Método de adição de padrão

O método de adição padrão é uma técnica de análise quantitativa usada para minimizar os efeitos da matriz que interferem nos sinais de medição do analito.

As concentrações de componentes desconhecidos são frequentemente elucidadas por meio de uma variedade de técnicas analíticas, como espectroscopia de luz, espectrometria de massa e eletroquímica. No entanto, a medição pode ser afetada por outros componentes da amostra, chamados de matriz, e causar a redução ou aprimoramento inadvertido do sinal, chamados de efeitos de matriz. Esses efeitos podem distorcer os resultados e causar erros significativos na análise.

O método de adição padrão pode ser usado para minimizar os efeitos da matriz nos sinais de medição. Isso é feito adicionando volumes precisos de uma solução de analito conhecida à amostra.

Este vídeo apresentará os fundamentos do método de adição de padrões e demonstrará como realizar a técnica em laboratório usando uma medição de fluorescência.

Os efeitos da matriz podem surgir em amostras complexas onde várias outras moléculas interagem com o analito. Por exemplo, isso pode ocorrer quando as moléculas se ligam ou se aglomeram com o analito, alterando assim sua capacidade de fluorescer. Ou a matriz pode alterar a força iônica da solução geral, alterando propriedades específicas do analito.

Para atenuar estes efeitos utilizando o método da adição de padrão, adiciona-se uma gama de volumes de uma solução padrão de analito a volumes iguais da amostra. Os volumes da solução são então iguais usando solvente.

Em seguida, o sinal é medido para as amostras com e sem a adição padrão. Os dados são plotados como intensidade versus a quantidade do padrão adicionado à amostra, em vez de uma curva de calibração clássica. A concentração real da substância a analisar num dado balão é definida pela seguinte equação. A resposta instrumental será igual a algumas vezes constantes a concentração de analito. A equação resultante assume a forma linear y = mx + b. Assim, quando o gráfico é extrapolado para absorbância zero, a interceptação é igual à concentração desconhecida da amostra.

O gráfico de sinal deve ser linear ao longo da faixa de concentração em questão. Além disso, a interferência não deve variar à medida que a proporção entre o analito e a matriz da amostra muda. Finalmente, a matriz em si não deve gerar nenhum sinal de medição por conta própria.

O experimento a seguir estuda o alumínio, uma espécie não fluorescente, reagindo-o com 8-hidroxiquinolina, ou 8HQ, para formar o complexo ALQ3 fluorescente.

A fluorescência do complexo de alumínio em um solvente orgânico é medida e, em seguida, relacionada à concentração da solução original de alumínio. Essa abordagem é comum na análise de íons metálicos.

Agora que os fundamentos do método de adição padrão foram delineados e os fundamentos do experimento explicados, vamos realizar a técnica em laboratório.

Primeiro, prepare a solução estoque de alumínio de 100 ppm em água e, em seguida, use-a para preparar uma solução padrão de 1 ppm.

Em seguida, adicione 2 g de 8-hidroxiquinolina, ou 8HQ, a um balão volumétrico de 100 mL.

Adicione cuidadosamente 5,74 mL de ácido acético glacial e, em seguida, dilua até a marca de 100 mL com água deionizada. Esta etapa permite que o 8HQ se dissolva na fase aquosa.

Em seguida, prepare o tampão adicionando 20 g de acetato de amônio e 7 mL de hidróxido de amônio a 30% a um frasco marcado de 100 mL e dilua. Verifique o pH com um indicador de pH. Este tampão ajuda a neutralizar o ácido na solução 8HQ quando combinado.

Outros reagentes necessários incluem sulfato de sódio anidro e clorofórmio de grau espectrofotométrico.

Agora prepare as amostras, neste caso extraindo a amostra aquosa para a fase orgânica usando extração líquido-líquido. Coloque seis funis separatórios de 125 mL em anéis de suporte de anel dentro do capô. Certifique-se de que todos os copos estejam escrupulosamente limpos, pois os copos sujos distorcerão os resultados. Rotule sequencialmente os funis como "em branco", "0", "1", "2", "3" e "4".

Usando uma pipeta, adicione 25 mL da solução de alumínio desconhecida a cada um dos cinco funis separatórios rotulados de "0" a "4". Prepare o branco adicionando 25 mL de água deionizada ao funil rotulado como "branco".

Em seguida, adicione 1, 2, 3 e 4 mL da solução padrão de 1 ppm aos funis numerados correspondentes. Não adicione nenhuma solução padrão aos funis em branco ou 0.

Adicione 1 mL da solução 8HQ e 3 mL de solução tampão a cada um dos 6 funis.

Efectuar uma extracção líquido-líquido adicionando 10 ml de clorofórmio a cada balão. Agite o funil vigorosamente e, ocasionalmente, ventile o funil para liberar o acúmulo de pressão. Coloque o funil de volta no anel e deixe as camadas líquidas se separarem.

