Na diferenciação in vitro de rato-tronco embrionárias (MES) células usando o método da gota de suspensão

1. Gelatinizar T75 frasco com uma solução 0,1% de gelatina e placa de incubação em 37 ° C 5% CO, ₂ de cultura de tecidos incubadora durante a noite um dia antes.
2. Retire as células MES de incubação, aspirar o médio, lavar a cultura de células ES com PBS, adicione solução de tripsina 0,05% para revestir o fundo do prato (2 placa ml/100mm).
3. Incubar a 37 ° C por aproximadamente 1 minuto, até que as células são sloughing fora do prato.
   
4. Suavemente triturar (pipeta cima e para baixo) as células tripsinizados quatro a seis vezes para dispersar as células ES com uma pipeta Pasteur ligado,. Transferência das células ES dispersos em um tubo de centrífuga de 15 ml cônico contendo pré-aquecido (37 ° C), médio MES.
   
5. Coletar células por centrifugação. Aspirar o sobrenadante, adicionar 10 ml de meio de MES e pipeta cima e para baixo para formar uma suspensão única célula.
   
6. Transferir a suspensão celular para um balão T75 pré-revestido com 0,1% de gelatina e incubar a 37 ° C com 5% de CO ₂ por uma hora
   
   * Depois de uma hora, os fibroblastos ter anexado à placa, mas as células-tronco permanecem no meio. Pipeta até o meio para coletar as células-tronco.
   
   
7. Girar as células a 1000 rpm por 5 min e aspire o meio off MES. Em seguida, adicione 10 ml de uma outra MES médio diferenciação e ressuspender as células por pipetagem repetitiva, até parece haver uma suspensão fina de células.
8. Contagem de células com um meio de diferenciação hemocitômetro usar para diluir a suspensão de células-tronco a uma concentração de 400 a 500 células por 20ul (20ul/drop) em uma bacia estéril.
9. Levante a tampa, cuidadosamente invertê-lo e colocá-lo em cima do prato contendo 10 ml de PBS. Usando uma pipeta multicanal, fazer linhas de gotas 20ul na superfície até que virou interna da tampa do prato de cultura de tecidos.
10. Cuidadosamente coloque o prato na incubadora por dois dias. Depois de dois dias, cuidadosamente vire a placa de cobertura, aspirado 180 médias diferenciação ul fresco e colocar algumas gotas para dentro do poço de uma placa de fixação de 96 poços ultralow. Em seguida, pegar a queda das gotas da pipeta e transferir, um por um, para a placa de 96 poços. Coloque as placas na incubadora sem ser perturbado por 3 dias.
    
11. Casaco de cada poço de uma placa de 48 poços de cultura de tecidos com 300ul de 0,1% de gelatina. Depois de adicionar a gelatina, incubar a placa durante a noite a 37 ° C um dia antes antes da transferência o EBS.
    
12. No dia seguinte, aspire a gelatina a partir da placa de 48 também. Em seguida, adicionar 300 ul do meio de diferenciação para cada poço. Transferir os EBs dos 96 pratos bem aos 48 bem gelatina revestido placas de um por um. Mudar o meio do dia seguinte e depois mudar o meio em dias alternados para manter as células.
    
13. Contrações espontâneas cardiaomyocyte deveria ser evidente dentro de 7 dias.

The disadvantages of hanging drop method are as follows: the liquid volume of a drop is limited to less than 50ul due to maintaining hanging drops on the lid by surface tension, and it’s impossible to change the medium for hanging drops. Observation of forming EBs in drops directly with microscopy is also very difficult during cultivation. Further more , the hanging drop method consists of two steps, therefore, a series of step of the hanging drop method may be troublesome.