Identificação de Roedores II

A capacidade de identificar animais de pesquisa individuais é um aspecto essencial da manutenção de registros científicos e da coleta de dados. A distinção entre animais garante que o sujeito correto seja usado para o procedimento experimental pretendido.

Existem vários métodos permanentes e temporários que os cientistas usam para identificar animais de laboratório individuais. Neste vídeo, discutiremos métodos que envolvem tatuagem de cauda de roedor adulto, dedos de recém-nascidos e dedos adultos. A seguir, abordaremos a técnica de colocação de microchip comumente realizada em ratos adultos, seguida pelo método universal de identificação temporária que utiliza corantes não tóxicos.

Antes de nos aprofundarmos nos protocolos para esses métodos, vamos revisar as considerações, benefícios e deficiências de cada uma dessas técnicas. A tatuagem da cauda é benéfica em muitos protocolos de pesquisa, como experimentos envolvendo imagens de ressonância magnética ou aqueles em que os animais são geneticamente predispostos a doenças de pele, incluindo dermatite ulcerativa. Outra vantagem das tatuagens na cauda é que elas são facilmente visualizadas sem a necessidade de conter manualmente o animal.

Certos protocolos experimentais exigem a genotipagem de neonatos já no primeiro dia, o que torna essencial que esses filhotes sejam identificados permanentemente. O uso de tatuagens nos dedos dos pés permite que esses animais sejam identificados até que sejam grandes o suficiente para serem marcados ou perfurados nas orelhas. É uma boa ideia aplicar uma tatuagem semelhante no dedo do pé da mãe adulta para evitar que ela reaja exageradamente e limpe excessivamente a nova tatuagem de seu filhote. Embora existam várias vantagens em usar esse método, a desvantagem é que o procedimento requer habilidade, prática, mão firme e equipamento especializado.

O próximo método de identificação permanente em consideração é o microchip. Embora a implantação de microchips seja um processo relativamente fácil, existem vários fatores que limitam sua utilidade. Primeiro, esses chips são aproximadamente do tamanho de um grande grão de arroz e requerem uma agulha de calibre 10-12 para implantação, que é muito grande para um camundongo, limitando assim o método a ratos adultos. Em segundo lugar, os microchips são caros e, portanto, não são ideais para identificar um grande número de animais. Por fim, os microchips não podem ser usados nos experimentos envolvendo ressonância magnética. No entanto, se houver um grupo de animais valiosos, como animais reprodutores com genética única, que devem ser identificados permanentemente, os microchips podem ser usados.

O último método que discutiremos é a identificação temporária usando marcadores não tóxicos. Os marcadores não tóxicos são feitos para colorir a pele de animais de pesquisa. Este método é ideal para estudos de curto prazo que exigem que os animais sejam identificados por apenas algumas horas ou dias, embora os corantes possam permanecer visíveis por várias semanas. Alguns pesquisadores usam esses marcadores em conjunto com outros métodos de identificação para identificar facilmente animais específicos em um grupo.

Agora que discutimos o histórico, vamos aprender os procedimentos, começando com a tatuagem da cauda. Aqui, demonstraremos o procedimento em camundongos adultos, mas o mesmo pode ser aplicado para ratos desmamados e adultos.

Para minimizar qualquer apreensão ou angústia para os animais, a tatuagem da cauda deve ser realizada na sala de procedimentos e não na área de alojamento dos animais. Antes de aplicar a tatuagem, prenda o mouse usando um limitador de copo, com a cauda esticada na abertura. O flange do copo é mantido no lugar por meio de uma plataforma de vidro especializada. Em seguida, limpe a cauda com uma pequena quantidade de limpador de lenços diluído em um cotonete. Esta etapa é importante para remover qualquer acúmulo de incrustações e detritos que possam interferir na tatuagem. Em seguida, aplique óleo de tecido na pele da cauda com outro cotonete. Isso minimiza os danos aos tecidos, suavizando a pele e fornecendo lubrificação para a agulha da tatuagem. Além disso, o óleo dissolve a sujeira não removida pelo processo de limpeza e evita manchas de tinta na pele não tatuada. Agora você está pronto para aplicar a tatuagem.

