Extração de Biomarcadores de Sedimentos - Extração Acelerada por Solventes
Fonte: Laboratório de Jeff Salacup - Universidade de Massachusetts Amherst
A distribuição de um grupo de biomarcadores orgânicos chamados glicerol-dia…
1. Coleta dos Materiais Necessários
- Extrair amostras. As amostras (neste caso, sedimentos) são congeladas, congeladas, esmagadas e homogeneizadas antes da extração, e extraídas em grupos para maximizar a eficiência.
- Dependendo do tamanho da amostra, utilize frascos de coleta com volumes de 40 ou 60 mL. Para este experimento, são utilizados frascos de vidro borossilicato (40 mL) e tampas seguras de solventes. Frascos de combustão, pipetas de vidro borossilicato e latas de pesagem a 550 °C por 6h antes de garantir a remoção de possíveis contaminantes orgânicos.
- Diclorometano (DCM) e metanol são comuns na maioria dos laboratórios de geoquímica orgânica. Use-os individualmente , (primeiro metanol, seguido de DCM) para enxaguar ferramentas de laboratório e vidros antes de usar. Uma mistura de diclorometano ao metanol (MeOH; 9:1) é usada em muitos laboratórios para extrair biomarcadores eficientemente com uma ampla gama de polaridades. Os solventes devem estar livres de contaminantes orgânicos.
- Obtenha um Extrator de Solvente Acelerado para usar para este experimento.
2. Preparação de células amostrais
- Monte uma célula amostral para cada amostra a ser extraída, mais uma em branco.
- Para cada célula, enrosque uma tampa final em uma extremidade do corpo celular.
- Coloque um filtro de fibra de vidro queimado em cima de cada célula usando pinças enxaguadas com solventes. Em seguida, pressione suavemente e lentamente o filtro para dentro da célula usando o êmbolo do filtro.
- Rotule os corpos celulares por número (por exemplo, 1 - 22) para cada amostra e escreva "em branco" na célula em branco.
- Encha o branco com terra diatomácea (ou areia) e tampa com uma segunda tampa final. Aperte à mão.
3. Preparação de Amostras
- Coloque uma lata de pesagem queimada na escala do laboratório e depois na piche.
- Enxágüe a espátula de laboratório com solvente, em seguida, use-a para transferir uma massa apropriada de amostra para a lata de pesagem, e regissão a massa.
- A massa da amostra varia dependendo do seu teor de matéria orgânica. Material magro de matéria relativamente orgânica (lama marinha) pode exigir vários gramas, enquanto material rico em matéria orgânica (tecido de folha) pode exigir muito menos.
- Transfira todo o material na lata de pesagem para uma célula ASE preparada.
- Coloque outro filtro de fibra de vidro na parte superior da célula, depois pressione lentamente e suavemente até atingir a parte superior da amostra usando o êmbolo do filtro.
- Adicione terra diatomácea (ou areia) à célula até que esteja quase cheia. Tenha cuidado para remover quaisquer detritos dos fios do corpo celular.
- Cubra a parte superior da célula com outra tampa final.
- Repita as etapas 3.1 - 3.6 para cada amostra.
4. Preparação de frascos de coleta
- Rotule cada frasco com o número de uma célula correspondente (por exemplo, 1 - 22 ou em branco) e tampa com tampa de frasco de coleta ASE.
5. Extração
- Coloque cada célula de amostra em um slot numerado na bandeja ase superior.
- Coloque o frasco de coleta correspondente no mesmo slot numédlico na bandeja ase inferior.
- Crie o método de extração usando o teclado no ASE. Extrair a 100 °C e 1.200 psi. Extrair cada amostra 3x com um porão estático de 10 min e lavar o corpo celular com 50% de seu volume total entre as porões estáticos.
- Certifique-se de que a garrafa de solvente contém solvente suficiente para extrair todas as amostras.
- Enxágüe o ASE 3x antes de iniciar a corrida pressionando o botão "enxaguar" na almofada de controle ASE.
- Comece a pressionar.
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A extração acelerada por solvente é uma técnica rápida, eficiente e de alto rendimento usada para separar biomarcadores orgânicos de um grande número de amostras de sedimentos geológicos.
