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Analytical Chemistry

Método de adição de padrão

Method of Standard Addition

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Analytical Chemistry

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JoVE Science Education Analytical Chemistry

Method of Standard Addition

3.2: Internal Standards

3.7: X-ray Fluorescence (XRF)

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11:28 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratório do Dr. Paul Bower – Universidade purdue

O método de adições padrão é um método de análise quantitativa, que é frequentemente utilizado quando a amostra de interesse tem múltiplos componentes que resultam em efeitos matriciais, onde os componentes adicionais podem reduzir ou melhorar o sinal de absorção de analitos. Isso resulta em erros significativos nos resultados da análise.

Adições padrão são comumente usadas para eliminar efeitos matriciais de uma medição, uma vez que se presume que a matriz afeta todas as soluções igualmente. Além disso, é usado para corrigir as separações de fase química realizadas no processo de extração.

O método é realizado lendo a intensidade experimental (neste caso fluorescente) da solução desconhecida e, em seguida, medindo a intensidade do desconhecido com quantidades variadas de padrão conhecido adicionado. Os dados são plotados como intensidade de fluorescência versus. a quantidade do padrão adicionado (o desconhecido em si, sem padrão adicionado, é plotado no eixo y). A linha de quadrados menos cruza o eixo x no negativo da concentração do desconhecido, como mostra a Figura 1.

Figura 1. Representação gráfica do método de adição padrão.

Principles

Neste experimento, o método de adições padrão é demonstrado como uma ferramenta analítica. O método é um procedimento para a análise quantitativa de uma espécie sem a geração de uma curva de calibração típica. A análise de adição padrão é realizada medindo a intensidade espectroscópica antes e depois da adição de alíquotas precisas de uma solução padrão conhecida do analito.

Este experimento estuda espécies não fluorescentes reagindo-as de forma a formar um complexo fluorescente. Esta abordagem é comumente usada na investigação de íons metálicos. Íons de alumínio (Al³⁺) serão determinados formando um complexo com 8-hidroxiquinolina (8HQ). O Al³⁺ é precipitado por 8HQ a partir de solução aquosa e, em seguida, é extraído em clorofórmio; a fluorescência da solução de clorofórmio é medida e relacionada à concentração da solução Original Al^3+. A sensibilidade na faixa de parte por milhão (ppm ou μg/mL) é esperada para este experimento.

A reação é

A quantidade de alumínio em cada amostra durante este experimento é calculada da seguinte forma:

Em branco	0
Padrão desconhecido + 0 mL	V_Desconhecido(C_Desconhecido) = 25 mL(C_Desconhecido)
Padrão desconhecido + 1 mL	V_Desconhecido(C_Desconhecido) +_PadrãoV_(PadrãoC ) = 25 mL (C_Desconhecido) + 1 mL (1 μg/mL)
Padrão desconhecido + 2 mL	V_Desconhecido(C_Desconhecido) +_PadrãoV_(PadrãoC)= 25 mL(C_Desconhecido)+ 2 mL (1 μg/mL)
Padrão desconhecido + 3 mL	V_Desconhecido(C_Desconhecido) +_PadrãoV_(PadrãoC)= 25 mL(C_Desconhecido)+ 3 mL (1 μg/mL)
Padrão desconhecido + 4 mL	V_Desconhecido(C_Desconhecido) +_PadrãoV_(PadrãoC)= 25 mL(C_Desconhecido)+ 4 mL (1 μg/mL)

Procedure

1. Preparando os Reagentes

Solução Al³⁺ padrão de 100 ppm: Dissolver 0,9151 g de nitrato de alumínio (Al(NO₃)₃•9H₂O) em um frasco volumoso de 1 L com água DI.
Solução 8HQ em ácido acético de 1 M (2% wt/vol): Adicione 2,0 g de 8-hidroxiquinolina a um frasco volumoso de 100 mL.
Adicione cuidadosamente 5,74 mL de ácido acético glacial ao frasco de 100 mL e, em seguida, dilua para a marca com água DI. Isso permite que a hidroxiquinolina 8 se dissolva em fase aquosa.
1 M NH₄⁺/NH₃ tampão (pH~8): Adicione 20 g de acetato de amônio (NH₄OAc) a uma garrafa de 100 mL.
Adicione 7 mL de hidróxido de amônio de 30% a esta garrafa de 100 mL e dilua à marca com água DI. Isso ajuda a neutralizar o ácido na solução 8HQ quando combinado.
Outros reagentes incluem sulfato de sódio anidro (Na₂SO₄) e clorofórmio (grau spec).

