Purificação de um extrato lipídico total com cromatografia em coluna

1. Instalação e Preparação de Materiais

1. Obtenha um extrato lipídeco total (TLE) usando um método de extração de solvente (Sonication, Soxhlet ou Accelerated Solvent Extraction (ASE).
2. Junte o seguinte: pipetas e lâmpadas de vidro borossilicato queimados, gel de sílica, hexano, diclorometano (DCM) e metanol.
   1. Esses materiais podem ser adquiridos de qualquer revendedor químico. Os reagentes devem ser puros e livres de hidrocarbonetos.
3. Também obter lã de vidro queimada e frascos de vidro borossilicato de 4 mL.
4. Certifique-se de ter um meio de apoiar a coluna e os frascos de coleta durante o procedimento. Por exemplo, um suporte com grampos e um rack vil. Muitos laboratórios projetaram racks feitos sob medida que possuem várias colunas e frascos de coleta(Figura 2). Isso permite que muitas colunas sejam executadas ao mesmo tempo.

2. Métodos

1. Comece com a amostra seca em um frasco de 4 mL. Se a amostra pesa mais de ~ 10 mgs quando seca, pode precisar ser dividida antes de realizar os próximos passos, pois o gel de sílica só pode reagir com uma massa finita de matéria orgânica.
2. Suspenda a amostra em uma pequena quantidade de hexano. Este é o primeiro e menos polar dos três solventes usados neste experimento.
3. Se houver amostra presa no interior do frasco, sonicar as amostras por 5 minutos.
4. Coloque uma pequena quantidade de lã de vidro no topo de uma pipeta usando um conjunto de pinças limpas. Empurre suavemente a lã de vidro para o fundo da pipeta, usando outra pipeta, para formar um plugue.
5. Transfira cuidadosamente o gel de sílica para a pipeta até que esteja aproximadamente meio cheio.
6. Coloque um frasco de coleta de resíduos de 4 mL sob a coluna.
7. Mergulhe o gel de sílica na pipeta com 3 volumes de hexano. Isso condiciona a coluna, remove bolhas de ar e enxagua qualquer impureza do gel de sílica.
8. Uma vez feita a lavagem final, remova o frasco de coleta de resíduos e substitua-o por um frasco para coletar a fração apolar.
9. Transfira cuidadosamente toda a amostra em hexano para a coluna usando uma pipeta. Enxágüe o frasco de amostra mais duas vezes com pequenos volumes de hexano e transfira para a coluna. Deixe a hexana em que a amostra foi transferida para absorver completamente o gel de sílica. Em nenhum momento durante o procedimento o gel de sílica deve secar.
10. Continue adicionando hexano ao topo da amostra até que o frasco de coleta abaixo da coluna esteja quase cheio (~4 mL).
    1. Deixe que todo o hexano entre no gel de sílica antes de começar com o próximo solvente.
11. Coloque o frasco de coleta de polaridade média sob a coluna.
12. Adicione DCM à parte superior da coluna até que o frasco de coleta esteja quase cheio. Novamente, permita que todo o DCM entre no frasco de coleta antes de iniciar o próximo solvente.
13. Coloque o frasco de coleta polar sob a coluna.
14. Adicione metanol ao topo da coluna até que a coleção vil esteja quase cheia.