Este vídeo demonstra como realizar a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias de camundongos para corpos embrióides usando o método da gota pendente.
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Artigo de método
Na diferenciação in vitro de rato-tronco embrionárias (MES) células usando o método da gota de suspensão
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células-tronco têm o extraordinário potencial de se transformar em vários tipos de células diferentes. Quando uma célula-tronco se divide, cada nova célula tem potencial para ou manter uma célula-tronco ou se tornar um outro tipo de célula com uma função mais especializada, esta promissora da ciência é levando os cientistas a investigar a possibilidade de terapias baseadas em células para tratar a doença. Quando a cultura em suspensão sem fatores antidiferenciação, células-tronco embrionárias espontaneamente diferenciar e forma tridimensional agregados multicelulares. Esses agregados celulares são chamados corpos embrióides (EB). Hanging cultura queda é amplamente utilizado EB método de indução de formação. O fundo arredondado de gota em suspensão permite a agregação de células-tronco embrionárias, que podem fornecer células MES um bom ambiente para a formação de EBs. O número de células ES aggregatied em uma gota em suspensão pode ser controlado variando o número de células em suspensão de células inicial para ser pendurado como uma queda da tampa da placa de Petri. Usando esse método, podemos reproducibly forma homogênea EBs de um número predeterminado de células-tronco embrionárias.
Protocolo
- Gelatinizar T75 frasco com uma solução 0,1% de gelatina e placa de incubação em 37 ° C 5% CO, 2 de cultura de tecidos incubadora durante a noite um dia antes.
- Retire as células MES de incubação, aspirar o médio, lavar a cultura de células ES com PBS, adicione solução de tripsina 0,05% para revestir o fundo do prato (2 placa ml/100mm).
- Incubar a 37 ° C por aproximadamente 1 minuto, até que as células são sloughing fora do prato.
- Suavemente triturar (pipeta cima e para baixo) as células tripsinizados quatro a seis vezes para dispersar as células ES com uma pipeta Pasteur ligado,. Transferência das células ES dispersos em um tubo de centrí....
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Discussão
As desvantagens do método de gota em suspensão são as seguintes: o volume de líquido de uma queda é limitado a menos de 50uL, devido à manutenção de gotas de suspensão na tampa pela tensão superficial, e é impossível mudar o meio para pendurar gotas. Observação da formação de EBs em gotas diretamente com microscopia também é muito difícil durante o cultivo. Ainda mais, o método de gota em suspensão consiste em duas etapas, portanto, uma série de etapas do método de gota em suspensão pode ser problemático.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| Soro bovino fetal (FBS) | Reagente | Hyclone | SH30070.03 | |
| L-Glutamina | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Ácidos Aminoácidos Não Essenciais | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| Penicilina / Estreptomicina | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Piruvato de sódio | Reagente | GIBCO, by Life Technologies | 11360-70 | |
| β-mercapto–etanol | Reagente | Chemicon International | ES-007-E | |
| fator inibidor de leucemia (LIF) | Reagente | Chemicon International | LIF2005 | |
| placa de 96 poços com aderência ultrabaixa | Ferramenta | Corning | 3474 |
Referências
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
- Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C.
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Reimpressões e permissões