2. Preparando as Amostras

Prepare uma solução Al 3+ padrão de^1,00ppm adicionando 1,0 mL da solução Al³⁺de estoque de 100 ppm com uma pipeta a um frasco volutrico de 100 mL.
Coloque seis funis separados de 125 mL nos anéis que estão em um grande suporte de anel localizado no capô. Eles devem ser rotulados da seguinte forma: BL, 0, 1, 2, 3, 4. Certifique-se de que todos os vidros estão escrupulosamente limpos, pois é difícil obter resultados quantitativos se pequenas contas de clorofórmio grudarem nas paredes dos vidros.
Adicione 25,00 mL da solução Al³⁺desconhecida aos cinco funis separados rotulados 0, 1, 2, 3 e 4. Neste exemplo, a concentração desconhecida é de 0,110 ppm.
Adicione 0, 1,00, 2,00, 3,00 e 4,00 mL da solução Al³⁺padrão de 1,00 ppm, respectivamente, aos 5 funis com uma pipeta de 1 mL.
Prepare um BLANK adicionando 25,00 mL de água destilada ao funil separador rotulado BL.
Adicione 1,0 mL da solução de 8 hidroxiquinolina com uma pipeta para cada uma das seis soluções.
Adicione 3,0 mL de solução tampão com uma pipeta a cada uma das seis soluções.
Extrair cada solução duas vezes com 10 mL de clorofórmio, tremendo vigorosamente por 1 min cada vez. Lembre-se de ocasionalmente ventilar o funil separador para liberar o acúmulo de pressão. (NOTA: Uma boa extração só ocorre quando há muito contato líquido-líquido entre as fases).
Colete o clorofórmio em um béquer limpo e seco de 100 mL rotulado. O clorofórmio tem uma densidade de cerca de 1,5 g/cm^3,por isso é a camada inferior. Não deve haver vestígios de cor amarela deixados na fase aquosa após uma extração completa.
Transfira o extrato combinado de clorofórmio de cada béquer em seu respectivo frasco volumoso de 25 mL e dilua para a marca com clorofórmio. Certifique-se de colocar rolhas em cada frasco volumoso para evitar que qualquer clorofórmio evapore.
Adicione ~1 g de sulfato de sódio anidro (Na₂SO₄) a cada um dos seis béquers de 100 mL do passo 2.9. O sulfato de sódio ajuda a remover qualquer traço de água que possa estar presente no extrato de clorofórmio.
Transfira as soluções de volta para seus respeitados béquers. Gire cuidadosamente para facilitar a desidratação de qualquer água da amostra.
Decantar os extratos de clorofórmio em uma célula fluorímetro de quartzo (Nota: Clorofórmio dissolverá uma célula de poliestireno plástico).

3. Selecionando o comprimento de onda de excitação

Determine os comprimentos de onda de excitação e emissão executando varreduras, em seguida, basta ler e registrar a intensidade de fluorescência de todas as amostras nesses valores. As larguras de banda de excitação e emissão são predefinidas a 5 nm. O complexo absorve no UV próximo, então o comprimento de onda de excitação deve ser de cerca de 385 nm. Inicialmente, monitore a fluorescência a 500 nm no ramo de emissões.

No Fluoriímetro, verifique se tanto os ventiladores de resfriamento interno quanto externo no fluorímetro estão ligados antes de ligar a lâmpada de xenônio. A lâmpada de xenônio fica muito quente, e requer resfriamento contínuo.
Ligue a alta tensão (HV) ao detector PMT a 400 V.
Abra as duas janelas.
Abra o programa de aquisição de dados no computador, aqui é “100nmFluorScan”.
Coloque a solução “Amostra + 2 mL adicionada” (2) na célula de quartzo para usar para determinar os melhores comprimentos de onda de excitação e emissão.
Com o comprimento de onda de emissão inicialmente definido em 500 nm, execute uma varredura de excitação de 335-435 nm com uma velocidade de varredura de 2 nm/s.
A partir do enredo de fluorescência resultante, determine o comprimento de onda de fluorescência máxima(EXλ_max),e defina o instrumento para esse valor.

