Artigo de método

O método MODS para o diagnóstico da tuberculose e da tuberculose resistente a múltiplas drogas

DOI:

10.3791/845

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11 de agosto de 2008

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1The Warren Alpert Medical School of Brown University, 2Laboratorio de Investigacion de Enfermedades Infecciosas, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 3Department of International Health, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health, 4Wellcome Trust Centre for Clinical Tropical Medicine, Imperial College London

Neste artigo

Resumo

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A observação microscópica de drogas susceptibilidade-ensaio (MODS) é uma low-cost, low-tech ferramenta de alto desempenho para detecção de tuberculose (TB) e tuberculose multirresistente (TBMR). Este vídeo descreve o MODS líquido método de cultura de mídia.

Resumo

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Pacientes com tuberculose pulmonar ativa (TB) 15/10 infectar outras pessoas por ano, tornando o diagnóstico de TB ativa essencial para tanto a cura do paciente e prevenção de novas infecções. Além disso, o surgimento da tuberculose resistente a múltiplas drogas (TBMR) significa que a detecção da resistência às drogas é necessário para impedir a disseminação de cepas resistentes. A observação microscópica de drogas susceptibilidade-ensaio (MODS) é uma low-cost, low-tech ferramenta de alto desempenho para detecção de TB e da TBMR. O ensaio MODS é baseada em três princípios: 1) Mycobacterium tuberculosis (MTB) cresce mais rapidamente em meios líquidos do que em meios sólidos 2) o crescimento MTB microscópicas podem ser detectadas anteriormente em meios líquidos de esperar que o aspecto macroscópico das colônias em meios sólidos e que o crescimento é característica de MTB, permitindo que ele seja distinguido de contaminação micobactérias ou fungos ou bactérias atípicas 3) as drogas isoniazida e rifampicina pode ser incorporada no ensaio MODS para permitir a detecção direta simultânea de TBMR, eliminando a necessidade de subcultura para executar um teste de sensibilidade indireto da droga. Concorrentes diagnósticos atuais são dificultados pela baixa sensibilidade com baciloscopia, longos atrasos até o diagnóstico com a cultura meios sólidos, com custos proibitivos de métodos existentes líquido meios de cultura, ea necessidade de fazer subcultura para testes indiretos de drogas susceptibilidade para detectar TBMR. Em contraste, o não-proprietário método MODS tem uma alta sensibilidade para TB e da TBMR, é um método de cultura relativamente rápido, oferece testes de sensibilidade simultânea de drogas para TBMR, e é acessível a locais de recursos limitados em pouco menos de 3 dólares para os testes de TB e TBMR.

Protocolo

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  1. Preparar soluções estoque
    1. Fosfato de estoque regulador
      1. Misture 950ml de solução de sódio dibásico (9.47g de fosfato de sódio dibásico dissolvido em água destilada 1000ml) com 950ml de potássio solução de fosfato monobásico (9.07g de potássio fosfato monobásico dissolvido em água destilada 1000ml) e agitar; retivesses 50ml de cada solução para ajustar pH se necessário
      2. Ajustar o pH para 6,8 ± 0,2: adicionar fosfato de sódio dibásico solução para elevar o pH, adicione a solução de fosfato de potássio monobásico de baixar o pH
      3. Autoclave a 121-124 ° C por 15 minutos para esterilizar
      4. Placa de uma alíquota de 100μl da solução tampão de fosfato em meio agar nutriente em uma placa de Petri e incubar a 37 ° C por 48 horas para confirmar a esterilidade
      5. Guarde na geladeira a 2-8 ° C por até um mês

        Nota: Cada amostra de escarro requer 10ml de solução tampão fosfato
    2. Ações de descontaminação
      1. Combine volumes iguais de solução de hidróxido de sódio (8,0 g de hidróxido de sódio dissolvido em água destilada estéril 200ml) e solução de citrato de sódio (5,8 g de citrato de sódio em água destilada estéril 200ml destilada)
      2. Misture e autoclave a 121-124 ° C por 15 minutos
      3. Guarde na geladeira a 2-8 ° C por até um mês