Em seguida, colete a fase de clorofórmio em um copo limpo, seco e rotulado de 100 mL. Como o clorofórmio tem uma densidade maior que a água, é a camada inferior do funil.

Transferir o extracto de clorofórmio para um balão volumétrico de 25 ml e tampar cada balão para evitar a evaporação.

Efectuar uma segunda extracção líquido-líquido na solução aquosa restante, adicionando 10 ml de clorofórmio a cada funil. Agitar o funil, como antes, para transferir a substância a analisar restante para a fase de clorofórmio. Não deve haver cor amarela na fase aquosa superior.

Repita a segunda extração para cada funil e, em seguida, colete as fases do clorofórmio nos copos rotulados correspondentes. Despejar o clorofórmio coletado em seus respectivos balões volumétricos e diluir até a marca com clorofórmio fresco.

Para remover vestígios de água, adicione cerca de 1 g de sulfato de sódio anidro a cada um dos seis copos de 100 mL. Transfira as soluções de volta para seus respectivos copos e gire para facilitar a desidratação da amostra.

Transvase o extrato de clorofórmio em uma célula de fluorímetro de quartzo.

Configure o fluorímetro de acordo com as instruções do fabricante e ajuste a tensão para 400 V. Em seguida, abra o programa de aquisição de dados no computador.

Use a amostra 2 para determinar os melhores comprimentos de onda de excitação e emissão. Defina o comprimento de onda de emissão para 500 nm e execute uma varredura de excitação de 335?435 nm, com uma velocidade de varredura de 2 nm/s.

A partir do gráfico de fluorescência, determine o comprimento de onda máximo para excitação. Defina o instrumento para esse valor de comprimento de onda de excitação, neste caso 399 nm.

Em seguida, determine o comprimento de onda de emissão realizando uma varredura de 450-550 nm. A partir do gráfico de fluorescência resultante, determine o comprimento de onda máximo e defina o comprimento de onda de emissão, neste caso 520 nm.

Meça cada amostra, incluindo o branco no comprimento de onda de excitação e emissão selecionado. Registre cada leitura de intensidade de fluorescência.

Subtraia a fluorescência medida da amostra em branco de cada uma das outras 5 amostras.

Plote a intensidade de fluorescência de cada uma das cinco amostras versus a quantidade de alumínio adicionada à amostra. Determine o valor de mínimos quadrados do gráfico resultante e registre a inclinação e a interceptação.

O gráfico de intensidade de fluorescência versus quantidade de alumínio adicionado produziu uma linha de mínimos quadrados, conforme mostrado. A quantidade de alumínio na amostra pode então ser calculada usando esta linha. Como a quantidade de desconhecido adicionado foi de 25 mL, o valor determinado, 2,916 ?g?, é dividido por 25 mL. Isso dá um resultado final de 0,117 μg / mL ou 0,117 ppm. Isso é bem próximo do valor conhecido de 0,110 ppm.

Agora, vamos examinar algumas outras técnicas analíticas que podem ter resultados distorcidos devido a efeitos de matriz.

A espectroscopia de absorção atômica é um método analítico que mede a absorbância da luz por um analito alvo na fase gasosa. Para a maioria das amostras, uma curva de calibração simples relacionando a absorção com a concentração da amostra pode servir como um método confiável para quantificar uma concentração desconhecida.

No entanto, essa técnica pode perder precisão se outros componentes da mistura interagirem com o analito alvo e suprimirem ou aumentarem a absorção. O método de adição padrão pode ser usado neste caso para explicar os efeitos dessas interações, especialmente em amostras onde a matriz não pode ser removida antes da análise.

A calibração do instrumento desempenha um papel crucial na precisão de uma medição. O método de adição de padrão é frequentemente usado para auxiliar na calibração de instrumentos como o ICP-MS. O ICP-MS é um método comparativo, o que significa que a medição de uma amostra desconhecida é baseada na medição de um padrão químico.

Assim, a incerteza de uma medição de uma incógnita não pode ser melhor do que a incerteza da calibração. O método de adição padrão pode, portanto, ser usado para criar uma curva de calibração mais precisa do que o método padrão e levar em conta as interações da matriz na amostra.

Muitas moléculas biológicas são analisadas usando cromatografia líquida de alta eficiência, ou HPLC. HPLC é uma técnica que separa e analisa misturas complexas com base em propriedades de moléculas, como polaridade, carga e tamanho. O momento em que o analito sai da coluna permite que o usuário identifique cada componente da mistura.

As moléculas biológicas geralmente podem interagir em uma mistura e são muito afetadas pela matriz em que estão suspensas. Freqüentemente, o método de adição padrão é usado para criar uma curva de calibração que leva em conta esses efeitos.

Você acabou de assistir à introdução de JoVE ao método de adição padrão. Agora você deve entender como executar a técnica para levar em conta os efeitos da matriz na análise de amostra.

Obrigado por assistir!