3.5: Espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis)

1. Calibrar o Espectrômetro

1. Ligue o espectrômetro UV-Vis e deixe as lâmpadas aquecerem por um período de tempo apropriado (cerca de 20 minutos) para estabilizá-las.
2. Encha uma cuvette com o solvente para a amostra e certifique-se de que o exterior está limpo. Isso servirá como um espaço em branco e ajudará a explicar as perdas leves devido à dispersão ou absorção pelo solvente.
3. Coloque a cuvette no espectrômetro. Certifique-se de alinhar o cuvette corretamente, pois muitas vezes o cuvette tem dois lados, que são destinados ao manuseio (pode ser ranhurado) e não são feitos para brilhar luz através.
4. Faça uma leitura para o branco. A absorvância deve ser mínima, mas qualquer absorvância deve ser subtraída de amostras futuras. Alguns instrumentos podem armazenar os dados em branco e realizar a subtração automaticamente.

2. Realize um espectro de absorção

1. Encha o cuvette com a amostra. Para ter certeza de que a transferência é quantitativa, enxágue a cuvette duas vezes com a amostra e, em seguida, preencha-a cerca de 3/4 cheia. Certifique-se de que o exterior está limpo de quaisquer impressões digitais, etc.
2. Coloque a cuvette no espectrômetro na direção correta.
3. Cubra a cuvette para evitar qualquer luz ambiente.
4. Colete um espectro de absorção permitindo que o instrumento escaneie através de diferentes comprimentos de onda e colete a absorvência. O intervalo de comprimento de onda pode ser definido com informações sobre a amostra específica, mas um intervalo de 200-800 nm é padrão. Um instrumento de matriz de diodo é capaz de coletar todo um espectro de absorção em uma única corrida.
5. Do espectro de absorvância coletado, determine o máximo de absorvância (λ_max). Repita a coleção de espectros para obter uma estimativa de erro no_{λ max}.
6. Para fazer uma curva de calibração, colete o espectro UV-Vis de uma variedade de diferentes amostras de concentração. Os espectrômetros são muitas vezes limitados em faixa linear e não serão capazes de medir um valor de absorção superior a 1,5. Se os valores de absorção da amostra estiverem fora da faixa linear do instrumento, dilui a amostra para obter os valores dentro da faixa linear.

3. Experimentos cinéticos com espectroscopia UV-Vis

1. UV-Vis pode ser usado para experimentos cinéticos examinando a mudança de absorvência ao longo do tempo. Para um experimento cinético, faça uma leitura inicial da amostra.
2. Adicione rapidamente o reagente para iniciar a reação química.
3. Mexa bem para misturar com a amostra. Se uma pequena quantidade for adicionada, isso pode ser feito em um cuvette. Alternativamente, misture o reagente com a amostra e despeje rapidamente um pouco em uma cuvette para uma medição.
4. Meça a absorvância no_máximo λ para o analito de interesse ao longo do tempo. Se usar o reagente sendo medido (ou seja, a absorvência está subindo porque há menos reagente para absorver), então a decomposição indicará a ordem da reação.
5. Usando uma curva de calibração, faça um gráfico de concentração de analito versus tempo, convertendo o valor de absorção em concentração. A partir daí, este gráfico pode ser adequado com equações apropriadas para determinar as constantes da taxa de reação.

A espectroscopia ultravioleta-visível, ou UV-Vis, é uma das técnicas analíticas mais populares no laboratório.

Na espectroscopia UV-Vis, a luz é passada através de uma amostra em um comprimento de onda específico no espectro UV ou visível. Se a amostra absorver parte da luz, nem toda a luz passará ou será transmitida. A transmissão é a razão entre a intensidade da luz transmitida e a luz incidente e está correlacionada com a absorbância. A absorbância pode ser usada de forma quantitativa, para obter a concentração de uma amostra. Também pode ser usado de maneira qualitativa, para identificar um composto, combinando a absorbância medida em uma faixa de comprimentos de onda, chamada espectro de absorbância, com os dados publicados. Este vídeo apresentará a espectroscopia UV-Vis e demonstrará seu uso em laboratório na determinação da concentração da amostra e da cinética da reação.

Quando um fóton atinge uma molécula e é absorvido, a molécula é promovida de seu estado fundamental para um estado de energia mais alto. A diferença de energia entre os dois é o intervalo de banda. A energia do fóton deve corresponder exatamente ao intervalo de banda para que o fóton seja absorvido. A estrutura química determina o intervalo de banda; portanto, cada molécula tem espectros de absorbância únicos.

A absorbância segue a Lei de Beer, que afirma que a absorbância é igual ao coeficiente de atenuação molar vezes o comprimento do caminho e a concentração. O coeficiente de atenuação molar está relacionado à capacidade do composto individual de absorver luz de um comprimento de onda específico. O comprimento do caminho refere-se à distância percorrida pela luz através da amostra, que normalmente é de 1 cm para cubetas padrão. A lei de Beer pode ser usada para calcular a concentração da amostra, se a absortividade for conhecida, ou uma curva de calibração pode ser usada.

UV-Vis é freqüentemente chamado de técnica geral, pois a maioria das moléculas absorve luz na faixa de comprimento de onda UV-visível. A faixa UV se estende de 100 a 400 nm e o espectro visível varia de 400 a 700 nm. No entanto, a maioria dos espectrofotômetros não opera na faixa de UV profundo de 100 a 200 nm, pois as fontes de luz nessa faixa são caras. A maioria dos espectrofotômetros UV-Vis usa uma lâmpada de deutério para a faixa UV, que produz luz de 170 a 375 nm, e uma lâmpada de filamento de tungstênio para a faixa visível, que produz luz de 350 a 2.500 nm.

