Purificação de um extrato lipídico total com cromatografia em coluna

A cromatografia em coluna é uma técnica flexível para purificar a complexa mistura de compostos encontrados no sedimento. As misturas se separam à medida que se movem pela coluna e são coletadas em frações, cada uma contendo uma classe química diferente de compostos. Portanto, a cromatografia em coluna é frequentemente usada como uma etapa adicional de purificação após o isolamento inicial do composto desejado. Extratos orgânicos, como extratos lipídicos totais, podem ser misturas complexas de muitos compostos. Algumas técnicas de purificação, como a saponificação, introduzem compostos que podem danificar os instrumentos analíticos e, portanto, devem ser removidos antes da análise. Este vídeo faz parte de uma série sobre extração, purificação e análise de lipídios de sedimentos. Uma vez que um extrato lipídico total é coletado de uma amostra sedimentar, a cromatografia em coluna é usada para purificar alcenonas e GDGTs, dependendo da análise desejada.

Na cromatografia em coluna, uma mistura de compostos químicos é carregada em uma fase estacionária sólida, como o gel de sílica. Uma fase móvel, como um solvente orgânico, é então usada para eluír ou remover os compostos da coluna. A ordem em que os compostos são eluídos depende da força das interações dos compostos com o gel de sílica e com o eluente.

O eluído é coletado em frações, cada uma contendo diferentes compostos da mistura. Dependendo das propriedades dos compostos, um único solvente pode fornecer separação suficiente e eluir todos os compostos de interesse. Caso contrário, vários solventes são usados para eluir cada composto de interesse.

Os compostos polares, que têm uma distribuição desigual de carga, adsorvem fortemente ao gel de sílica polar, enquanto os compostos apolares adsorvem fracamente. Os solventes polares têm maior afinidade com a sílica gel e, portanto, são eluentes mais poderosos do que os solventes apolares. Assim, os solventes apolares eluem apenas compostos apolares, enquanto os solventes polares eluem compostos apolares e polares.

Quando os compostos desejados são moderadamente polares, os compostos apolares devem ser lavados da coluna com um solvente apolar antes de usar um solvente polar. Para evitar a eluição de compostos altamente polares indesejados, como ácidos, um eluente polar não deve ter mais poder de eluição do que o necessário para o composto mais polar desejado.

Agora que você entende os princípios da cromatografia em coluna, vamos passar por um procedimento de purificação de biomarcadores lipídicos de um extrato lipídico total por cromatografia em coluna de sílica gel.

Para remover contaminantes orgânicos, combustão pipetas de vidro borossilicato, frascos de vidro borossilicato e lã de vidro por 6 h a 550 ° C. Quando a vidraria estiver pronta para uso, monte um rack para guardar pipetas e frascos. Obtenha bulbos de pipeta, pinças limpas, uma espátula de laboratório, gel de sílica, hexano, diclorometano e metanol. Com uma pinça limpa, coloque um pequeno tufo de lã de vidro na boca de uma pipeta. Empurre suavemente a lã de vidro para o fundo da pipeta com a haste de outra pipeta para formar um tampão solto. Coloque cuidadosamente o gel de sílica na pipeta até a metade. Prenda a pipeta na vertical no rack. Fixe um frasco de vidro borossilicato de 4 mL abaixo da ponta da pipeta para coleta de resíduos. Em outro frasco de vidro borossilicato, suspenda até 10 mg de amostra seca do processo de saponificação em hexano. Se a amostra aderir às paredes do frasco para injetáveis, sonicar o frasco durante 5 min. O procedimento de cromatografia pode agora começar.

Para iniciar a cromatografia, lave a coluna de sílica gel com 3 volumes de hexano para remover bolhas de ar e impurezas. Em seguida, substitua o frasco para injetáveis de resíduos por um frasco vazio para a fração apolar. Com uma pipeta de vidro, coloque a amostra na coluna e deixe a suspensão penetrar no gel de sílica. Trabalhe rapidamente para que a coluna não seque durante o procedimento. Enxágue o frasco de amostra duas vezes com pequenas porções de hexano e transfira cada enxágue para a coluna. Continue adicionando hexano à coluna até que o frasco de coleta esteja quase cheio. Deixe todo o hexano terminar de entrar no gel de sílica. Em seguida, troque o frasco cheio por um frasco vazio para a fração polar média. Em seguida, lave o frasco de amostra com DCM e adicione-o à coluna 3 vezes. Continue adicionando DCM à coluna até que o frasco de coleta esteja quase cheio. Deixar o DCM terminar de mergulhar no gel de sílica e, em seguida, trocar o frasco cheio por um frasco vazio para a fração polar. Repita este processo com metanol.

Quando o frasco estiver quase cheio, deixe o metanol terminar de pingar no frasco e, em seguida, tampe todos os frascos. A fração polar média contém as alcenonas desejadas, enquanto os GDGTs estão na fração polar. Para amostras de alcenona particularmente sujas ou complexas, a fração polar média deve ser purificada com adução de uréia, antes da análise.

A cromatografia em coluna é amplamente utilizada em química como técnica analítica e de purificação.

Os nanotubos de carbono, ou CNTs, são cada vez mais usados em muitas indústrias, mas há uma preocupação crescente com seus efeitos na saúde humana. Variar as propriedades dos CNTs muda a forma como eles se comportam na água e no solo. Para investigar o quão bem meios porosos como areia e sujeira retêm CNTs, uma coluna foi preparada com solo poroso como fase estacionária. Primeiramente, as frações foram coletadas durante o carregamento da solução de NTC na coluna para analisar o transporte de NTCs através do solo. Em seguida, os CNTs ainda adsorvidos ao solo foram eluídos e as frações analisadas quanto à quantidade de CNTs que permaneceram no solo. Os resultados fornecem informações sobre a relação entre a funcionalização da superfície da NTC e seus mecanismos de transporte no ambiente.

A cromatografia em coluna pode ser operada em grandes e pequenas escalas e, portanto, é usada ao projetar sínteses para aplicações industriais. As sedas de aranha têm excelente resistência à tração e ductilidade, mas não podem ser colhidas em escala industrial. Após a síntese da proteína da seda, as proteínas recombinantes da seda são purificadas por cromatografia de afinidade, na qual a fase estacionária é projetada para capturar apenas a molécula desejada. A lavagem e eluição completas fornecem as frações de proteína pura necessárias para fiar a seda da aranha em grandes escalas.

Muitas fases estacionárias estão disponíveis para cromatografia em coluna. Uma fase estacionária pode não ser adequada para todos os produtos potenciais de uma síntese com um amplo escopo substituinte, como esta síntese de iodoaziridina. O produto bruto é misturado com várias fases estacionárias e a decomposição é avaliada por RMN de prótons. Como a RMN de prótons é altamente sensível, muitas fases estacionárias podem ser rastreadas para decomposição do produto usando uma pequena quantidade de produto bruto. A cromatografia em coluna é então realizada com a fase estacionária ideal, permitindo a purificação de compostos novos e altamente reativos.

Você acabou de assistir à introdução da JoVE à cromatografia em coluna para a purificação de um extrato lipídico total. O vídeo a seguir demonstrará como purificar ainda mais misturas complexas contendo alcenonas.

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