4. Selecionando o comprimento de onda de emissão

Defina o comprimento de onda de emissão de fluoriímetro para 450 nm.
Defina a faixa de comprimento de onda de emissão para executar uma varredura de 100 nm de 450-550 nm.
Para iniciar a varredura, clique no botão “iniciar a prova” no programa ao mesmo tempo em que pressionar o botão “START” no painel frontal do fluorímetro.
A partir do enredo de fluorescência resultante, determine o comprimento máximo de onda de emissão de fluorescência(EMλ_max),e defina o instrumento para esse valor(Figura 2).

Figura 2. Determinando os comprimentos_{de onda máximo} EXλ e EM λ.

5. Medindo a fluorescência das amostras

Todas as amostras são executadas em EMλ_max e EXλ_max. Exames não são necessários para cada amostra, mas apenas o valor da fluorescência nessas condições. Começando com a amostra mais diluída (em branco), coloque em uma célula de quartzo e, em seguida, em instrumento. Regisso recorde a intensidade fluorescente no caderno de laboratório.
Repita para todas as outras amostras.
Lembre-se de que a Intensidade Relativa Em Branco deve ser subtraída das Intensidades Relativas de cada solução antes de criar o gráfico de calibração.

6. Criando o gráfico de adição padrão

Plote a intensidade da fluorescência vs. μg de Al³⁺ adicionado.
Determine o valor de menor quadrado do enredo resultante e registo a inclinação e intercepte.
Determine o μg de Al³⁺ na amostra desconhecida da equação μg de Al³⁺ = -b/m
Sabendo que o alumínio desconhecido tinha um volume de 25,0 mL adicionado a cada amostra, determinar a concentração do alumínio no desconhecido.

O método de adição padrão é uma técnica de análise quantitativa utilizada para minimizar efeitos matriciais que interferem com sinais de medição de analitos.

Concentrações de componentes desconhecidas são frequentemente elucidadas através de uma série de técnicas analíticas, como espectroscopia de luz, espectrometria de massa e eletroquímica. No entanto, a medida pode ser afetada por outros componentes da amostra, chamado de matriz, e causar a redução inadvertida ou aprimoramento do sinal, chamados efeitos matriciais. Esses efeitos podem distorcer resultados e causar erros significativos na análise.

O método de adição padrão pode ser usado para minimizar os efeitos da matriz nos sinais de medição. Isso é realizado adicionando volumes precisos de uma solução analito conhecida à amostra.

Este vídeo introduzirá o básico do método de adição de padrões e demonstrará como executar a técnica em laboratório usando uma medição de fluorescência.

Efeitos matriciais podem surgir em amostras complexas onde uma série de outras moléculas interagem com o analito. Por exemplo, isso pode ocorrer quando as moléculas se ligam ou aglomeram com o analito, alterando assim sua capacidade de fluoresce. Ou a matriz pode mudar a força iônica da solução global, mudando propriedades específicas do analito.

Para mitigar esses efeitos usando o método de adição padrão, uma gama de volumes de uma solução padrão analito é adicionada a volumes iguais da amostra. Os volumes da solução são então iguais usando solvente.

Em seguida, o sinal é medido para as amostras com e sem a adição padrão. Os dados são plotados como intensidade versus a quantidade do padrão adicionado à amostra, em vez de uma curva de calibração clássica. A concentração real do analito em qualquer frasco é definida pela seguinte equação. A resposta instrumental igualará alguns tempos constantes a concentração de analito. A equação resultante toma a forma linear y=mx+b. Assim, quando o enredo é extrapolado a absorção zero, a interceptação é igual à concentração desconhecida da amostra.

O gráfico do sinal deve ser linear sobre o intervalo de concentração de preocupação. Além disso, a interferência não deve variar como a razão de analito para alteração matricial amostral. Finalmente, a matriz em si não deve gerar sinais de medição por conta própria.

O experimento a seguir estuda o alumínio, uma espécie não fluorescente, reagindo-o com 8-hidroxiquinolina, ou 8HQ, para formar o complexo fluorescente ALQ_3.

A fluorescência do complexo de alumínio em um solvente orgânico é medida e, em seguida, relacionada à concentração da solução original de alumínio. Essa abordagem é comum na análise de íons metálicos.

Agora que o básico do método de adição padrão foi delineado, e o básico do experimento explicou, vamos executar a técnica em laboratório.

Primeiro, prepare a solução de estoque de alumínio de 100 ppm na água e, em seguida, use-a para preparar uma solução padrão de 1 ppm.

