Método de adição de padrão

1. Preparando os Reagentes

1. Solução Al³⁺ padrão de 100 ppm: Dissolver 0,9151 g de nitrato de alumínio (Al(NO₃)₃•9H₂O) em um frasco volumoso de 1 L com água DI.
2. Solução 8HQ em ácido acético de 1 M (2% wt/vol): Adicione 2,0 g de 8-hidroxiquinolina a um frasco volumoso de 100 mL.
3. Adicione cuidadosamente 5,74 mL de ácido acético glacial ao frasco de 100 mL e, em seguida, dilua para a marca com água DI. Isso permite que a hidroxiquinolina 8 se dissolva em fase aquosa.
4. 1 M NH₄⁺/NH₃ tampão (pH~8): Adicione 20 g de acetato de amônio (NH₄OAc) a uma garrafa de 100 mL.
5. Adicione 7 mL de hidróxido de amônio de 30% a esta garrafa de 100 mL e dilua à marca com água DI. Isso ajuda a neutralizar o ácido na solução 8HQ quando combinado.
6. Outros reagentes incluem sulfato de sódio anidro (Na₂SO₄) e clorofórmio (grau spec).

2. Preparando as Amostras

1. Prepare uma solução Al 3+ padrão de^1,00 ppm adicionando 1,0 mL da solução Al³⁺ de estoque de 100 ppm com uma pipeta a um frasco volutrico de 100 mL.
2. Coloque seis funis separados de 125 mL nos anéis que estão em um grande suporte de anel localizado no capô. Eles devem ser rotulados da seguinte forma: BL, 0, 1, 2, 3, 4. Certifique-se de que todos os vidros estão escrupulosamente limpos, pois é difícil obter resultados quantitativos se pequenas contas de clorofórmio grudarem nas paredes dos vidros.
3. Adicione 25,00 mL da solução Al³⁺ desconhecida aos cinco funis separados rotulados 0, 1, 2, 3 e 4. Neste exemplo, a concentração desconhecida é de 0,110 ppm.
4. Adicione 0, 1,00, 2,00, 3,00 e 4,00 mL da solução Al³⁺ padrão de 1,00 ppm, respectivamente, aos 5 funis com uma pipeta de 1 mL.
5. Prepare um BLANK adicionando 25,00 mL de água destilada ao funil separador rotulado BL.
6. Adicione 1,0 mL da solução de 8 hidroxiquinolina com uma pipeta para cada uma das seis soluções.
7. Adicione 3,0 mL de solução tampão com uma pipeta a cada uma das seis soluções.
8. Extrair cada solução duas vezes com 10 mL de clorofórmio, tremendo vigorosamente por 1 min cada vez. Lembre-se de ocasionalmente ventilar o funil separador para liberar o acúmulo de pressão. (NOTA: Uma boa extração só ocorre quando há muito contato líquido-líquido entre as fases).
9. Colete o clorofórmio em um béquer limpo e seco de 100 mL rotulado. O clorofórmio tem uma densidade de cerca de 1,5 g/cm^3,por isso é a camada inferior. Não deve haver vestígios de cor amarela deixados na fase aquosa após uma extração completa.
10. Transfira o extrato combinado de clorofórmio de cada béquer em seu respectivo frasco volumoso de 25 mL e dilua para a marca com clorofórmio. Certifique-se de colocar rolhas em cada frasco volumoso para evitar que qualquer clorofórmio evapore.
11. Adicione ~1 g de sulfato de sódio anidro (Na₂SO₄) a cada um dos seis béquers de 100 mL do passo 2.9. O sulfato de sódio ajuda a remover qualquer traço de água que possa estar presente no extrato de clorofórmio.
12. Transfira as soluções de volta para seus respeitados béquers. Gire cuidadosamente para facilitar a desidratação de qualquer água da amostra.
13. Decantar os extratos de clorofórmio em uma célula fluorímetro de quartzo (Nota: Clorofórmio dissolverá uma célula de poliestireno plástico).

3. Selecionando o comprimento de onda de excitação

Determine os comprimentos de onda de excitação e emissão executando varreduras, em seguida, basta ler e registrar a intensidade de fluorescência de todas as amostras nesses valores. As larguras de banda de excitação e emissão são predefinidas a 5 nm. O complexo absorve no UV próximo, então o comprimento de onda de excitação deve ser de cerca de 385 nm. Inicialmente, monitore a fluorescência a 500 nm no ramo de emissões.

1. No Fluoriímetro, verifique se tanto os ventiladores de resfriamento interno quanto externo no fluorímetro estão ligados antes de ligar a lâmpada de xenônio. A lâmpada de xenônio fica muito quente, e requer resfriamento contínuo.
2. Ligue a alta tensão (HV) ao detector PMT a 400 V.
3. Abra as duas janelas.
4. Abra o programa de aquisição de dados no computador, aqui é "100nmFluorScan".
5. Coloque a solução "Amostra + 2 mL adicionada" (2) na célula de quartzo para usar para determinar os melhores comprimentos de onda de excitação e emissão.
6. Com o comprimento de onda de emissão inicialmente definido em 500 nm, execute uma varredura de excitação de 335-435 nm com uma velocidade de varredura de 2 nm/s.
7. A partir do enredo de fluorescência resultante, determine o comprimento de onda de fluorescência máxima(EXλ_max),e defina o instrumento para esse valor.

4. Selecionando o comprimento de onda de emissão

1. Defina o comprimento de onda de emissão de fluoriímetro para 450 nm.
2. Defina a faixa de comprimento de onda de emissão para executar uma varredura de 100 nm de 450-550 nm.
3. Para iniciar a varredura, clique no botão "iniciar a prova" no programa ao mesmo tempo em que pressionar o botão "START" no painel frontal do fluorímetro.
4. A partir do enredo de fluorescência resultante, determine o comprimento máximo de onda de emissão de fluorescência(EMλ_max),e defina o instrumento para esse valor(Figura 2).

Figura 2. Determinando os comprimentos_{de onda máximo} EXλ e EM λ.

5. Medindo a fluorescência das amostras

1. Todas as amostras são executadas em EMλ_max e EXλ_max. Exames não são necessários para cada amostra, mas apenas o valor da fluorescência nessas condições. Começando com a amostra mais diluída (em branco), coloque em uma célula de quartzo e, em seguida, em instrumento. Regisso recorde a intensidade fluorescente no caderno de laboratório.
2. Repita para todas as outras amostras.
3. Lembre-se de que a Intensidade Relativa Em Branco deve ser subtraída das Intensidades Relativas de cada solução antes de criar o gráfico de calibração.

6. Criando o gráfico de adição padrão

1. Plote a intensidade da fluorescência vs. μg de Al³⁺ adicionado.
2. Determine o valor de menor quadrado do enredo resultante e registo a inclinação e intercepte.
3. Determine o μg de Al³⁺ na amostra desconhecida da equação μg de Al³⁺ = -b/m
4. Sabendo que o alumínio desconhecido tinha um volume de 25,0 mL adicionado a cada amostra, determinar a concentração do alumínio no desconhecido.