Enquanto a máquina estiver desligada, mergulhe a ponta da agulha de tatuagem, que é uma lanceta ou agulha hipodérmica, no pigmento. Em seguida, ative a arma usando o pedal, coloque a ferramenta de tatuagem na cauda e leve a ponta da agulha até o local da tatuagem. Aproxime-se da pele com a agulha em um 90? ângulo e penetrar profundamente o suficiente na derme de tal forma que o pigmento seja depositado permanentemente. Uma mudança no som da agulha ativada pode ajudar a discernir a profundidade. Faça traços curtos e uniformes em uma direção, formando numerais e letras. Tente usar curvas e ângulos mínimos ao aplicar a tatuagem.

Para adicionar pigmento adicional, mergulhe a ponta da agulha no reservatório de corante para cada um ou dois caracteres para camundongos e cada caractere para ratos. Seque a tatuagem concluída com uma toalha de papel para remover o excesso de pigmento. A presença de sangue na tatuagem ou na toalha de papel indica que a tatuagem foi feita muito profunda e, portanto, é improvável que seja permanente. Reforce os caracteres finos com pigmento adicional, colocando a agulha paralela, não em cima, do pigmento já depositado. Limpe completamente o equipamento de tatuagem após cada uso, e uma agulha nova ou esterilizada e um novo suprimento de tinta devem ser usados entre as gaiolas para evitar a transmissão de doenças.

A seguir, aprenderemos como aplicar tatuagens nos dedos dos pés em recém-nascidos e adultos. Aqui, demonstraremos o procedimento em camundongos, mas as mesmas etapas são aplicáveis a ratos.

Os recém-nascidos são tatuados nos dedos dos pés, pois os cóccix não são ossificados e o comprimento da cauda é muito pequeno. Além disso, à medida que a cauda cresce, a pele seria esticada e os números podem ficar distorcidos, fracos e ilegíveis. Comece colocando uma mancha de pasta de tatuagem verde em uma superfície não porosa, como papel alumínio. Em seguida, coloque o filhote pré-desmamado em sua mão usando uma gaze. Posicione o pé entre o polegar e a dobra do dedo indicador para expor os dedos escolhidos para a tatuagem. Segure o pé próximo aos dedos dos pés para que o dedo selecionado tenha uma superfície sólida atrás dele para evitar que ele se dobre.

Agora, mergulhe a ponta de uma lanceta de 4,5 mm na pasta de tatuagem. Em seguida, cutuque o dedo do pé desejado de acordo com o código pré-determinado. Para garantir a permeação adequada, cutuque o mesmo local três vezes. Penetre na pele o suficiente para que a pasta deixe uma marca, mas evite cutucar tão profundamente que o dedo do pé sangre. Seque suavemente a nova tatuagem com a gaze para remover qualquer excesso de pasta de tatuagem e devolva o animal à sua gaiola. Use uma nova lanceta para a próxima ninhada. Um dia após o procedimento, verifique se a tatuagem está visível.

Quando os filhotes amamentados são tatuados, é aconselhável tatuar também a mãe. Isso pode impedi-la de exagerar e cuidar excessivamente das tatuagens de seu filhote. Para aplicar uma tatuagem no dedo do pé em um adulto, novamente, primeiro coloque uma pequena mancha de pasta de tatuagem verde em uma folha de alumínio. Em seguida, prenda o animal usando um cone de plástico ou um limitador de acrílico que permita o acesso às patas traseiras. Estenda o pé do dispositivo de contenção e posicione o pé entre o polegar e a dobra do dedo indicador para expor os dedos escolhidos para a tatuagem.