Em seguida, adicione 2 g de 8-hidroxiquinolina, ou 8HQ, a um frasco volumoso de 100 mL.

Adicione cuidadosamente 5,74 mL de ácido acético glacial e, em seguida, dilua para a marca de 100 mL com água deionizada. Esta etapa permite que o 8HQ se dissolva na fase aquosa.

Em seguida, prepare o tampão adicionando 20 g de acetato de amônio e 7 mL de hidróxido de amônio de 30% a uma garrafa marcada de 100 mL e diluir. Verifique o pH com uma vara indicadora de pH. Este buffer ajuda a neutralizar o ácido na solução 8HQ quando combinado.

Outros reagentes necessários incluem sulfato de sódio anidro e clorofórmio de grau espectrofotmétrico.

Agora prepare as amostras, neste caso, extraindo a amostra aquosa na fase orgânica usando extração líquido-líquido. Coloque seis funis separados de 125 mL em anéis de suporte dentro do capô. Certifique-se de que todos os vidros estão escrupulosamente limpos, pois os vidros sujos distorcerão os resultados. Sequencialmente rotulam os funis como “em branco”, “0”, “1”, “2”, “3” e “4”.

Utilizando uma pipeta, adicione 25 mL da solução de alumínio desconhecida a cada um dos cinco funis separados rotulados de “0” a “4”. Prepare o espaço em branco adicionando 25 mL de água deionizada ao funil rotulado como “em branco”.

Em seguida, adicione 1, 2, 3 e 4 mL da solução padrão de 1 ppm aos funis numerados correspondentes. Não adicione nenhuma solução padrão aos funis em branco ou 0.

Adicione 1 mL da solução 8HQ e 3 mL de solução tampão para cada um dos 6 funis.

Realize uma extração líquido-líquido adicionando 10 mL de clorofórmio a cada frasco. Agite o funil vigorosamente, e ocasionalmente desabastem o funil para liberar o acúmulo de pressão. Coloque o funil de volta no anel e deixe que as camadas líquidas se separem.

Em seguida, colete a fase do clorofórmio em um béquer limpo, seco e rotulado de 100 mL. Como o clorofórmio tem uma densidade maior que a água, é a camada inferior no funil.

Transfira o extrato de clorofórmio em um frasco volumoso de 25 mL e tampe cada frasco para evitar a evaporação.

Realize uma segunda extração líquido-líquido na solução aquosa restante, adicionando 10 mL de clorofórmio a cada funil. Agite o funil, como antes, para transferir qualquer analito restante para a fase do clorofórmio. Não deve sobrar cor amarela na fase superior aquosa.

Repita a segunda extração para cada funil e colete as fases de clorofórmio em béquers rotulados correspondentes. Despeje o clorofórmio coletado em seus respectivos frascos volumoscos e dilua até a marca com clorofórmio fresco.

Para remover a água do traço, adicione cerca de 1 g de sulfato de sódio anidro a cada um dos seis béquers de 100 mL. Transfira as soluções de volta para seus respectivos béquers, e gire para facilitar a desidratação da amostra.

Decante o extrato de clorofórmio em uma célula fluorímetro de quartzo.

Configure o fluorímetro de acordo com as instruções do fabricante e coloque a tensão em 400 V. Em seguida, abra o programa de aquisição de dados no computador.

Use a amostra 2 para determinar os melhores comprimentos de onda de excitação e emissão. Defina o comprimento de onda de emissão para 500 nm e execute uma varredura de excitação de 335-435 nm, com uma velocidade de varredura de 2 nm/s.

A partir do enredo de fluorescência, determine o comprimento de onda máximo para excitação. Defina o instrumento para esse valor de comprimento de onda de excitação, neste caso 399 nm.

Em seguida, determine o comprimento de onda de emissão realizando uma varredura de 450-550 nm. A partir do gráfico de fluorescência resultante, determine o comprimento máximo de onda e defina o comprimento de onda de emissão, neste caso 520 nm.

Meça cada amostra, incluindo o em branco no comprimento de onda de excitação e emissão selecionado. Registo cada leitura de intensidade de fluorescência.

Subtrair a fluorescência medida da amostra em branco de cada uma das outras 5 amostras.

Plote a intensidade da fluorescência de cada uma das cinco amostras versus a quantidade de alumínio adicionada à amostra. Determine o valor mínimo quadrado do enredo resultante e registo da inclinação e intercepte.

