixador contendo 2% de paraformaldeído e 0,4% de ácido pícrico, p/v) durante a noite a 4 °C.
CAUTELA: O fixador de Zamboni pode causar reação alérgica na pele e é suspeito de causar defeitos genéticos e carcinogênese. Descarte resíduos e sobras de acordo com as regulamentações locais. - Lave as fatias três vezes com PBS e cubra as seções com meio de montagem.
NOTA: A amostra de coração corada com TTC pode ser armazenada à temperatura ambiente por vários meses. - Adquira imagens do coração utilizando um microscópio óptico com objetiva de 1,25x e software CellSens.
- Para quantificação do tamanho do infarto, importe os arquivos de imagem para a plataforma ImageJ.
- No menu do ImageJ, selecione Image -> Adjust -> Color Threshold para abrir a janela Color Threshold (Figura 2B).
- Selecione uma pequena região de interesse (ROI) dentro da seção do coração e use o miocárdio viável vermelho-escuro e o tecido infartado/necrótico bege como referências de cor.
- Clique em Sample na janela Color Threshold e ajuste a faixa de saturação até que a região selecionada corresponda exatamente à área de cor-alvo.
- Clique em Selection para delimitar a área correspondente à cor selecionada.
- No menu do ImageJ, selecione Analyze -> Measure. A área da região selecionada, informada em pixels, será exibida na janela de Resultados.
- Exporte os dados de medição para uma planilha do Excel para cálculo do tamanho planimétrico do infarto.
- Para quantificar o miocárdio viável dentro da região infartada, delimite a região de interesse (ROI), principalmente na parede ventricular anterior infartada, onde a IL-6 foi injetada.
- Abra o ROI Manager no menu do ImageJ e clique em Add para salvar a ROI selecionada na lista de ROI (Figura 2C).
- Use as funções “Sample” e “Selection” conforme descrito acima para delimitar o miocárdio viável (vermelho-escuro).
- Adicione a área viável selecionada à lista do “ROI Manager”, depois selecione AND para obter a sobreposição entre a ROI e o miocárdio viável.
- Meça a área do miocárdio viável e calcule a taxa de sobrevivência de cardiomiócitos dentro da ROI selecionada.
NOTA: Os detalhes metodológicos para a coloração com TTC e quantificação do tamanho do infarto foram previamente descritos11.
Resultados
Na plataforma de IM ex vivo, dois protocolos isquêmicos foram avaliados no coração isolado de camundongo. A isquemia global, amplamente utilizada em estudos de IM ex vivo, resultou em lesão isquêmica heterogênea em todo o coração. Utilizando uma abordagem de detecção microscópica confiável e de alta resolução baseada em TTC12, demonstrou-se que o miocárdio atrial e a região apical foram relativamente resistentes à isquemia e permaneceram viáveis após 45 minutos de isquemia global sem fluxo (Figura 2A, painel superior). Em contraste, o IM regional induziu lesão isquêmica localizada no miocárdio distal ao local de ligadura da artéria descendente anterior (LAD). Nessas condições, porções do miocárdio subepicárdico permaneceram positivas para TTC, indicando preservação do tecido viável (Figura 2A, painel inferior). Esses achados revelam padrões distintos de sobrevivência miocárdica entre os dois protocolos isquêmicos.
