Na diferenciação in vitro de rato-tronco embrionárias (MES) células usando o método da gota de suspensão

Resumo

Este vídeo demonstra como realizar a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias de camundongos para corpos embrióides usando o método da gota pendente.

Resumo

Células-tronco têm o extraordinário potencial de se transformar em vários tipos de células diferentes. Quando uma célula-tronco se divide, cada nova célula tem potencial para ou manter uma célula-tronco ou se tornar um outro tipo de célula com uma função mais especializada, esta promissora da ciência é levando os cientistas a investigar a possibilidade de terapias baseadas em células para tratar a doença. Quando a cultura em suspensão sem fatores antidiferenciação, células-tronco embrionárias espontaneamente diferenciar e forma tridimensional agregados multicelulares. Esses agregados celulares são chamados corpos embrióides (EB). Hanging cultura queda é amplamente utilizado EB método de indução de formação. O fundo arredondado de gota em suspensão permite a agregação de células-tronco embrionárias, que podem fornecer células MES um bom ambiente para a formação de EBs. O número de células ES aggregatied em uma gota em suspensão pode ser controlado variando o número de células em suspensão de células inicial para ser pendurado como uma queda da tampa da placa de Petri. Usando esse método, podemos reproducibly forma homogênea EBs de um número predeterminado de células-tronco embrionárias.

Protocolo

1. Gelatinizar T75 frasco com uma solução 0,1% de gelatina e placa de incubação em 37 ° C 5% CO, ₂ de cultura de tecidos incubadora durante a noite um dia antes.
2. Retire as células MES de incubação, aspirar o médio, lavar a cultura de células ES com PBS, adicione solução de tripsina 0,05% para revestir o fundo do prato (2 placa ml/100mm).
3. Incubar a 37 ° C por aproximadamente 1 minuto, até que as células são sloughing fora do prato.
   
4. Suavemente triturar (pipeta cima e para baixo) as células tripsinizados quatro a seis vezes para dispersar as células ES com uma pipeta Pasteur ligado,. Transferência das células ES dispersos em um tubo de centrífuga de 15 ml cônico contendo pré-aquecido (37 ° C), médio MES.
   
5. Coletar células por centrifugação. Aspirar o sobrenadante, adicionar 10 ml de meio de MES e pipeta cima e para baixo para formar uma suspensão única célula.
   
6. Transferir a suspensão celular para um balão T75 pré-revestido com 0,1% de gelatina e incubar a 37 ° C com 5% de CO ₂ por uma hora
   
   * Depois de uma hora, os fibroblastos ter anexado à placa, mas as células-tronco permanecem no meio. Pipeta até o meio para coletar as células-tronco.
   
   
7. Girar as células a 1000 rpm por 5 min e aspire o meio off MES. Em seguida, adicione 10 ml de uma outra MES médio diferenciação e ressuspender as células por pipetagem repetitiva, até parece haver uma suspensão fina de células.
8. Contagem de células com um meio de diferenciação hemocitômetro usar para diluir a suspensão de células-tronco a uma concentração de 400 a 500 células por 20ul (20ul/drop) em uma bacia estéril.
9. Levante a tampa, cuidadosamente invertê-lo e colocá-lo em cima do prato contendo 10 ml de PBS. Usando uma pipeta multicanal, fazer linhas de gotas 20ul na superfície até que virou interna da tampa do prato de cultura de tecidos.
10. Cuidadosamente coloque o prato na incubadora por dois dias. Depois de dois dias, cuidadosamente vire a placa de cobertura, aspirado 180 médias diferenciação ul fresco e colocar algumas gotas para dentro do poço de uma placa de fixação de 96 poços ultralow. Em seguida, pegar a queda das gotas da pipeta e transferir, um por um, para a placa de 96 poços. Coloque as placas na incubadora sem ser perturbado por 3 dias.
    
11. Casaco de cada poço de uma placa de 48 poços de cultura de tecidos com 300ul de 0,1% de gelatina. Depois de adicionar a gelatina, incubar a placa durante a noite a 37 ° C um dia antes antes da transferência o EBS.
    
12. No dia seguinte, aspire a gelatina a partir da placa de 48 também. Em seguida, adicionar 300 ul do meio de diferenciação para cada poço. Transferir os EBs dos 96 pratos bem aos 48 bem gelatina revestido placas de um por um. Mudar o meio do dia seguinte e depois mudar o meio em dias alternados para manter as células.
    
13. Contrações espontâneas cardiaomyocyte deveria ser evidente dentro de 7 dias.

Discussão

As desvantagens do método de gota em suspensão são as seguintes: o volume de líquido de uma queda é limitado a menos de 50uL, devido à manutenção de gotas de suspensão na tampa pela tensão superficial, e é impossível mudar o meio para pendurar gotas. Observação da formação de EBs em gotas diretamente com microscopia também é muito difícil durante o cultivo. Ainda mais, o método de gota em suspensão consiste em duas etapas, portanto, uma série de etapas do método de gota em suspensão pode ser problemático.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
	DMEM Reagente	GIBCO, da Life Technologies	11965-092
Soro Fetal Bovino (FBS)	Reagente	Hyclone	SH30070.03
L-Glutamina		Reagente GIBCO, da Life Technologies	25030
Reagente	de Aminoácidos Não Essenciais	GIBCO, da Life Technologies	11140-050
Penicilina / Reagente de Estreptomicina		GIBCO, da Life Technologies	15140-122
Reagente de Piruvato de Sódio		GIBCO, da Life Technologies	11360-70
β-mercapt– Fator	reagente	Chemicon International	ES-007-E
thanol (LIF)	Reagente	Chemicon International	LIF2005
placa de fixação ultrabaixa de 96 poços	Ferramenta	Corning	3474