O enredo da intensidade da fluorescência versus quantidade de alumínio adicionado rendeu uma linha menos quadrada, como mostrado. A quantidade de alumínio na amostra pode então ser calculada usando esta linha. Como a quantidade de adicionados desconhecidos foi de 25 mL, o valor determinado, 2.916 μg é dividido por 25 mL. Isso dá um resultado final de 0,117 μg/mL, ou 0,117 ppm. Isso é bem próximo do valor conhecido de 0,110 ppm.

Agora, vamos olhar para algumas outras técnicas analíticas que podem ter resultados distorcidos devido aos efeitos matriciais.

Espectroscopia de absorção atômica é um método analítico que mede a absorção da luz por um analito alvo na fase gasosa. Para a maioria das amostras, uma simples curva de calibração relacionando a absorção à concentração amostral, pode servir como um método confiável para quantificar uma concentração desconhecida.

No entanto, essa técnica pode perder a precisão se outros componentes da mistura interagirem com o analito de destino e suprimir ou melhorar a absorção. O método de adição padrão pode ser usado neste caso para explicar os efeitos dessas interações, especialmente em amostras onde a matriz não pode ser removida antes da análise.

A calibração do instrumento desempenha um papel crucial na precisão de uma medição. O método de adição padrão é frequentemente utilizado para auxiliar na calibração de instrumentos como o ICP-MS. ICP-MS é um método comparativo, o que significa que a medição de uma amostra desconhecida baseia-se na medição de um padrão químico.

Assim, a incerteza de uma medição de um desconhecido não pode ser melhor do que a incerteza da calibração. O método de adição padrão pode, portanto, ser usado para criar uma curva de calibração mais precisa do que o método padrão, e explica as interações matricial na amostra.

Muitas moléculas biológicas são analisadas usando cromatografia líquida de alto desempenho, ou HPLC. O HPLC é uma técnica que separa e analisa misturas complexas baseadas em propriedades de moléculas como polaridade, carga e tamanho. O momento em que o analito sai da coluna permite que o usuário identifique cada componente da mistura.

Moléculas biológicas podem frequentemente interagir em uma mistura, e são muito afetadas pela matriz em que estão suspensas. Muitas vezes, o método de adição padrão é usado para criar uma curva de calibração que explica esses efeitos.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE ao método de adição padrão. Agora você deve entender como executar a técnica para explicar os efeitos matriciais na análise da amostra.

Obrigado por assistir!

Results

Uma varredura do comprimento de onda de excitação de 335-435 mostrou a maior absorção em 399 nm, de modo que o monocromador de excitação foi definido para esse valor. Em seguida, a varredura de emissões foi realizada de 450 a 550 nm, e o sinal mais forte foi encontrado em 520 nm. Estes são os comprimentos de onda que são usados para todas as amostras.

Amostra	Intensidade da fluorescência	Intensidade de fluorescência corrigida
Em branco	0.008	0.000
Amostra	0.128	0.120
Amostra + 1 mL	0.167	0.159
Amostra + 2 mL	0.220	0.212
Amostra + 3 mL	0.260	0.252
Amostra + 4 mL	0.290	0.282

Um enredo de fluorescência (Figura 3) vs. μg de Al³⁺ adicionado(Figura 4) rendeu uma linha de menos quadrados de:

Intensidade de fluorescência = 0,0417 x (μg de Al³⁺ adicionado) + 0,1216

Quantidade de Al³⁺ = -(Y-Int)/Inclinação = -0,1216/0,0417 = -2.916 μg/mL

Como a quantidade de adicionados desconhecidos foi de 25 mL, então o valor de 2,916 μg/mL precisa ser dividido por 25.

Concentração de Alumínio Desconhecida = 2,916 μg/mL / 25,0 mL = 0,117 μg/mL = 0,117 ppm
que está bem próximo do valor real de 0,110 ppm (erro de 6,4%).

Figura 3. Fluorescência das amostras.

Figura 4. O gráfico de calibração de adição padrão.

Applications and Summary

O método de adições padrão é frequentemente a técnica utilizada quando são desejados resultados quantitativos precisos, utilizados em análises analíticas como absorção atômica, espectroscopia de fluorescência, ICP-OES e cromatografia gasosa. Isso é frequentemente usado quando há outros componentes na amostra de interesse que causam uma redução ou aprimoramento da absorvância desejada para resultados quantitativos. Quando este é o caso, não se pode simplesmente comparar o sinal analitos com os padrões usando a abordagem tradicional da curva de calibração. Na verdade, a avaliação do efeito matricial deve ser uma parte obrigatória do procedimento de validação.