Tradicionalmente, métodos de extração como sonicação ou Soxhlet são usados, no entanto, a desvantagem desses protocolos é que eles são muito lentos para processar material suficiente para uma reconstrução paleoclimática detalhada. Uma técnica mais recente, a Extração Acelerada de Solvente, ou método ASE, foi desenvolvida com eficiência e alto rendimento em mente.
O método ASE usa uma combinação de altas temperaturas e alta pressão para extrair amostras e pode realizar várias amostras em uma única execução de preparação relativamente rápida.
Este vídeo é o terceiro de uma série detalhando como extrair biomarcadores de sedimentos. Ele cobrirá o procedimento e fornecerá informações sobre os méritos do ASE sobre a sonicação ou extração de Soxhlet.
Na extração acelerada por solvente, as amostras são carregadas em células de aço que são então carregadas em um carrossel. Os frascos de coleta para cada célula de amostra também são carregados em um carrossel separado. O instrumento carrega uma célula de amostra em um forno interno. O solvente é bombeado de um frasco de solvente através de uma série de válvulas até que uma pressão suficiente seja atingida.
Essa pressão é mantida por um período de tempo ditado pela amostra e pelo analito. Em seguida, o solvente é liberado da célula de amostra através de uma linha de aço para o frasco de coleta correspondente. O processo pode ser repetido várias vezes. A temperatura, pressão e duração podem ser personalizadas para a amostra.
A alta temperatura utilizada aumenta a cinética da extração, enquanto a alta pressão impede que o solvente volatize. O frasco de coleta agora contém um extrato lipídico total, e o que resta na célula da amostra é chamado de resíduo. É composto por material não orgânico, bem como material orgânico que não é extraível por solvente, chamado querogênio.
Agora que estamos familiarizados com os princípios por trás da extração acelerada de solventes, vamos dar uma olhada em como isso é realizado em laboratório.
Após a coleta de amostras de interesse; liofilizar, homogeneizar e descontaminar conforme demonstrado em outro vídeo desta série.
Uma vez preparadas todas as amostras, monte uma célula para cada uma a ser extraída e uma extra para um branco. Para fazer isso, aparafuse uma tampa de extremidade no corpo da célula. Usando uma pinça enxaguada com solvente, coloque um filtro de fibra de vidro queimado em cima de cada uma. Pressione lenta e suavemente o filtro para baixo com o êmbolo.
Rotule os corpos celulares por número para cada amostra e rotule o branco separadamente. Coloque uma lata de pesagem queimada em uma balança de laboratório e tara. Lave uma espátula com solvente e use-a para transferir 5 a 10 g de amostra para a lata de pesagem e registre a massa.
Transfira todo o material da lata de pesagem para a célula correspondente. Coloque outro filtro de fibra de vidro por cima e aperte suavemente até atingir o topo da amostra.
Adicione um dispersante, como terra de diatomáceas ou areia, até que esteja quase cheio, tomando cuidado para evitar que detritos entrem nas roscas do corpo celular. Tampe a parte superior da célula com outra tampa. Repita essas etapas para cada amostra e o espaço em branco.
Rotule cada frasco de coleta com o número de uma célula de amostra correspondente ou em branco e tampe com uma tampa do frasco. Coloque cada célula em um slot numerado na bandeja ASE superior. Defina os parâmetros para o método de extração usando o teclado no ASE para extrair em 100 ? C?e 1.200 psi. Extraia cada amostra 3 vezes com uma retenção estática de 10 min e lave o corpo celular com 50% de seu volume total entre as fixações estáticas.
Em seguida, certifique-se de que o frasco de solvente contém o suficiente para extrair todas as amostras. Enxágue as linhas do instrumento - 3 vezes antes de iniciar a corrida. Por fim, pressione iniciar.
Remova o frasco do ASE. Agora que os biomarcadores foram extraídos, eles devem ser purificados antes da análise.
A extração acelerada por solvente é uma técnica versátil, que pode ser utilizada para uma variedade de aplicações, algumas das quais são exploradas aqui.