        Nota: Cada amostra de escarro requer 2ml de ações de descontaminação
    3. Cultura de ações de mídia
      1. Em 900ml de água destilada estéril, adicionar 3.1ml de glicerol e 1,25 g de casitone e 5,9 g de pó meio 7H9 e misturar com agitação constante até completamente dissolvido
      2. Autoclave a 121-124 ° C por 15 minutos
      3. Esfriar e dividir o meio estéril em alíquotas 4.5ml em estéril 16x 100 tubos de vidro milímetros para preparação de amostras, e 10.8ml alíquotas para a preparação de soluções de antibióticos e de controles internos
      4. Incubar a 37 ° C por 48 horas para verificar a esterilidade (ausência de turbidez)
      5. Armazenar de 2-8 ° C com tampa bem fechado por até um mês

        Nota: Cada amostra de escarro requer um tubo contendo 4,5 ml de meio 7H9
    4. Antibiótico soluções estoque
      1. A. Isoniazida estoque (8 mg / ml)
        1. Dissolver 20 mg de isoniazida completamente em água destilada estéril, 2,5 ml
        2. Filtro com filtro de seringa de 0,2 Hm para solvente aquoso
        3. Loja em alíquotas 20μl em tubos de centrifugação estéril micro a -20 ° C por até 6 meses

          Nota: Cada alíquota armazenada 20μl é suficiente para até 100 amostras (incluindo o desperdício)
      2. B. A rifampicina estoque (8 mg / ml)
      1. Dissolver 20mg rifampicina completamente em 1.25ml DMSO
      2. Adicionar 1.25ml água destilada estéril e misturar
      3. Filtro com filtro de seringa de 0,2 Hm de solvente orgânico
      4. Loja em alíquotas 20μl em tubos de microcentrífuga estéril a -20 ° C por até 6 meses

        Nota: Cada alíquota armazenada 20μl é suficiente para até 100 amostras (incluindo o desperdício)
  2. Prepare soluções de trabalho
    1. Solução de descontaminação de trabalho
      1. Dissolver 0,1 g de cristais de NALC em cada 20ml de solução de descontaminação requerido

        Nota: Cada amostra necessidades 2ml de solução de descontaminação

        Nota: Eliminar qualquer solução de descontaminação NaOH-NALC que permanece não utilizado após 24 horas, como NALC perde a sua atividade ao longo do tempo mucolítico
    2. Solução de meios de cultura de trabalho
      1. Estabelecidos:
        1. 1 tubo com meio 7H9 para cada amostra de escarro para ser processado, além de um tubo adicional para cada placa (para a coluna controle negativo)
        2. 2 tubos de meio 7H9 para os controles positivo (3 se cepas monoresistant são usados)
        3. 02/01 tubos com 7H9 10.8ml para a preparação de solução antibiótica
      2. Adicionar 0,5 ml OADC ao 4.5ml de 7H9 em cada tubo de amostra
      3. Adicionar OADC 1,2 ml para tubos com 7H9 10.8ml
      4. Separe dois tubos com 5ml 7H9-OADC os controles positivos, e tubo (s) com 12ml 7H9-OADC a ser utilizado para a preparação de solução antibiótica (estes não requerem PANTA)
      5. PANTA reconstituir e adicionar 0,1 ml para cada tubo de amostra e os tubos de controle negativo (7H9-OADC-PANTA: volume total = 5.1ml)

        Nota: médio completo com PANTA (7H9-OADC-PANTA) é usado para amostras de escarro e controles negativos; use 7H9-OADC sem PANTA de controlos positivos e para a preparação de solução antibiótica
    3. Antibiótico soluções de trabalho
      1. 1. Veja a Figura 1 para as etapas para tornar a solução antibiótica trabalhando em uma placa de 24 poços não utilizados

        Nota: Para obter resultados precisos de suscetibilidade, as concentrações finais de antibióticos são críticos. O procedimento a seguir é adequado para laboratories equipado com micropipetas. Se micropipetas não estão disponíveis, seringas de tuberculina pode ser usado com uma série de diluições diferentes descritos no Guia do Usuário Apêndice 3 a modsperu.org

