Este destina-se como uma introdução para o patch clamp de gravação a partir de oócitos Xenopus laevis. Abrange vitelínico remoção da membrana, a formação de um selo gigaohm (gigaseal), ea conversão opcional do patch para a topologia de fora-out.
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Artigo de método
Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus
Neste artigo
Resumo
Resumo
Desde o seu desenvolvimento por Sakmann e Neher 1, 2, o patch clamp se estabeleceu como uma técnica extremamente úteis para a aferição eletrofisiológica de canais de iões simples ou múltiplas nas células. Esta técnica pode ser aplicada a canais iônicos tanto no ambiente de sua nativa e expresso em células heterólogas, como oócitos colhidos o sapo com garras Africano, Xenopus laevis. Aqui, descrevemos a técnica bem estabelecida de gravação de patch-clamp de oócitos Xenopus. Esta técnica é utilizada para medir as propriedades de canais iônicos, expressos quer em populações (macropatch) ou individualmente (single-channel de gravação). Nós nos concentramos em técnicas para maximizar a qualidade da preparação de oócitos e geração de selo. Com todos os fatores otimizados, esta técnica dá uma probabilidade de geração de selo de sucesso mais de 90 por cento. O processo pode ser otimizado de forma diferente por cada pesquisador com base nos fatores que ele ou ela acha mais importante, e nós apresentamos a abordagem que levaram à maior sucesso em nossas mãos.
Protocolo
Parte 1: Remover a membrana vitelina
- Prepare dois conjuntos de fórceps. Nós preferimos No. 5 fórceps, onde um conjunto foi ligeiramente afiada com uma lima. Também preparar uma pipeta de vidro por corte e polimento-fogo de 7 "Pasteur pipeta.
- Recomendações: Para evitar que os oócitos de escorregar, corte um círculo de grade (1 praças mm) e cola na parte inferior de uma placa de Petri 60mm. Este prato pode ser reutilizado indefinidamente se mantidos limpos entre os usos.
- Encha o prato de Petri até a metade com solução hiperosmótico (ver receita) e colocar sob um microscópio de dissecação.
- Remover oócitos 03/01 Xenopus da sua solução de incubação com uma pipeta Pasteur polido e coloque no prato.
- Aguarde 15s - 2 min para que as células começam a encolher. Vezes mais fazer as células mais fáceis de descascar, tempos mais curtos para as células saudáveis para remendar.
- Com a redução da célula, a membrana vitelina começará a tornar-se visível apenas como uma camada transparente sobre a célula. Selecione uma célula saudável (sem voltas ou defeitos) para peeling.
- Com um par de fórceps, gentilmente compreender a membrana vitelina sem danificar a membrana plasmática. Com a outra, segure perto do mesmo local e gentilmente rasgar a membrana transparente e livre para além da célula.
- Com a pipeta de Pasteur, cuidadosamente mover a célula para a câmara de gravação. Note-se que a célula será frágil após a remoção vitelínico.
Parte 2: geração Gigaseal
- Preencha uma pipeta de gravação com solução salina. Use o volume mínimo de solução que faz um bom contato elétrico com o fio de eletrodo de modo a minimizar a capacitância pipeta.
- Flick os tempos de pipeta para permitir que várias bolhas a flutuar e deslizar no fio do eletrodo.
Aplicar pressão para a pipeta cheia. Isto pode ser feito por via oral ou com uma bomba de aquário de uma loja de animais. Esta pressão é fundamental para manter a pipeta limpa, uma vez que atravessa a interface líquido e se move para a célula. - Encontrar o óvulo na câmara e focar fortemente na borda da célula.
- Com a pipeta de sair do banho, o centro da ponta (fora de foco) acima da célula. Desta vez, minimiza gasto no banho antes da geração do selo.
- Queda da pipeta para baixo em foco ao lado do celular. Trazê-lo em estreita proximidade (~ 50 microns). Você deverá ver uma pequena distorção de solução empurrado para fora da pipeta pela pressão de volta.
