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Espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis)

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Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy

3.2: Internal Standards

3.7: X-ray Fluorescence (XRF)

615,564 Views

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09:21 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratório da Dra.B. Jill Venton – Universidade da Virgínia

A espectroscopia ultravioleta visível (UV-Vis) é uma das técnicas analíticas mais populares porque é muito versátil e capaz de detectar quase todas as moléculas. Com espectroscopia UV-Vis, a luz UV-Vis é transmitida através de uma amostra e a transmissão da luz por uma amostra é medida. A partir da transmissão (T), a absorvância pode ser calculada como A=-log (T). Um espectro de absorvência é obtido que mostra a absorvência de um composto em diferentes comprimentos de onda. A quantidade de absorvância em qualquer comprimento de onda é devido à estrutura química da molécula.

UV-Vis pode ser usado de forma qualitativa, para identificar grupos funcionais ou confirmar a identidade de um composto, combinando com o espectro de absorvância. Também pode ser usado de forma quantitativa, pois a concentração do analito está relacionada à absorvância utilizando a Lei da Cerveja. A espectroscopia UV-Vis é usada para quantificar a quantidade de DNA ou proteína em uma amostra, para análise de água, e como detector para muitos tipos de cromatografia. Cinéticas de reações químicas também são medidas com espectroscopia UV-Vis, tomando repetidas medições UV-Vis ao longo do tempo. As medições UV-Vis são geralmente tomadas com um espectotômetro. UV-Vis também é um detector muito popular para outras técnicas analíticas, como a cromatografia, porque pode detectar muitos compostos.

Normalmente, UV-Vis não é a técnica de espectroscopia mais sensível, porque pouca luz é absorvida por um curto comprimento de caminho. Outras técnicas de espectroscopia, como a fluorescência, têm maior sensibilidade, mas não são tão geralmente aplicáveis, já que a maioria das moléculas não são fluorescentes. UV-Vis tem sensibilidade semelhante a outras medidas de absorção, como espectroscopia infravermelha.

Principles

UV-Vis é frequentemente chamado de técnica geral porque a maioria das moléculas absorverá na faixa de comprimento de onda UV-Vis. O UV se estende de 100 a 400 nm e o espectro visível de 400-700 nm. A faixa de 100-200 nm é chamada de UV profundo. Fontes de luz são mais difíceis de encontrar para esta faixa, por isso não é usado rotineiramente para medições UV-Vis. Espectrômetros típicos de UV-Vis usam uma lâmpada deutério para o UV que produz luz de 170-375 nm e uma lâmpada de filamento de tungstênio para visível, que produz luz de 350-2.500 nm.

Quando um fóton atinge uma molécula e é absorvido, a molécula é promovida em um estado energético mais animado. A luz visível UV tem energia suficiente para promover elétrons para um estado eletrônico mais alto, desde o orbital molecular mais ocupado (HOMO) até o menor orbital molecular desocupado (LUMO). A diferença de energia entre o HOMO e o LUMO é chamada de lacuna de banda. Normalmente, esses orbitais são chamados de ligação e anti-ligação. A energia do fóton deve corresponder exatamente à lacuna de banda para que o fóton seja absorvido. Assim, moléculas com diferentes estruturas químicas têm diferentes lacunas de banda de energia e diferentes espectros de absorção. As transições mais comuns que caem na faixa UV-Vis são π-π* e n-π*. Os orbitais pi surgem devido a ligações duplas, e n orbitais são para elétrons não-ligados. A estrela Pi são orbitais pi anti-ligação. Assim, a melhor absorção UV-Vis é por moléculas que contêm ligações duplas. Orbitais pi adjacentes uns aos outros que estão conectados, chamados de conjugação, normalmente aumenta a absorção. As transições Sigma-σ*, associadas a ligações únicas, são de maior energia e caem no UV profundo, por isso são menos úteis para o uso rotineiro. O aparecimento de faixas largas ou ombros na estrutura UV-Vis é devido aos numerosos estados vibracionais e rotacionais de uma molécula, que levam a lacunas separadas de bandas de energia de energias ligeiramente diferentes.