        Nota: Não volte a congelar ou re-utilização de trabalho antibióticos ou soluções de ações como a atividade das drogas podem ser perdidos Descartar todas as soluções não utilizado antibiótico no final do dia de processamento Figura 1.. Tornando as soluções de antibióticos de trabalho (de Guia do Usuário no modsperu.org)
  3. Amostra de escarro e placa de preparação
    1. Descontaminação
      1. 2ml lugar de amostra de escarro em um tubo de centrífuga de 15ml (se for inferior, compõem a 2ml com tampão fosfato; se mais, use apenas 2ml)
      2. Adicionar 2 ml de solução NaOH-NALC
      3. Tubo de tampa bem e vortex por 20 segundos; inverter tubo para garantir contatos NaOH-NALC solução a superfície interior do tubo inteiro e tampa
      4. Deixe repousar por um mínimo de 15 minutos - pode prolongar por alguns minutos se a amostra é particularmente viscoso. Para evitar o excesso de tratamento, não deve exceder 20 minutos
      5. Encha o tubo de 14ml com tampão fosfato (pH 6,8) para neutralizar alcalinos e encerrar o processo de descontaminação, e misture bem, vire o tubo 4 vezes
      6. Centrifugar a 3000 g por 15 minutos (ver Apêndice 2 no Guia do Usuário no modsperu.org para a equação de rotações por minuto necessário para atingir 3000 g)
      7. Deitar fora o sobrenadante cuidadosamente em um recipiente de resíduos líquidos com hipoclorito de sódio 10% ou outro desinfetante adequado e manter o pellet
    2. Preparação da suspensão amostra final e backup
      1. Utilizando-7H9-OADC PANTA (a partir do tubo contendo 5.1ml), ressuspender o sedimento em amostra de um volume total de 2ml no tubo de ensaio com uma pipeta Pasteur, misture bem
      2. Retire 1ml de suspensão da amostra e armazenar em um tubo de microcentrífuga de 2-8 ° C como um backup
      3. Adicione o segundo 1ml de suspensão de amostra para o tubo com os restantes 7H9-OADC-PANTA; misture bem. Esta é a solução da amostra final pronto para revestimento
    3. Colocando suspensões amostra em 24 poços da placa
      1. 900μl lugar da suspensão amostra final em cada um dos quatro poços de uma coluna na placa de 24 poços
      2. Repita com amostras adicionais até que todas as colunas da placa, com exceção da coluna 3, são preenchidos (ou até que todas as amostras são banhados)
      3. 900μl lugar de 7H9-OADC meio sem amostra na 4 poços da coluna 3 de cada placa de amostra (negativo controles internos)
    4. Adição de antibióticos para amostras
      1. Com uma pipeta multi-canal, preencha cuidadosamente quatro pontas com 100μl dos poços com 7H9-OADC e antibiótico soluções de trabalho (Coluna 2 na diluição de antibióticos placa-ver Figura 1)
      2. Adicione o alíquotas 100μl para a coluna 1 poços com soluções amostra 900μl sem tocar placa ou amostra
      3. Repita até que todas as colunas receberam o adicional de 100μl médio (livre de drogas poços) ou soluções de antibiótico (incluindo coluna de controle negativo 3)
      4. Feche a placa com a sua tampa e coloque em um saco de polietileno lacrado (Ziplock) e selo (saco não for aberto novamente a partir deste ponto)
      5. Incubar a 37 ° C (CO 2 de enriquecimento não é necessário)
  4. Controle de qualidade
    1. Controles negativos são executados em cada placa. A presença de qualquer crescimento em qualquer um dos poços na coluna de controle negativo indica a contaminação cruzada, portanto, toda a placa deve ser descartado e as amostras re-plated.
    2. Os controlos positivos são executados em uma placa separada no final do dia. Uma cepa totalmente drogas suscetíveis é executado em uma coluna e uma cepa resistente à INH e RIF é executado em outra coluna. Se há preocupação sobre a execução de uma cepa MDR, tanto a tensão um monoresistant INH e RIF monoresistant uma cepa pode ser executado no lugar das cepas sensíveis e MDR. Todos os controles positivos deve ter crescimento nos poços livre de drogas para demonstrar que o crescimento apoio da mídia. Para demonstrar que as concentrações da droga estão corretas, a cepa suscetível não deve crescer no INH ou poços RIF, mas a cepa MDR deve crescer também crescer no INH e RIF poços.
  5. Leitura da placa
    1. Com o dia do chapeamento como "dia 0", a leitura da placa começa no dia 5, e se negativo no dia 5 de leitura é feito a cada dia (ou dias alternados, dependendo da carga de trabalho) até o dia 14 e depois a cada 2-3 dias a partir de dia 15 -21. Placas são examinadas em ummicroscópio de luz invertida, com o objetivo de 10x
    2. A cultura positiva é aquela em que há duas ou mais unidades formadoras de colônia (> 2 CFU) em AMBAS as livre de drogas poços. Micobactérias de crescimento no início se parece com pequenas vírgulas curvas ou espirais (dia 09/05). Formação de colônias geralmente progride para "cordas" ou "emaranhados" (ver imagem na biblioteca modsperu.org)
    3. No dia em que uma cultura é positiva na 2 livre de drogas poços, os poços de drogas que contêm deve ser lido. Qualquer crescimento na presença de uma droga indica resistência a essa droga.