Como a fonte de luz é geralmente uma lâmpada com amplas faixas de comprimento de onda, o comprimento de onda de absorbância específico é selecionado usando filtros ou um monocromador. Um monocromador é um dispositivo que separa os comprimentos de onda da luz espacialmente e, em seguida, coloca uma fenda de saída onde está o comprimento de onda desejado da luz. O monocromador pode ser escaneado em uma faixa de comprimento de onda para fornecer todo um espectro de absorbância. Isso torna a técnica útil para quantificar e identificar uma ampla gama de moléculas.

Agora que os fundamentos da espectroscopia UV-Vis foram delineados, vamos dar uma olhada em um experimento UV-Vis simples no laboratório.

Antes de iniciar a medição, ligue o espectrofotômetro e deixe as lâmpadas aquecerem por um período de tempo apropriado para estabilizá-las.

Prepare um espaço em branco enchendo uma cubeta limpa com o solvente de amostra e, em seguida, limpe a parte externa com papel sem fiapos para remover quaisquer impressões digitais.

Certifique-se de que a cubeta esteja alinhada corretamente com quaisquer lados ranhurados fora do caminho do feixe e insira-a no espectrofotômetro. Feche a tampa para evitar que a luz ambiente entre no sistema.

Meça a absorbância do branco em um comprimento de onda ou em uma faixa de comprimento de onda. Registar ou guardar a absorvância, uma vez que esta deve ser subtraída da absorvância da amostra.

Em seguida, descarte o branco e enxágue a cubeta duas vezes com amostra. Em seguida, encha a cubeta sobre ? cheio com amostra. Limpe a parte externa da cubeta novamente, para garantir que esteja limpa e livre de impressões digitais.

Coloque a cubeta no espectrofotômetro na orientação correta e prenda a tampa.

Colete uma medição de absorbância ou espectro no mesmo comprimento de onda ou faixa de comprimento de onda do branco. Subtraia o espectro ou a medição em branco, se o instrumento não o fizer automaticamente.

A partir do espectro de absorbância coletado, determine o máximo de absorbância ou ?max.

}Para quantificar a quantidade de analito na amostra, crie uma curva de calibração usando uma faixa de concentrações de analito conhecidas. Para obter mais informações sobre como construir e usar uma curva de calibração, assista ao vídeo desta coleção "Curvas de calibração".

A medição de absorbância também pode ser usada para calcular a cinética da reação, medindo o aumento ou diminuição da concentração de um composto ao longo da reação. Comece por fazer uma leitura inicial da amostra, neste caso corante azul, no máximo de absorbância antes da reacção.

Em seguida, adicione rapidamente o reagente, neste caso, alvejante, para iniciar a reação química. Mexa bem, para que se misture com a amostra.

Medir a absorvância no máximo de absorvância ao longo do tempo.

O espectro de absorbância inicial da amostra de corante azul é mostrado. As cores de fundo mostram as cores da luz no espectro visível. O corante azul tem uma absorbância máxima de cerca de 630 nm.

A cinética da reação entre o corante azul e o alvejante foi medida ao longo do tempo. A absorbância do corante azul diminui com o tempo, à medida que reage com o alvejante. A absorbância atinge quase zero após 300 s, indicando que a reação está quase concluída. Para obter mais informações sobre cinética e reações, assista ao vídeo da JoVE Science Education "Reaction Rate Laws".

A espectroscopia UV-Vis é muito usada em muitas áreas de pesquisa diferentes para identificar ou quantificar uma amostra.

Por exemplo, a espectroscopia UV-Vis é muito usada em campos biológicos para quantificar a quantidade de proteína em uma amostra. Um ensaio de Bradford é frequentemente usado para quantificar proteínas, com o auxílio de um corante. Primeiro, uma curva de calibração de concentrações de proteínas conhecidas é preparada, normalmente usando albumina de soro bovino, ou BSA. Em seguida, a coloração azul de Coomassie é adicionada a cada um dos padrões e à amostra. A absorbância do complexo proteína-corante é então medida a 595 nm.

Alternativamente, as proteínas podem ser medidas diretamente por sua absorbância a 280 nm. Neste exemplo, a concentração de proteína é quantificada usando um espectrofotômetro de volume ultrabaixo. Para muitas proteínas, uma absorbância de 1 se correlaciona com uma concentração de 1 mg/mL.

A espectroscopia UV-Vis também é usada para quantificar a quantidade de células bacterianas em uma cultura de células. Para esta medição, a absorbância, ou densidade óptica, é medida a 600 nm. Normalmente, uma medição OD600 de 1 indica a presença de 8 x 108 células bacterianas por mL. A medição da densidade celular ao longo do crescimento da cultura permite a determinação da curva de crescimento bacteriano e pode ajudar a identificar quando uma cultura está em sua fase de crescimento exponencial.

O óxido de nitrogênio e o dióxido de nitrogênio, ou NOx, são um subproduto do escapamento de automóveis e podem ser prejudiciais ao meio ambiente porque formam ozônio troposférico prejudicial. O NOx pode ser medido reagindo-o com uma solução de ácido sulfanílico e naftila-etilenodiamina. A solução resultante é uma molécula de corante azo de cor rosa, cuja intensidade está diretamente correlacionada à concentração de NOx. Esta concentração pode então ser determinada usando um espectrofotômetro UV-Vis.

Você acabou de assistir à introdução da JoVE à espectroscopia UV-visível. Agora você deve entender os fundamentos da operação UV-Vis, como medir uma amostra usando um UV-Vis e como correlacionar a absorbância com a concentração da amostra.

Obrigado por assistir!