A extração acelerada por solvente também pode ser usada em outros tipos de amostra, incluindo alimentos. A análise de resíduos para testar a contaminação por pesticidas é frequentemente realizada em instalações regulatórias e industriais para verificar a segurança e a qualidade de produtos alimentícios como frutas ou vegetais. O ASE pode ser usado para extrair pesticidas organoclorados de amostras de alimentos e determinar os tipos ou níveis de resíduos presentes no produto. Essas informações podem então ser usadas para estabelecer se o produto é próprio para consumo humano ou animal. Por exemplo, a dieldrina deve ser encontrada entre 0 e 0,1 partes por milhão nos alimentos, dependendo do produto.
Os componentes nutricionais dos alimentos também podem ser extraídos usando ASE. Por exemplo, produtos como chocolate, que podem ter alto teor de gordura gravimétrica, podem ser extraídos. Usando ASE com éter de petróleo como solvente, a gordura pode ser separada das amostras de chocolate e submetida a análise quantitativa para determinar uma porcentagem precisa de teor de gordura por quantidade conhecida de chocolate. Usando essas informações, os órgãos reguladores podem verificar as alegações feitas pelos fabricantes de chocolate ou os fabricantes podem obter informações para criar rótulos de alimentos precisos.
Você acabou de assistir à introdução da JoVE à extração de biomarcadores lipídicos usando extração acelerada por solvente, ou ASE. Métodos para processamento e análise adicionais podem ser encontrados em vídeos subsequentes.
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Q1: Why is accelerated solvent extraction better than sonication or Soxhlet extraction?
Accelerated solvent extraction is faster and more efficient than traditional methods like sonication or Soxhlet extraction. ASE combines high temperature and high pressure to extract biomarkers from sediment samples in a single, relatively fast preparation run. This high-throughput capability enables researchers to process hundreds or thousands of samples needed for detailed paleoclimate reconstruction, which older extraction methods cannot achieve.
Q2: How do temperature and pressure work together in accelerated solvent extraction?
In accelerated solvent extraction, high temperature increases the kinetics of the extraction process, speeding up biomarker separation from sediment. High pressure simultaneously keeps the solvent from volatizing, or evaporating, during extraction. This combination of elevated temperature and pressure allows the ASE method to efficiently extract organic compounds while maintaining solvent integrity throughout the procedure.
Q3: What materials are used to prepare samples for accelerated solvent extraction?
Samples are loaded into steel cells with combusted glass fiber filters placed above and below the sediment material. A dispersant such as diatomaceous earth or sand is added to fill the cell and improve solvent contact. End caps seal the cell, and collection vials receive the extracted material. All glassware and filters are combusted to remove organic contaminants before use.
Q4: What is the difference between a total lipid extract and kerogen in ASE?
A total lipid extract is the organic material dissolved by the solvent and collected in the vial after accelerated solvent extraction. Kerogen is the non-extractable organic material that remains in the sample cell after extraction. The residue left behind comprises both non-organic material and kerogen, representing compounds that are not solvent-extractable.
Q5: How can accelerated solvent extraction be used for food safety testing?
Accelerated solvent extraction can extract organochlorine pesticides and other residues from food samples like fruits and vegetables. ASE determines the types and levels of pesticide contamination present, helping regulatory and industrial facilities verify whether produce is safe for human or animal consumption. For example, dieldrin levels must remain within 0 to 0.1 parts per million depending on the product.
Q6: What role do biomarkers play in paleoclimate reconstruction?
Biomarkers like glycerol-dialkyl glycerol-tetraethers (GDGTs) are produced by archaea and bacteria and change predictably in response to air or water temperature. The distribution of these biomarkers in sediment sequences of known age allows scientists to reconstruct past temperature changes on decadal to millennial timescales. This paleoclimate data requires rapid analysis of hundreds or thousands of samples, making accelerated solvent extraction essential.
Q7: What happens to the extracted biomarkers after accelerated solvent extraction?
After accelerated solvent extraction, the total lipid extract containing biomarkers must be purified before analysis. The purification process removes unwanted compounds and concentrates the target biomarkers. Purification of a total lipid extract with column chromatography is a common next step in preparing samples for detailed chemical and paleoclimate analysis.