A duração mínima de isquemia e reperfusão necessária para induzir de forma confiável e reprodutível infarto do miocárdio foi investigada adicionalmente no coração isolado de camundongo. A lesão miocárdica aumentou progressivamente à medida que a duração da isquemia foi prolongada de 30 min a 120 min (Figura 3A). Notavelmente, o tamanho do infarto mais que dobrou entre 30 min (n = 3) e 45 min (n = 5) de isquemia e aparentemente atingiu um platô quando a duração isquêmica foi estendida para 60 min (n = 5), 90 min (n = 4) e 120 min (n = 3) (Figura 3B). Esses achados indicam que a viabilidade miocárdica é altamente sensível à duração isquêmica além de 30 min. Em comparação com o modelo de infarto do miocárdio in vivo (ivMI, n = 5), o modelo de infarto do miocárdio ex vivo (evMI, n = 8) produziu tamanhos de infarto quase idênticos sob durações comparáveis de isquemia e reperfusão (36,88% ± 3,91% vs. 37,8% ± 2,17%, p = 0,27), sugerindo que a lesão miocárdica não foi substancialmente afetada pela perfusão com cristaloide. No entanto, os corações evMI exibiram paredes ventriculares mais espessas e um lúmen ventricular reduzido, provavelmente devido ao edema miocárdico associado à perfusão com cristaloide (Figura 3C).
Aproveitando o ambiente relativamente controlado, livre de influências extracardíacas, foram avaliados os efeitos cardioprotetores da administração intramiocárdica de IL-6. Em corações controle tratados com PBS, cardiomiócitos viáveis dispersos, mas mensuráveis (CMs viáveis; vermelho intenso) permaneceram detectáveis dentro da região infartada/necrótica (bege), mesmo após 45 min de isquemia (Figura 4; 1,05% ± 0,44%, erro padrão da média, n = 4). Notavelmente, a administração intramiocárdica de IL-6 (i.m.; setas) aumentou significativamente a quantidade de CMs viáveis, que se localizaram predominantemente ao redor do local de injeção dentro da região de interesse (ROI; 4,08% ± 0,99%, erro padrão da média, n = 6; p = 0,005, teste t de Student). Esses achados sugerem que a IL-6 pode potencializar a sobrevivência de cardiomiócitos após lesão isquêmica.
Por fim, o modelo atual de IM ex vivo apresenta várias armadilhas potenciais que podem afetar a reprodutibilidade dos resultados experimentais. Conforme demonstrado na Figura 5, o deslizamento da ligadura pode resultar em oclusão inadequada da AD e na sobrevida extensa do miocárdio (4/168); ao mesmo tempo, pode ocorrer reperfusão incompleta quando ramos da AD são danificados (12/168). Além disso, a embolização aérea durante a cânula da aorta também pode causar lesão miocárdica (setas, 7/168), dificultando a distinção entre lesão isquêmica e lesão embólica para fins de quantificação. Por fim, pode ocorrer coloração inadequada com TTC quando o coração é excessivamente perfundido (11/168), o que dificulta substancialmente a delimitação da área de infarto.
Figura 1: Esquema da montagem experimental. O sistema Langendorff de pressão constante, não recirculante e impulsionado pela gravidade foi projetado para fornecer um tampão de Krebs–Henseleit (KHB) rico em nutrientes e oxigenado, sob pressão hidrostática constante de 110 cmH₂O. O KHB foi primeiramente pré-aquecido a 37 °C em um reservatório e conduzido para uma coluna de pressão com jaqueta de água, onde uma pressão hidrostática constante de 110 cmH2O foi mantida por meio de um regulador de pressão. O coração perfundido foi imerso em um banho de órgãos com jaqueta de água e altura ajustável, para manter uma temperatura constante de 37 °C durante todo o período experimental (A). A infarto do miocárdio foi induzido pela ligadura transitória da artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD), após parada cardioplégica sobre uma almofada de algodão em um recipiente metálico pré-resfriado (B). O procedimento foi realizado sob um microscópio estereoscópico. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2: Infarto miocárdico regional versus global (IM) e determinação do tamanho do infarto. O IM global induz lesão isquêmica em todo o coração, conforme indicado pela coloração amarela nas imagens microscópicas com TTC. O miocárdio atrial e a região apical pareceram ser mais resistentes à isquemia e permaneceram viáveis após 45 minutos de isquemia global sem fluxo (painel superior em A). O IM regional induz lesão isquêmica no miocárdio distal ao local de ligadura da artéria descendente anterior esquerda (LAD). Nesse caso, porções do miocárdio subepicárdico são coradas em vermelho, sugerindo preservação do tecido viável (painel inferior em A). O tamanho do infarto foi quantificado utilizando o software ImageJ, com a área infartada/necrosada e o miocárdio viável delineados com base em suas cores distintas de coloração (B). A sobrevivência dos cardiomiócitos dentro da região de interesse (ROI) foi calculada pela determinação da porcentagem da coloração vermelho-escuro na ROI selecionada (C). Barras de escala: 1 mm. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.