      Nota: Se a leitura dos poços de drogas que contêm é feito> uma semana depois de uma cultura positiva é observado nos poços livre de drogas, isso não pode representar a resistência como break-through crescimento é visto ocasionalmente
    4. As amostras que não são positivos por Dia 21 são consideradas culturas negativas
    5. Nebulosidade dos poços é resultado de crescimento excessivo de contaminação, enquanto que o crescimento de micobactérias não resulta na nebulosidade
    6. Após a conclusão de 21 dias as culturas podem ser descartados. Culturas permanecem em seus sacos fechados e são colocados em sacos de autoclave e autoclavados a 121-124 ° C durante 45-60 minutos

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Discussão

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O ensaio MODS é destinado a ambientes de recursos limitados. Pela primeira vez, MODS traz a capacidade para a detecção rápida de cultura líquido de tuberculose multirresistente e tuberculose resistente a ambientes de recursos limitados em pouco menos de 3 dólares por teste. MODS é um não-proprietário, a metodologia iterativa, ea comunidade MODS está sempre interessada em melhorias que outros laboratórios têm conseguido fazer.

Uma preocupação recorrente é a biossegurança da cultura de mídia líquida da tuberculose, porque os líquidos ...

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Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de agradecer Sean Fitzwater e Carmen Giannina Luna Colombo para o segmento de vídeo tuberculose crescimento lapso de tempo. Agradecemos a Marty Roper para ela um feedback completo e excelente durante a edição e co-autoria o Guia do Usuário, a partir do qual o actual protocolo foi tomada principalmente verbatim. Produção deste vídeo foi financiado pelo NIH / Fogarty International Center http://www.fic.nih.gov/ David AJ Moore contribuiu como Research Fellow Wellcome Trust Clínica em Medicina Tropical e Reader em Doenças Infecciosas do Imperial College London (Sociedade número prêmio 078067/Z/05). Mark F. Brady contribuiu como um NIH / Fogarty Fellow Research International Center.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento de refrigeração/freezerpara armazenar caldos pré-preparados e estoques de antibióticos
Equipamento de vórticepara auxiliar na descontaminação do escarro
Equipamentocentrífugapara concentração de escarro; capaz de atingir 3000 g; d– s não precisam ser refrigerados, mas DEVEM ser biosseguros (baldes podem ser selados)
Incubadora (37 graus C) Equipamentopara cultura; não precisa ser enriquecido com CO2
Microscópio de luz invertidaMicroscópiopara ler placas MODS
AutoclaveEquipamentopara esterilizar mídias, PBS e placas usadas
Equipamentode equilíbriopara pesar isoniazida, rifampicina e caldo NALC
Middlebrook 7H9 (Difco)ReagenteFisher ScientificDF0713-17-9500gr / garrafa; base de mídia de cultura
Casitone (caseína de resumo pancreático)ReagenteFisher ScientificDF0259‐ 17‐ 9500gr/garrafa; meio de cultura base