Para moléculas com absorção na região visível, os compostos muitas vezes aparecem coloridos. No entanto, um equívoco comum é que o comprimento de onda da absorção de pico (λ_max) para um composto é a cor que aparece. Um composto que aparece vermelho não tem muita absorção na região vermelha do espectro. Em vez disso, o_{λ max} para um composto que parece vermelho é verde. A cor de um composto surge porque esses comprimentos de onda de luz são transmitidos seletivamente através da amostra, e assim eles não são absorvidos. Uma roda de cor é útil para determinar qual cor um composto absorverá e qual será o alcance do λ_max,já que a cor diretamente através da roda da cor observada é a cor mais absorvida.

A absorção segue a Lei da Cerveja, A=εbC onde ε é o coeficiente de atenuação molar, b é comprimento do caminho, e C é concentração. O coeficiente de atenuação molar é a característica de um composto individual para absorver em um determinado comprimento de onda e esta propriedade é devido a grupos funcionais, conjugação, etc. Se um composto não tiver um alto coeficiente de atenuação,ele pode ser marcado com um grupo apropriado para aumentar sua absorção. O comprimento do caminho está geralmente relacionado com o tamanho do cuvette e é de 1 cm em espectrofotômetros padrão.

O UV-Vis é realizado em uma variedade de instrumentos, desde espectrofotômetros tradicionais até leitores de placas mais modernos. O comprimento de onda de absorção deve ser escolhido, seja usando um filtro ou um monocromador. Um monocromador é um dispositivo que separa os comprimentos de onda da luz espacialmente e, em seguida, coloca uma fenda de saída onde está o comprimento de onda desejado da luz. Monocromadores podem ser escaneados para fornecer todo um espectro de absorção. Alternativamente, um instrumento de matriz de diodo permite que todas as cores de luz sejam transmitidas através da amostra, em seguida, a luz é separada em diferentes comprimentos de onda espacialmente e detectada usando fotodiodos. Os instrumentos de matriz de diodo coletam espectros completos mais rápido, mas são mais complicados e mais caros.

Procedure

1. Calibrar o Espectrômetro

Ligue o espectrômetro UV-Vis e deixe as lâmpadas aquecerem por um período de tempo apropriado (cerca de 20 minutos) para estabilizá-las.
Encha uma cuvette com o solvente para a amostra e certifique-se de que o exterior está limpo. Isso servirá como um espaço em branco e ajudará a explicar as perdas leves devido à dispersão ou absorção pelo solvente.
Coloque a cuvette no espectrômetro. Certifique-se de alinhar o cuvette corretamente, pois muitas vezes o cuvette tem dois lados, que são destinados ao manuseio (pode ser ranhurado) e não são feitos para brilhar luz através.
Faça uma leitura para o branco. A absorvância deve ser mínima, mas qualquer absorvância deve ser subtraída de amostras futuras. Alguns instrumentos podem armazenar os dados em branco e realizar a subtração automaticamente.

2. Realize um espectro de absorção

Encha o cuvette com a amostra. Para ter certeza de que a transferência é quantitativa, enxágue a cuvette duas vezes com a amostra e, em seguida, preencha-a cerca de 3/4 cheia. Certifique-se de que o exterior está limpo de quaisquer impressões digitais, etc.
Coloque a cuvette no espectrômetro na direção correta.
Cubra a cuvette para evitar qualquer luz ambiente.
Colete um espectro de absorção permitindo que o instrumento escaneie através de diferentes comprimentos de onda e colete a absorvência. O intervalo de comprimento de onda pode ser definido com informações sobre a amostra específica, mas um intervalo de 200-800 nm é padrão. Um instrumento de matriz de diodo é capaz de coletar todo um espectro de absorção em uma única corrida.
Do espectro de absorvância coletado, determine o máximo de absorvância (λ_max). Repita a coleção de espectros para obter uma estimativa de erro no_{λ max}.
Para fazer uma curva de calibração, colete o espectro UV-Vis de uma variedade de diferentes amostras de concentração. Os espectrômetros são muitas vezes limitados em faixa linear e não serão capazes de medir um valor de absorção superior a 1,5. Se os valores de absorção da amostra estiverem fora da faixa linear do instrumento, dilui a amostra para obter os valores dentro da faixa linear.

