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A saponificação é uma técnica comumente usada para remover ésteres metílicos de ácidos graxos de uma mistura orgânica complexa.
Amostras orgânicas complexas são frequentemente analisadas por cromatografia gasosa, que é usada para determinar as concentrações relativas de componentes individuais.
No entanto, compostos semelhantes em tamanho e estrutura não podem ser distinguidos pelo instrumento, distorcendo os resultados. Portanto, compostos indesejados que produzem sinais sobrepostos devem ser removidos para obter resultados precisos.
Este vídeo aborda o uso da saponificação para purificar alcenonas para paleoclimatologia. É o primeiro de uma série que detalha a purificação de amostras complexas de biomarcadores. Ele cobrirá o procedimento, bem como alguns outros usos da técnica.
As alquilcetonas poliinsaturadas de cadeia longa, chamadas alcenonas, demonstraram fornecer informações úteis sobre a temperatura da superfície do mar no passado.
No entanto, os organismos que produzem alcenonas geralmente criam ésteres metílicos de ácidos graxos semelhantes em tamanho e estrutura química, chamados alcenoatos. Devido a essas semelhanças, os alcenoatos devem ser removidos antes que uma análise precisa possa ser obtida.
A saponificação é uma técnica comum usada para impedir a coeluição dessas moléculas. A saponificação utiliza água para dividir a ligação molecular de um éster. Uma base se liga ao carbono no coração do alkenoate. Essa reação de adição cria um intermediário instável e o alcóxido é expelido.
O hidrogênio do ácido recém-formado se move para o alcóxido expelido, e o ânion carboxilato resultante forma uma ligação iônica com o cátion da base. O resultado é um álcool e um sal de ácidos graxos. A adição de um ácido forte regenerará o ácido carboxílico. Neste ponto, o alcenoato ofensivo foi convertido em uma forma que não co-elui mais com a alcenona de interesse.
Agora que você entende como a saponificação pode ser usada para purificar uma mistura orgânica, você está pronto para iniciar o procedimento.
Primeiro, adquira um extrato lipídico total seco - ou TLE - que foi obtido usando um método de extração por solvente. Em seguida, prepare as soluções de saponificação conforme descrito no protocolo de texto. Certifique-se de que todos os componentes sejam puros e livres de hidrocarbonetos. Assim que as soluções estiverem preparadas, adicione o TLE seco a um frasco de vidro borossilicato de 60 mL. Adicione 2 ml de hidróxido de potássio 2 normal e feche o frasco. Em seguida, aqueça o frasco para injetáveis a 60 ? C por 2,5 h para clivar a ligação éster. Quando isso estiver concluído, deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente. Assim que a amostra esfriar, adicione 2 mL de solução de cloreto de sódio a 5% ao frasco. Tampe o frasco e agite brevemente. Adicione ácido clorídrico 6 N gota a gota até atingir um pH de 2 - usando papel de pH para testar. A adição deste ácido irá protonar o ânion carboxilato para formar o produto final - o ácido carboxílico estável.
Agora que a solução acidificada está livre de éster, adicione 5 mL de hexano. Tampe e agite vigorosamente por 5 segundos para extrair os compostos orgânicos da água. Deixe a solução descansar até que as fases orgânica e aquosa se separem completamente. Sais, íons e ácido clorídrico não reagido permanecerão na fase aquosa, enquanto os compostos orgânicos se separarão no hexano. Uma vez que as fases tenham se separado completamente, remova aproximadamente 75% do hexano usando uma pipeta e dispense em outro frasco de 40 mL. Repita este processo de extração mais duas vezes, adicionando 5 mL de hexano de cada vez. Quando isso estiver concluído, descarte a solução aquosa restante em um recipiente de lixo adequado. Rotule o frasco para injetáveis que contém a fase orgânica recentemente saponificada. Os ácidos carboxílicos produzidos não podem ser injetados nos instrumentos comumente usados para análise de alcenona sem purificação adicional. Os ácidos carboxílicos injetados em um cromatógrafo gasoso se acumulam rapidamente e arruínam as entradas, os revestimentos de entrada e a extremidade frontal das colunas. Para remover esses ácidos, a amostra precisa primeiro passar por outra técnica de purificação: separação por cromatografia em coluna.
A saponificação tem várias aplicações na extração e purificação de moléculas orgânicas.
A saponificação pode ser usada não apenas para separar biomarcadores, mas também para extrair componentes individuais para uso em produtos comerciais. Neste exemplo, compostos da árvore do tabaco -? Nicotiana glauca?- foram isolados e analisados para investigar seu potencial como matéria-prima para uma ampla variedade de produtos de base biológica, como combustível, calor e uma variedade de compostos químicos.
As folhas foram primeiro homogeneizadas, depois centrifugadas, para concentrar as moléculas de interesse. O material vegetal concentrado foi então saponificado. O material extraído foi analisado por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas, para determinar a concentração de tocoferol - uma família de compostos de vitamina E tipicamente encontrados em plantas.
O material extraído também pode ser reconstituído "in vitro" à sua composição original. Neste exemplo, a saponificação foi usada para extrair carotenóides de plantas de espinafre, para serem posteriormente reconstituídos in vitro. O espinafre foi primeiro homogeneizado e depois centrifugado, para colher as moléculas de pigmento. Essas moléculas foram então suspensas em uma solução de hidróxido de potássio em um funil separador, iniciando a saponificação. Os carotenóides saponificados se separaram em uma camada de éter, que foi coletada e seca. Usando uma série de tampões de solução, os carotenóides - e outras moléculas de pigmentação - foram posteriormente reconstituídos - in vitro. Essa purificação permitiu a análise desses pigmentos sem a interferência de compostos orgânicos estruturados de forma semelhante.
Devido à sua capacidade de hidrolisar ésteres, a saponificação pode ser usada para "liberar" compostos que, de outra forma, estariam ligados a macromoléculas. Neste exemplo, uma etapa de saponificação anidra é usada para converter o 4-fluorobenzoato de etila no sal de ácido carboxílico do 4-fluorobenzoato de potássio. Essa desproteção por meio da saponificação permite a produção de SFB bruto - uma reação que não seria possível se a molécula permanecesse "presa".
Você acabou de assistir à introdução de JoVE à purificação de amostras de Uk'37 por meio da saponificação. Agora você deve entender como funciona a saponificação e como usá-la para purificar as alcenonas em um extrato lipídico total. Outros processos de purificação serão demonstrados em vídeos subsequentes.
Obrigado por assistir!