- Usando o software patch clamp, verifique a resistência da pipeta (nossa meta é de aproximadamente 3-4 mohms) e zerar o atual usando a tensão de offset.
- Com uma pressão positiva sobre a pipeta, mova a ponta lentamente em direção ao celular enquanto monitoramento da resistência visualmente ou utilizando um monitor de áudio que gera um tom cuja freqüência é proporcional à resistência. Como a ponta começa a tocar o celular, a resistência vai aumentar.
- De repente, mas com cuidado mudar de positivo para a pressão negativa de aproximadamente o mesmo valor absoluto. Resistência deve aumentar para selar formação.
- A maior parte do tempo, a formação de vedação ocorre dentro de alguns segundos, ocasionalmente 30-60 segundos são necessários.
- Uma vez que a resistência está em 1GΩ, a pressão pode ser liberado para neutro. Você agora tem um patch on-celular. Para um patch de dentro para fora, afastar a célula rapidamente. Para fora-out, veja abaixo.
Parte 5: Fora-out topologia (opcional)
- Imediatamente após atingir uma ruptura, gigaseal da membrana. Isto pode ser feito com sucção forte, mas nós preferimos a 1 V de pulso para 1 ms. A resistência deve cair para pouco mais do que a resistência inicial da pipeta.
- Mover a pipeta fora da célula lenta e suavemente. Você deverá ver uma parte da célula com o puxar da pipeta. De repente, e dentro de alguns segundos, o celular vai pular de volta ea resistência deve imediatamente e, simultaneamente, voltar ao GΩs.
- Você agora tem um patch na configuração fora-out. Ectodomínios de qualquer canais iônicos incluído é exposta ao banho.
Parte 6: Resultados Previstos
Geralmente, os focas maior resistência são preferíveis e mais vivido. 10 GÊ é uma boa orientação de alta qualidade selos. Em nossa experiência, as chances de selos desta qualidade variam de acordo com muitos fatores, especialmente celular e pipeta de qualidade. Taxas de aquisição patch pode ser mais de 95% com as células saudáveis, pipetas limpas, e um investigador experiente. Essas manchas podem durar muitos minutos e são adequados para qualquer estudo eletrofisiológico de canais iônicos expressos em oócitos Xenopus, incluindo um único canal de gravações.
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Discussão
Há muitos parâmetros de gravação eletrofisiológico não serão discutidos aqui. Configuração de equipamento, sistema de gestão de ruído, expressão de canais e protocolos de gravação são também essenciais para bons resultados experimentais.
Em nossa experiência, estes são os parâmetros mais críticos para a formação de selos de confiança: oócitos de alta qualidade, a remoção da membrana vitelina rapidamente (aka, "peeling"), use pipetas recém puxado protegido de poeira, pipetas suave, a pressão positiva aplicada ao entrar no b...
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Agradecimentos
Receita encolher solução é a partir do laboratório de RW Aldrich. Agradecemos aos seguintes agências de fomento e fundações de apoio: National Institutes of Health, National Science Foundation, a American Heart Association, Associação de Distrofia Muscular, o B. Donald e Delia E. Baxter Foundation, o Fundo Klingenstein e da Fundação McKnight for Neuroscience.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Amplificador de Grampo por Eletrodo de Micropipeta && Software | Instrumento | HEKA Instruments | EPC-10 | Ou outro dispositivo semelhante (por exemplo, HEKA EPC-9 ou Axopatch 200B) |
| Pinça número 5 (dois pares) | Ferramenta | Fine Science Tools | ||
| Solução para encolhimento de ovócitos | Reagente | Ingrediente Em mMN-metil-D-glucamina 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Ácido aspártico 220KCl 2pH ajustado para 7,4 com N-metil-D-glucamina | ||
| malha tecida | 800 µm | Spectrum Labs | 146481 |
Referências
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
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Reimpressões e permissões