Figura 3Impacto da duração da isquemia no tamanho do infarto. A lesão miocárdica agravou-se progressivamente à medida que a duração da isquemia foi prolongada de 30 min a 120 min (A). O tamanho do infarto mais que dobrou entre 30 min (n = 3) e 45 min (n = 5) de isquemia e aparentemente atingiu um platô à medida que a duração isquêmica foi prolongada para 60 min (n = 5), 90 min (n = 4) e 120 min (n = 3) (B). Em comparação com o in vivo modelo MI (ivMI, n = 5), o ex vivo MI (evMI, n = 8) produziu tamanhos de infarto quase idênticos sob durações isquêmicas comparáveis (36,88%) ± 3.91% versus. 37.8% ± 2.17%, p = 0,27, teste t de Student t-Teste). Os corações evMI exibiram uma parede ventricular mais espessa e um lúmen ventricular reduzido, provavelmente devido ao edema miocárdico associado à perfusão com cristaloide (C). As barras de erro representam o desvio padrão da média (DPM). Barras de escala: 1 mm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: A IL-6 aumentou a sobrevivência de cardiomiócitos após lesão isquêmica. A administração intramiocárdica (i.m.) de IL-6 no modelo de evMI resultou em um número mensurável de cardiomiócitos viáveis (CMs viáveis; vermelho intenso) dentro da região infartada/necrótica (bege), predominantemente localizados ao redor do local de injeção de IL-6 (setas, painel esquerdo). A quantificação de CMs viáveis dentro da região de interesse (ROI, indicada por linhas tracejadas) revelou que a injeção de PBS resultou em apenas uma pequena fração de miocárdio viável (1,05% ± 0,44%, erro padrão da média - EPM, n = 4), enquanto a injeção de IL-6 aumentou significativamente a quantidade de CMs viáveis dentro da ROI (4,08% ± 0,99%, EPM, n = 6; p = 0,005, teste t de Student). As barras de erro representam o desvio padrão da média (DPM). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados insatisfatórios ou malsucedidos causados por falha técnica. Como ilustrado pela lesão miocárdica representativa no modelo de IAM ex vivo (esquerda), o miocárdio viável e o necrótico geralmente podem ser claramente diferenciados na coloração típica com TTC. No entanto, várias falhas técnicas podem resultar em resultados insatisfatórios ou não interpretáveis. Uma ligadura inadequada da AD causada pelo deslizamento do fio pode resultar em sobrevida miocárdica extensa, apesar da isquemia prolongada. A reperfusão incompleta pode ocorrer quando ramos da AD são danificados durante a ligadura e posteriormente se tornam mal perfundidos, produzindo um padrão semelhante ao fenômeno de “sem-refluxo” observado clinicamente. Tais regiões podem apresentar coloração esbranquiçada (setas). A embolização microvascular por bolhas de ar que entram na circulação coronariana durante o procedimento de cânula também pode causar lesão miocárdica (setas), dificultando a distinção entre lesão isquêmica e lesão embólica para fins de quantificação. Por fim, uma coloração inadequada com TTC pode ocorrer quando o coração é excessivamente perfundido, o que pode causar lesão miocárdica além da isquemia. Barras de escala: 1 mm. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| F-pico (n = 19) | F-estável (n = 19) | RF-pico (n = 19) | RF-estável (n = 19) | |
| Médias (mL/min) | 2.54 | 0.78 | 2 | 0.99 |
| DP | 0.59 | 0.29 | 0.56 | 0.53 |
Tabela 1: Fluxo coronariano nos níveis máximos (F-peak) e de estado estável (F-steady) durante isquemia e reperfusão (RF-peak e RF-steady).