Outro exemplo onde as adições padrão podem ser usadas é ao extrair prata de resíduos fotográficos antigos. Os resíduos contêm halidos de prata, e podem ser extraídos para que a prata possa ser recuperada. Ao espiar o desconhecido “desperdício” com quantidades conhecidas de prata, este método pode prever a quantidade de prata obtida do filme fotográfico.

Os trabalhadores que estão expostos às fábricas de benzeno são frequentemente testados para verificar se estão seguramente abaixo dos níveis aceitos de benzeno. A urina deles é testada para o produto químico, e essa é a matriz biológica. Além disso, a quantidade de supressão de analitos varia para pessoas diferentes, de modo que um único kit de calibração não funcionará. Com o método de adição padrão, cada funcionário pode ser testado e avaliado com precisão.

Transcript

The method of standard addition is a quantitative analysis technique used to minimize matrix effects that interfere with analyte measurement signals.

Unknown component concentrations are often elucidated through a range of analytical techniques, such as light spectroscopy, mass spectrometry, and electrochemistry. However, the measurement can be affected by other components in the sample, called the matrix, and cause the inadvertent reduction or enhancement of the signal, called matrix effects. These effects can skew results and cause significant errors in analysis.

The method of standard addition can be used to minimize matrix effects on measurement signals. This is performed by adding precise volumes of a known analyte solution to the sample.

This video will introduce the basics of the standards addition method, and demonstrate how to perform the technique in the laboratory using a fluorescence measurement.

Matrix effects can arise in complex samples where a number of other molecules interact with the analyte. For example, this can occur when molecules bind or agglomerate with the analyte, thereby changing its ability to fluoresce. Or the matrix may change the ionic strength of the overall solution, changing specific properties of the analyte.

To mitigate these effects using the method of standard addition, a range of volumes of an analyte standard solution is added to equal volumes of the sample. The solution volumes are then made equal using solvent.

Then, the signal is measured for the samples with and without the standard addition. The data are plotted as intensity versus the amount of the standard added to the sample, rather than a classic calibration curve. The actual concentration of the analyte in any given flask is defined by the following equation. The instrumental response will equal some constant times the concentration of analyte. The resulting equation takes the linear form y=mx+b. Thus, when the plot is extrapolated to zero absorbance, the intercept is equal to the unknown concentration of the sample.

The signal plot must be linear over the concentration range of concern. Also, the interference should not vary as the ratio of analyte to sample matrix changes. Finally, the matrix itself should not generate any measurement signals on its own.

The following experiment studies aluminum, a non-fluorescent species, by reacting it with 8-hydroxyquinoline, or 8HQ, to form the fluorescent ALQ3 complex.

The fluorescence of the aluminum complex in an organic solvent is measured, and then related to the concentration of the original aluminum solution. This approach is common in the analysis of metal ions.

Now that the basics of the method of standard addition have been outlined, and the basics of the experiment explained, let’s perform the technique in the laboratory.

First, prepare the 100-ppm aluminum stock solution in water, and then use it to prepare a 1-ppm standard solution.

Next, add 2 g of 8-hydroxyquinoline, or 8HQ, to a 100-mL volumetric flask.

Carefully add 5.74 mL glacial acetic acid, then dilute to the 100-mL mark with deionized water. This step enables the 8HQ to dissolve in the aqueous phase.

Next, prepare the buffer by adding 20 g of ammonium acetate and 7 mL of 30% ammonium hydroxide to a 100-mL marked bottle and dilute. Verify the pH with a pH indicator stick. This buffer helps neutralize the acid in the 8HQ solution when combined.

Other reagents needed include anhydrous sodium sulfate and spectrophotometric grade chloroform.

Now prepare the samples, in this case by extracting the aqueous sample into the organic phase using liquid-liquid extraction. Place six 125-mL separatory funnels onto ring-stand rings inside the hood. Make sure all glassware is scrupulously clean, as dirty glassware will skew results. Sequentially label the funnels “blank”, “0”, “1”, “2”, “3”, and “4”.

Using a pipette, add 25 mL of the unknown aluminum solution to each of the five separatory funnels labeled “0” through “4”. Prepare the blank by adding 25 mL of deionized water to the funnel labeled “blank”.