Glicerol (glicerina) liofilizadoReagenteSigma-AldrichG‐ 33‐ 500500ml/frasco; base de meios de cultura
PANTA (mistura de antibióticos liofilizada BD) ReagenteFisher ScientificB43451146 frascos/embalagem; suplemento de meios antibióticos
OADC (enriquecimento Middlebrook OADC BD)ReagenteFisher ScientificB1188610 x 20ml/pacote; suplemento de meios nutricionais
Dimetil sulfóxido (Hibri-Max)ReagenteSigma-AldrichD-2650100ml/frasco; para preparar estoque de rifampicina
Estoques de antibióticos: isoniazidaReagenteSigma-AldrichI-337750gr/frasco; teste de suscetibilidade direta
Estoques de antibióticos: rifampicinaReagenteSigma-AldrichR-35011gr/frasco; teste de suscetibilidade direta
Hidróxido de sódio (pellets)ReagenteSigma-Aldrich221465500gr/garrafa; descontaminação de escarro
Citrato de sódio (sal trissódico di-hidratado)ReagenteSigma-AldrichS-4641500gr/frasco; descontaminação de escarro
N-acetil-L-cisteínaReagenteSigma-AldrichA-725050gr/frasco; descontaminação de escarro
Fosfato de potássio Monobásico cristal. KH2PO4ReagenteSigma-AldrichP0662500gr/frasco; descontaminação de escarro
Fosfato de sódio Dibásico, anidro. Na2HPO4ReagenteSigma-AldrichS0876500gr/garrafa; descontaminação de escarro
Hipoclorito de sódioReagentealvejantepara descartar resíduos
contaminados Tubos de centrífuga de 15ml (polipropileno 15ml Falcon 35‐ 2096)ConsumívelFisher Scientific14‐ 959‐ 49B500ea/caixa; para descontaminação e concentração de escarro
placas de 24 poços (Placas de tecido 24 poços BD Falcon 35‐ 3047)ConsumíveisFisher Scientific08-772-150 placas/caixa; para cultura e leitura
Sacos de polietileno seláveis 6 X 6 “ (ziplock)Consumívelpara biossegurança para conter 24 poços de placa
Tubos de vidro com tampa (16 x 100 mm e 18 x 145 mm)ConsumívelVWR international47729-583500 tubos/caixa; para armazenar alíquotas de caldo preparado
Tubos de microcentrífuga com tampa de rosca (1,5 ml)ConsumívelFisher Scientific05‐ 669‐ 221000ea/caixa; para armazenar alíquotas de estoques de antibióticos
0,22μ m filtros (solventes aquosos) Filtro de seringa Millex blueConsumívelFisher ScientificSLGL 025 OS50 unidades/caixa; para filtrar estoques de antibióticos
0.22μ m filtros (solventes orgânicos) Filtro de seringa Millex amareloConsumívelFisher ScientificSLGV 033 RS50 unidades/caixa; para filtrar estoques de antibióticos
Pipetas Pasteur descartáveis vidro borossilicato 9″ConsumívelFisher Scientific13‐ 678‐ 20C720ea/case; para misturar PANTA com mix de mídia
Pontas de barreira de aerossol 1000‐ 1300μ lConsumívelFisher Scientific02‐ 707‐ 511000ea/pk; para dispensar mídia em placa
USA Scientific Tips One 1‐ 200μ l pontas amarelasConsumíveisFisher Scientific1111‐ 00061000 pontas/saco; para diluir os estoques de antibióticos
de doméstico

Referências

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  3. Caviedes, L., Moore, D. A. Introducing MODS: a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis. Indian J Med Microbiol. 25, 87-87 (2007).
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