Discussão
O modelo atual de IM ex vivo baseia-se principalmente em sistemas sofisticados de coração perfundido pelo método Langendorff2. Uma falha comum durante o preparo é a introdução de bolhas de ar na circulação coronariana, o que pode causar lesão embólica e confundir a avaliação da lesão isquêmica. Para prevenir esse problema, é essencial inspecionar cuidadosamente o sistema de perfusão imediatamente antes de cada experimento. Se pequenas bolhas de ar ficarem presas no sistema de tubos, uma lavagem retrógrada com KHB para deslocar as bolhas de volta para a coluna de pressão pode ajudar a resolver o problema.
A etapa fundamental deste protocolo é a ligadura da artéria coronária descendente anterior (LAD). Em primeiro lugar, a identificação visual precisa da LAD é, portanto, crítica. Na maioria dos casos, os vasos coronários tornam-se translúcidos após a lavagem do coração com PBS gelado, tornando a LAD claramente distinguível do miocárdio circundante. Além disso, uma técnica de ligadura adequada e habilidosa é igualmente importante, pois uma tensão excessiva no fio de polipropileno 8-0 pode cortar a LAD, tornando a subsequente reperfusão impossível. Para minimizar esse risco, uma fenda macia de tamanho apropriado deve ser colocada entre o fio e o vaso para distribuir a força da ligadura e proteger a artéria coronária de lesões mecânicas. Contudo, lesões miocárdicas menores induzidas pela ligadura são inevitáveis, mas geralmente não comprometem a perfusão coronária nem afetam o resultado do experimento. Por fim, como a lesão miocárdica é altamente sensível à temperatura13, manter uma temperatura constante ao longo do experimento é criticamente importante. Especialmente sob condições de perfusão com pressão constante, pode ocorrer perda de calor entre a coluna de perfusão e o coração, variando dinamicamente de acordo com a taxa de fluxo coronário14. Assim, flutuações podem potencialmente levar a alterações na temperatura miocárdica. Nesse contexto, um banho de órgãos com jaqueta de água é altamente recomendável para manter condições térmicas estáveis (Figura 1A).
Uma vez superados esses desafios técnicos, o modelo de IM ex vivo fornece uma plataforma confiável e reprodutível para induzir lesão miocárdica no coração isolado de camundongo (Figura 3A). Representa, portanto, um sistema experimental valioso para investigar a sobrevivência miocárdica pós-IM, avaliar intervenções terapêuticas administradas localmente e realizar imagens de alta resolução sem interferência do movimento respiratório ou cardíaco. Embora o protocolo de IM global seja tecnicamente simples e tenha sido amplamente utilizado em estudos anteriores4, sua principal limitação é que a duração da isquemia global geralmente é restrita a menos de 45 min3. Consequentemente, ao contrário do modelo de IM regional, raramente produz uma infarto transmural (Figura 2).
Uma característica única do modelo de IM ex vivo é a ausência de influências sistêmicas, incluindo regulação neural e componentes sanguíneos circulantes, o que permite aos pesquisadores avaliar os efeitos locais diretos de intervenções terapêuticas no miocárdio8. Isso é particularmente relevante para citocinas como a IL-6 e a sinalização downstream PI3K/AKT, que demonstraram ser cardioprotetoras em cardiomiócitos isolados15. In vivo, no entanto, os efeitos cardíacos da IL-6 são frequentemente inconsistentes ou até contraditórios, pois a IL-6 ativa simultaneamente células imunes e promove respostas inflamatórias que podem anular suas ações cardioprotetoras diretas16. De acordo com esse conceito, nosso modelo ex vivo demonstrou de forma convincente que a administração intramiocárdica local de IL-6 preservou significativamente a viabilidade miocárdica após lesão isquêmica17,18, sustentando um efeito cardioprotetor direto da IL-6 sobre os cardiomiócitos (Figura 4).