Next, add 1, 2, 3, and 4 mL of the 1-ppm standard solution to the corresponding numbered funnels. Add no standard solution to the blank or 0 funnels.

Add 1 mL of the 8HQ solution and 3 mL of buffer solution to each of the 6 funnels.

Perform a liquid-liquid extraction by adding 10 mL of chloroform to each flask. Shake the funnel vigorously, and occasionally vent the funnel to release pressure buildup. Place the funnel back into the ring, and allow the liquid layers to separate.

Next, collect the chloroform phase in a clean, dry, and labeled 100-mL beaker. Since chloroform has a higher density than water, it is the lower layer in the funnel.

Transfer the chloroform extract into a 25-mL volumetric flask, and cap each flask to prevent evaporation.

Perform a second liquid-liquid extraction on the remaining aqueous solution, by adding 10 mL of chloroform to each funnel. Shake the funnel, as before, to transfer any remaining analyte to the chloroform phase. There should be no yellow color left in the top aqueous phase.

Repeat the second extraction for each funnel, then collect the chloroform phases in corresponding labeled beakers. Pour the collected chloroform into their respective volumetric flasks, and dilute to the mark with fresh chloroform.

To remove trace water, add about 1 g of anhydrous sodium sulfate to each of the six 100-mL beakers. Transfer the solutions back into their respective beakers, and swirl to facilitate dehydration of the sample.

Decant the chloroform extract into a quartz fluorimeter cell.

Set up the fluorimeter according to the manufacturers instructions and set the voltage to 400 V. Next, open the data acquisition program on the computer.

Use sample 2 to determine the best excitation and emission wavelengths. Set the emission wavelength to 500 nm, and run an excitation scan from 335–435 nm, with a scan speed of 2 nm/s.

From the fluorescence plot, determine the maximum wavelength for excitation. Set the instrument to that excitation wavelength value, in this case 399 nm.

Next, determine the emission wavelength by performing a scan from 450–550 nm. From the resulting fluorescence plot, determine the maximum wavelength and set the emission wavelength, in this case 520 nm.

Measure each sample, including the blank at the selected excitation and emission wavelength. Record each fluorescence intensity reading.

Subtract the measured fluorescence of the blank sample from each of the other 5 samples.

Plot the fluorescence intensity of each of the five samples versus the amount of aluminum added to the sample. Determine the least squares value of the resulting plot, and record the slope and intercept.

The plot of fluorescence intensity vs. amount of aluminum added yielded a least-square line as shown. The amount of aluminum in the sample can then be calculated using this line. Since the amount of unknown added was 25 mL, the determined value, 2.916 μg is divided by 25 mL. This gives a final result of 0.117 μg/mL, or 0.117 ppm. This is quite close to the known value of 0.110 ppm.

Now, let’s look at some other analytical techniques that can have skewed results due to matrix effects.

Atomic absorption spectroscopy is an analytical method that measures the absorbance of light by a target analyte in the gaseous phase. For most samples, a simple calibration curve relating absorption to sample concentration, can serve as a reliable method to quantify an unknown concentration.

However, this technique can lose accuracy if other components of the mixture interact with the target analyte and suppress or enhance absorption. The standard addition method can be used in this case to account for the effects of these interactions, especially in samples where the matrix cannot be removed prior to analysis.

Instrument calibration plays a crucial role in the accuracy of a measurement. The method of standard addition is often used to aid in calibration of instruments such as ICP-MS. ICP-MS is a comparative method, meaning that the measurement of an unknown sample is based on the measurement of a chemical standard.

Thus, the uncertainty of a measurement of an unknown can’t be better than the uncertainty of the calibration. The method of standard addition can therefore be used to create a calibration curve that is more accurate than the standard method, and accounts for matrix interactions in the sample.

Many biological molecules are analyzed using high-performance liquid chromatography, or HPLC. HPLC is a technique that separates and analyzes complex mixtures based on molecule properties such as polarity, charge, and size. The time at which the analyte leaves the column enables the user to identify each component in the mixture.

Biological molecules can often interact in a mixture, and are greatly affected by the matrix they are suspended in. Often, the method of standard addition is used to create a calibration curve that accounts for these affects.

You’ve just watched JoVE’s introduction to the method of standard addition. You should now understand how to perform the technique to account for matrix effects in sample analysis.

Thanks for watching!