3. Experimentos cinéticos com espectroscopia UV-Vis

UV-Vis pode ser usado para experimentos cinéticos examinando a mudança de absorvência ao longo do tempo. Para um experimento cinético, faça uma leitura inicial da amostra.
Adicione rapidamente o reagente para iniciar a reação química.
Mexa bem para misturar com a amostra. Se uma pequena quantidade for adicionada, isso pode ser feito em um cuvette. Alternativamente, misture o reagente com a amostra e despeje rapidamente um pouco em uma cuvette para uma medição.
Meça a absorvância no_máximo λ para o analito de interesse ao longo do tempo. Se usar o reagente sendo medido (ou seja, a absorvência está subindo porque há menos reagente para absorver), então a decomposição indicará a ordem da reação.
Usando uma curva de calibração, faça um gráfico de concentração de analito versus tempo, convertendo o valor de absorção em concentração. A partir daí, este gráfico pode ser adequado com equações apropriadas para determinar as constantes da taxa de reação.

A espectroscopia ultravioleta, ou UV-Vis, é uma das técnicas analíticas mais populares em laboratório.

Na espectroscopia UV-Vis, a luz é transmitida através de uma amostra em um comprimento de onda específico no espectro UV ou visível. Se a amostra absorver parte da luz, nem toda a luz será transmitida, ou será transmitida. A transmissão é a razão da intensidade da luz transmitida à luz incidente, e está correlacionada com a absorção. A absorvância pode ser usada de forma quantitativa, para obter a concentração de uma amostra. Também pode ser usado de forma qualitativa, para identificar um composto, combinando a absorvância medida sobre uma gama de comprimentos de onda, chamado de espectro de absorvância, aos dados publicados. Este vídeo introduzirá espectroscopia UV-Vis, e demonstrará seu uso em laboratório na determinação da concentração da amostra e da cinética de reação.

Quando um fóton atinge uma molécula e é absorvido, a molécula é promovida de seu estado terrestre em um estado de maior energia. A diferença de energia entre os dois é a lacuna de banda. A energia do fóton deve corresponder exatamente à lacuna da banda para que o fóton seja absorvido. A estrutura química determina a lacuna da banda; portanto, moléculas cada uma tem espectros de absorção únicos.

A absorvância segue a Lei de Beer, que afirma que a absorvância é igual ao coeficiente de atenuação molar, vezes o comprimento e concentração do caminho. O coeficiente de atenuação molar está relacionado com a capacidade do composto individual de absorver a luz de um comprimento de onda específico. O comprimento do caminho refere-se à distância percorrida pela luz através da amostra, que normalmente é de 1 cm para cuvetas padrão. A lei da cerveja pode ser usada para calcular a concentração amostral, se a absortividade for conhecida, ou se uma curva de calibração pode ser usada.

UV-Vis é frequentemente chamado de técnica geral, pois a maioria das moléculas absorvem luz na faixa de comprimento de onda visível UV. A faixa UV se estende de 100 a 400 nm, e o espectro visível varia de 400 a 700 nm. No entanto, a maioria dos espectrofotômetros não operam na faixa UV profunda de 100-200 nm, já que as fontes de luz nesta faixa são caras. A maioria dos espectrofotômetros UV-Vis usam uma lâmpada deutério para a gama UV, que produz luz de 170 a 375 nm, e uma lâmpada de filamento de tungstênio para a gama visível, que produz luz de 350 a 2.500 nm.

Uma vez que a fonte de luz é geralmente uma lâmpada com amplas faixas de comprimento de onda, o comprimento de onda de absorção específico é selecionado usando filtros ou um monocromador. Um monocromador é um dispositivo que separa os comprimentos de onda da luz espacialmente, e então coloca uma fenda de saída onde está o comprimento de onda desejado da luz. O monocromador pode ser escaneado sobre uma faixa de comprimento de onda para fornecer todo um espectro de absorção. Isso torna a técnica útil para quantificar e identificar uma ampla gama de moléculas.

Agora que o básico da espectroscopia UV-Vis foi delineado, vamos dar uma olhada em um simples experimento UV-Vis em laboratório.

Antes de iniciar a medição, ligue o espectrômetro e deixe as lâmpadas aquecerem por um período de tempo apropriado para estabilizá-las.