Reconhecemos várias limitações do presente modelo ex vivo de infarto do miocárdio. Na configuração atual, a função contrátil cardíaca não foi avaliada no presente protocolo.3. Isso ocorreu porque o objetivo principal era caracterizar a sobrevivência miocárdica em um modelo de infarto do miocárdio regional, e porque a disfunção contrátil reflete a alteração funcional após lesão isquêmica, mas não indica necessariamente a morte de cardiomiócitos8. Além disso, o ex vivo O modelo de IM exclui inerentemente componentes sanguíneos circulantes, células imunes e influências neuro-humorais que podem contribuir significativamente para a progressão da IM e para o remodelamento cardíaco in vivo. Embora essa redução na complexidade sistêmica seja uma grande vantagem do ex vivo modelo de IM, ele também limita seu amplo uso na simulação das respostas inflamatórias, vasculares, neurais e endócrinas que podem ocorrer in vivo. Finalmente, constatou-se que a perfusão com cristaloide estava associada a edema miocárdico, evidenciado pelo aumento da espessura da parede ventricular e redução da luz ventricular em comparação com in vivo corações com IAM. A ocorrência notória de edema pode alterar a arquitetura miocárdica, a difusão tecidual e potencialmente a viabilidade celular. Portanto, o presente modelo deve ser considerado uma plataforma controlada para investigar lesões miocárdicas e mecanismos específicos de cardiomiócitos.
Não obstante, o modelo de IM ex vivo descrito aqui é uma plataforma simples e econômica para avaliar a sobrevivência miocárdica na ausência de influências regulatórias extrínsecas. Dado o uso crescente de modelos murinos geneticamente modificados, essa abordagem pode ser particularmente valiosa para investigar mecanismos cardioprotetores utilizando técnicas avançadas de imagem, gravação eletrofisiológica e análises moleculares. Além disso, o modelo pode ser adaptado para testar sistematicamente intervenções farmacológicas localizadas ou baseadas em genes, e para desvendar mecanismos específicos de cardiomiócitos sem fatores de confusão sistêmicos. Assim, o modelo de IM ex vivo fornece uma plataforma experimental complementar que facilita a identificação e investigação mecanicista de vias cardioprotetoras.
Divulgações
Os autores declaram que não possuem conflitos de interesse. Os autores declaram que ferramentas de inteligência artificial (IA) ou tecnologias assistidas por IA generativa não foram utilizadas na elaboração, análise de dados, geração de figuras ou validação deste trabalho.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Projeto Geral da Sociedade de Geriatria de Jiangsu (JGS2026MS019 para WO), pela Fundação de Desenvolvimento Social do Departamento de Ciência e Tecnologia da Cidade de Zhenjiang (nº do auxílio: SH2023023 para H.Z. e SH2023057 para X.L.), pelo Programa FoKo (nº do auxílio: 23/2013 para ZD) e pelo Instituto de Pesquisa Cardiovascular de Düsseldorf (CARID).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio | Milipore | 1.08380.0100 | Produtos químicos |
| Cânula aórtica | BD | 305895 (20 G) | Retroperfusão |
| Aquamount | BDH | 362262H | Crio-seção |
| Equilíbrio | Ohaus | - | Pesagem de produtos químicos |
| Pinça grande | AESCULAP | - | Instrumentos cirúrgicos |
