O protocolo de texto completo para essa abordagem experimental está disponível em <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471142720/cp/cpmb/article/mb1002a/current/abstract" target="_blank">protocolos atuais em Biologia Molecular</a> .

Os autores não têm nada a declarar.

separação eletroforética de proteínas

Eletroforese é usada para separar misturas complexas de proteínas (por exemplo, a partir de células, frações subcelulares, frações da coluna, ou imunoprecipitados), para investigar composições subunidade, e para verificar a homogeneidade das amostras de proteína. Ele também pode servir para purificar proteínas para uso em outras aplicações. Eletroforese em gel de poliacrilamida, as proteínas migram em resposta a um campo elétrico através de poros em uma matriz de gel de poliacrilamida; tamanho dos poros diminui com a concentração de acrilamida crescente. A combinação de tamanho dos poros e carga de proteína, tamanho e forma determina a taxa de migração da proteína. Nesta unidade, o método de Laemmli padrão é descrito por eletroforese em gel descontínua em condições de desnaturação, ou seja, na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS).

Neste vídeo, demonstramos um método para separação eletroforética de proteínas usando poli-acrylimide eletroforese em gel (PAGE).

Separação eletroforética de proteínas

A eletroforese é utilizada para separar misturas complexas de proteínas (p. ex., de células, frações subcelulares, frações de coluna ou imunoprecipitados), para...

A separação de proteínas individuais a partir de misturas proteicas complexas pode ser realizada por eletroforese em gel de poliacrilamida, também conhecida como PAGE. As proteínas migram em resposta a um campo elétrico através dos poros da matriz do gel. A combinação do tamanho dos poros do gel com a carga, o tamanho e a forma da proteína determina a taxa de migração da proteína. Neste vídeo, demonstraremos um método para separação eletroforética de proteínas.Olá, eu sou o Dr. Bobul Chakravarti do Centro de Proteômica do Instituto Graduado Keck de Ciências da Vida Aplicadas. Hoje vou mostrar a vocês um procedimento para realizar eletroforese em gel 1D. Então, vamos começar.Para começar, monte o sanduíche de placas de vidro do aparelho de eletroforese de acordo com as instruções do fabricante, utilizando duas placas de vidro limpas e dois espaçadores de 1,5 milímetro. Agora, fixe o sanduíche de placas de vidro na plataforma de moldagem. Em seguida, prepare a solução do gel separador, que foi descrita nos protocolos atuais.Adicione a quantidade especificada de 10% de persulfato de amônio e teed à solução e misture suavemente. Devido à alta concentração de acrilamida, a dessurgelagem não é necessária. Usando uma pipeta plástica descartável de 10 mililitros, aplique imediatamente a solução do gel de separação sobre o sanduíche ao longo de uma borda de um dos espaçadores até que a altura da solução entre as lâminas de vidro seja de aproximadamente 11 centímetros.Em seguida, utilize outro pipeta para cobrir lentamente a parte superior do gel com uma camada de aproximadamente um centímetro de espessura de álcool isobutílico saturado com água ou água destilada. Faça isso aplicando suavemente a água ao longo da borda de um, e depois do outro espaçador, deixando o gel polimerizar por 30 a 60 minutos. À temperatura ambiente, a sobreposição de água garante que o gel de acrilamida polimerize em uma linha reta.Uma vez que o gel polimeriza, estamos prontos para verter o gel de empilhamento. Primeiro, remova a camada de água destilada e depois enxágue com tris CL 1x em SDS a um pH de 8,8. Agora prepare a solução do gel de empilhamento conforme indicado nos protocolos atuais.Em seguida, utilizando uma pipeta de plástico, deixe lentamente a solução do gel de empilhamento escorrer para o centro do sanduíche ao longo de uma borda de um dos espaçadores, até que a altura da solução no sanduíche esteja a cerca de um centímetro do topo das placas. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar no gel de empilhamento. Após o gel ser vertido, insira um pente de teflon de 0,75 milímetro na camada de solução de gel de empilhamento.Deixe a solução do gel de empilhamento polimerizar de 30 a 45 minutos à temperatura ambiente; agora estamos prontos para preparar as amostras de proteína. Para iniciar o preparo das amostras de proteína, dilua uma porção da amostra de proteína a ser analisada em uma proporção de um para um com tampão amostra SDS a 2X.Para soluções proteicas diluídas, considere usar uma mistura de proteína em proporção de cinco para um com tampão amostral SDS seis vezes concentrado. Se a amostra for um pellet proteico precipitado, dissolva a proteína em 50 a 100 microlitros de tampão amostral SDS 1X. Aqueça agora as amostras por três a cinco minutos a 100 graus Celsius em um tubo de microcentrífuga com tampa rosqueável e vedada, dentro de um banho-maria.Em seguida, remova cuidadosamente o pente de teflon sem rasgar as bordas dos poços de poliacrilamida. Após a remoção do pente, enxágue os poços com tampão de eletroforese SDS 1X. Em seguida, utilizando uma pipeta, preencha os poços com tampão de eletroforese SDS 1X.Após a lavagem e o preenchimento dos poços com tampão, fixe o sanduíche de gel à câmara superior de tampão. Seguindo as instruções do fabricante, preencha a câmara inferior de tampão com a quantidade recomendada de tampão de eletroforese XSDS 1X. Em seguida, coloque o sanduíche, fixado à câmara superior de tampão, dentro da câmara inferior de tampão.Agora, preencha completamente a câmara superior de tampão com tampão de eletroforese XSDS, de modo que os poços de amostra do gel de empilhamento fiquem cheios de tampão. O gel está agora pronto para ser carregado; utilizando uma pipeta automática de 25 ou 100 microlitros com ponteiras para carregamento de géis, adicione a amostra proteica em um ou mais poços, aplicando cuidadosamente a amostra como uma camada fina no fundo dos poços. Carregue os poços de controle com padrões de peso molecular.Adicione também um volume igual de tampão amostral XSDS a todos os poços vazios para evitar a difusão das faixas adjacentes. Estamos agora prontos para iniciar a eletroforese em gel. Para executar o gel, conecte a fonte de alimentação à câmara e execute-a com uma corrente constante de 30 miliampères para um gel em placa com espessura de 1,5 milímetro.Depois que a tinta azul de rastreamento com mentol atingir a base do gel de separação, desconecte a fonte de alimentação. Agora que a eletroforese terminou, descarte o tampão de eletroforese e remova a câmara superior de tampão com o sanduíche de gel acoplado. Oriente o gel de modo que a ordem dos poços de amostra seja conhecida.Em seguida, remova o sanduíche da câmara superior de tampão e coloque-o sobre uma folha de papel absorvente ou toalha de papel. Depois, com cuidado, deslize um dos espaçadores pela metade a partir da borda do sanduíche ao longo de todo o seu comprimento. Use o espaçador exposto como alavanca para abrir cuidadosamente a placa de vidro, expondo o gel com cautela.Remova o gel da placa inferior. Corte um pequeno triângulo em um dos cantos do gel para que a orientação das bandas não se perca durante a coloração e a secagem. O procedimento de eletroforese em gel está agora concluído.O gel pode agora ser processado utilizando diversos procedimentos de detecção de proteínas. Acabamos de mostrar como separar proteínas usando eletroforese em gel. Assim sendo, é isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Electrophoretic Separation of Proteins

Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences.  Neste vídeo, demonstramos um método para separação eletroforética de proteínas usando poli-acrylimide eletroforese em gel (PAGE).

Separação eletroforética de proteínas

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