Agora, mergulhe a ponta de uma lanceta de 5 mm na pasta de tatuagem. E, como antes, aplique a tatuagem cutucando e perfurando a pele do dedo do pé desejado pelo menos três vezes para garantir a penetração adequada. Em seguida, seque suavemente a tatuagem para remover qualquer excesso de pasta e devolva o animal à gaiola. Assim como nos recém-nascidos, verifique a tatuagem um dia após o procedimento. Se a marca for visível no dia seguinte à tatuagem, ela deve permanecer visível por toda a vida do animal. Se estiver fraco ou não estiver visível, refaça a tatuagem conforme descrito anteriormente.

O próximo método de identificação que discutiremos envolve a implantação de microchips em roedores. O chip comumente usado para rotular animais de laboratório é um chip de identificação por radiofrequência, ou RFID. Normalmente, o chip é pré-carregado em agulhas, que podem ser colocadas no aplicador. Para a inserção do chip, use um tubo de acrílico para conter o animal, certificando-se de que você ainda possa segurar a pele sobre os ombros. Primeiro, cubra a pele para criar um bolso. Em seguida, coloque a agulha através da pele, chanfrada, paralela à coluna vertebral e direcionada para a cauda. Ejetar o microchip por via subcutânea e retirar a agulha. Aperte a pele fechada no local da injeção para evitar que o chip siga a agulha para fora da pele. Continue a aplicar pressão para fornecer hemostasia para qualquer sangramento da pele. Retire o animal do dispositivo de contenção e digitalize o chip utilizando o leitor fornecido pelo fabricante para confirmar o código de identificação.

Por fim, vamos aprender como aplicar corantes temporários em roedores para identificação. Vamos começar com ratos. Primeiro, contenha o animal de forma que a área entre as omoplatas fique acessível. Esta parte do corpo está protegida contra auto-limpeza. Coloque uma mancha ou faixa do corante no pelo nesta área e coloque o animal de volta em sua gaiola.

Para ratos, prenda o animal manualmente segurando a cauda e segurando-a esticada. Isso garante que a área para aplicação de corante seja facilmente acessível, que pode ser cabeça, ombros ou garupa. Coloque uma mancha ou mecha da tinta na pele. Às vezes é possível aplicar corante não tóxico sem restringir o animal. Verifique as marcações nesses animais periodicamente, especialmente se você os estiver usando como único identificador por mais de alguns dias.

Agora que revisamos os procedimentos desses diferentes métodos de identificação, vamos ver como os cientistas os estão usando em diferentes estudos de pesquisa hoje.

O uso de roedores em experimentos de comportamento é bastante comum. Aqui, os pesquisadores usaram a tatuagem da cauda para marcar os animais permanentemente e depois os observaram por vários dias em um ambiente de gaiola construído artificialmente. Os dados coletados revelaram diferenças nos comportamentos, como a distância percorrida, entre os animais controle e os experimentais, durante um período de 10 dias após a cirurgia.

Em outro experimento de comportamento, os pesquisadores realizaram tatuagens nos dedos dos pés em recém-nascidos e os colocaram em uma caixa de gravação com microfones especiais para gravar vocalizações ultrassônicas. O objetivo deste experimento foi observar as diferenças na taxa de chamada, ou seja, o número de vocalizações por minuto, em camundongos do tipo selvagem e deficientes em Shank2 - um modelo de autismo - durante o período neonatal de 12 dias e na idade adulta.

Por fim, como discutido anteriormente, o uso de corante não tóxico é uma maneira eficiente de marcar animais para experimentos de curto prazo. Aqui, os cientistas estavam interessados na expressão transitória de uma proteína plasmática. Então, eles marcaram os animais com marcadores temporários, injetaram o DNA do plasmídeo por via intravenosa e coletaram a amostra de sangue dois dias depois para determinar a expressão da proteína usando a técnica de western blot.

Você acabou de assistir à introdução de JoVE à tatuagem, colocação de microchips e métodos de identificação temporária para camundongos e ratos de laboratório. A identificação animal é um componente primário da manutenção de registros em pesquisa. Portanto, ao escolher o método de identificação apropriado, muitos fatores devem ser deliberados. Isso inclui o nível de desconforto para o animal, a facilidade da técnica, as necessidades experimentais e, finalmente, o custo associado ao método. Como sempre, obrigado por assistir!