| Analisadores de gases sanguíneos | Radiômetro | ABL90 FLEX PLUS | Analisador de gases |
| Cloreto de cálcio diidratado | Fluka | 21097 | Produtos químicos |
| Carbogênio | Linde | 4040152 | Aparelho de Langendorff |
| CellSens | Olympus | Versão 3.1.1 | Software de imagem |
| Discos de algodão | BEESana | PZN-1330900 | Instrumentos cirúrgicos |
| Lâminas de cobertura | Epredia | BB02400500A113MN20 | Crio-seção |
| Criostato | Leica | M850 | Crio-seção |
| Glicose anidra D(+)- | Merck | 8337.1000 | Produtos químicos |
| Água bidestilada | Milipore | - | Dissolução de produtos químicos |
| Etanol (100%) | Merck | 64-17-5 | Limpeza de tubos |
| Etanol (70%) | VWR | UN1170 | Limpeza de tubos |
| Membrana de filtro (0.2 µm) | Thermo Scientific | 8-000-230511 | Aparelho de Langendorff |
| Fluxômetro | Transonic | T4S410 | Aparelho de Langendorff |
| Lâminas de microscópio de vidro | Engelbrecht | 11102 | Crio-seção |
| Coluna de água em vidro | Caseiro | - | aparelho de Langendorff |
| Ácido clorídrico | Roth | P074.1 | Produtos químicos |
| ImageJ | NIH | versão 1.54g | Software |
| Interleucina-6 | Biolegend | 570804 | Produtos químicos |
| Isoflurano | Piramal | 14150097146754 | Produtos químicos |
| Microscópio de luz | Olympus | BX61 | Imagem |
| Sulfato de magnésio heptaidratado | Merck | 5886.1000 | Produtos químicos |
| Sonda de fluxo médico | Transonic | 3PXN | Aparelho de Langendorff |
| Prato de metal | Caseiro | - | Instrumentos cirúrgicos |
| seringa Micro-Fine | BD | 30G / 0,3 mL | Aparelho de Langendorff |
| Rato | Janeiro | C57BL/6J | Animais |
| Objetivo (x 1,25) | Olympus | PlanApo 1,25X/0,04 | Imagem |
| composto OCT | Sakura | 4583 | Produtos químicos |
| placa de Petri | Thermo Scientific | 172931 | aparelho de Langendorff |
| Solução salina tamponada com fosfato | Roth | 9143.1 | Produtos químicos |
| Cloreto de potássio | Merck | 4936.1000 | Produtos químicos |
| Dihidrogenofosfato de potássio | Merck | 4873.1000 | Produtos químicos |
| Sutura de seda | F.S.T | 18020-60 | Instrumentos cirúrgicos |
| Cloreto de sódio | Sigmaaldrich | SZBD0810V | Produtos químicos |
| Bicarbonato de sódio | Roth | 6885.2 | Produtos químicos |
| Piruvato de sódio | Sigmaaldrich | 113-24-6 | Produtos químicos |
| Pomada macia | Deknatel | L-705 | Instrumentos cirúrgicos |
| Pinça de aço inoxidável (8 mm) | F.S.T | 11052-10 | Instrumentos cirúrgicos |
| Tesoura de aço inoxidável | AESCULAP | BC702R | Instrumentos cirúrgicos |
| Tesoura de aço inoxidável | AESCULAP | BC257R | Instrumentos cirúrgicos |
| Estereomicroscópio | Leica | MZ6 | Instrumentos cirúrgicos |
| Sutura (8-0) | Ethicon | TG-108 | Instrumentos cirúrgicos |
| Seringa (3 mL) | B. Braun | 4617100V | Retroperfusão |
| Três vias com torneira | B. Braun | 16494C | Retroperfusão |
| Tubulação | Tygon | T3304-23 | aparelho de Langendorff |
| Banho-maria | HAAKE | DC1/B3 | Aparelho de Langendorff |
| solução Zamboni | Morphisto | 12773.0050 | Produtos químicos |
Referências
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- Preda A, et al. IL-6 in the spotlight: from cardiovascular pathophysiology to therapy. Eur J Clin Invest. 2026;56(1):e70161.
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