Prepare um branco preenchendo uma cuvette limpa com o solvente de amostra e, em seguida, limpe o exterior com papel sem fiapos para remover quaisquer impressões digitais.

Certifique-se de que o cuvette esteja alinhado corretamente com quaisquer lados ranhurados fora do caminho do feixe e insira-o no espectrômetro. Fixar a tampa para evitar que a luz ambiente entre no sistema.

Meça a absorvência do vazio em um comprimento de onda, ou sobre uma faixa de comprimento de onda. Registre ou salve a absorvância, pois deve ser subtraída da absorvância da amostra.

Em seguida, descarte o branco e enxágue a cuvette duas vezes com a amostra. Em seguida, encha a cuvette cerca de 3/4 cheia com amostra. Limpe novamente o lado de fora da cuvette, para garantir que ele esteja limpo e livre de impressões digitais.

Coloque a cuvette no espectrômetro na orientação correta e fixe a tampa.

Colete uma medição de absorção ou espectro no mesmo comprimento de onda ou comprimento de onda que o em branco. Subtraia o espectro ou a medição em branco, se o instrumento não o fizer automaticamente.

Do espectro de absorvância coletado, determine o máximo de absorvância, ou λ_max.

Para quantificar a quantidade de analito na amostra, crie uma curva de calibração usando uma gama de concentrações conhecidas de analito. Para obter mais informações sobre como construir e usar uma curva de calibração, assista ao vídeo desta coleção “Curvas de Calibração”.

A medição de absorvência também pode ser usada para calcular cinética de reação medindo o aumento ou diminuição de uma concentração de compostos ao longo da reação. Comece fazendo uma leitura inicial da amostra, corante azul neste caso, no máximo de absorvância antes da reação.

Em seguida, adicione rapidamente o reagente, alvejante neste caso, para iniciar a reação química. Mexa bem, para que se misture com a amostra.

Meça a absorvência no máximo de absorvância ao longo do tempo.

O espectro inicial de absorção da amostra de corante azul é mostrado. As cores de fundo mostram as cores de luz no espectro visível. O corante azul tem um máximo de absorção de cerca de 630 nm.

A cinética da reação entre corante azul e alvejante foi medida ao longo do tempo. A absorção do corante azul diminui com o tempo, pois reage com o alvejante. A absorvência chega perto de zero após os anos 300, indicando que a reação se aproximava da conclusão. Para obter mais informações sobre cinéticas e reações, assista ao vídeo “Reaction Rate Laws” da JoVE Science Education.

A espectroscopia UV-Vis é usada fortemente em muitas áreas de pesquisa diferentes para identificar ou quantificar uma amostra.

Por exemplo, a espectroscopia UV-Vis é usada fortemente em campos biológicos para quantificar a quantidade de proteína em uma amostra. Um ensaio de Bradford é frequentemente usado para quantificar proteínas, com o auxílio de um corante. Primeiro, uma curva de calibração de concentrações de proteínas conhecidas é preparada, tipicamente usando Bovine Serum Albumin, ou BSA. Em seguida, a mancha azul coomassie é adicionada a cada um dos padrões e à amostra. A absorção do complexo de corantes proteicos é então medida a 595 nm.

Alternativamente, as proteínas podem ser medidas diretamente por sua absorvância a 280 nm. Neste exemplo, a concentração de proteínas é quantificada usando um espectotômetro de volume ultra baixo. Para muitas proteínas, uma absorvência de 1 se correlaciona com uma concentração de 1 mg/mL.

A espectroscopia UV-Vis também é usada para quantificar a quantidade de células bacterianas em uma cultura celular. Para esta medição, a absorvância, ou densidade óptica, é medida a 600 nm. Normalmente, uma medição de₆₀₀ OD de 1 indica a presença de 8 x 10⁸ células bacterianas por mL. Medir a densidade celular ao longo do crescimento cultural permite a determinação da curva de crescimento bacteriano, e pode ajudar a identificar quando uma cultura está em sua fase de crescimento exponencial.

Óxido de nitrogênio e dióxido de nitrogênio, ou NO_x,é um subproduto do escapamento do automóvel, e pode ser prejudicial ao meio ambiente porque forma ozônio troposférico prejudicial. NO_x pode ser medido reagindo-o com uma solução de ácido sulfanílico e napthyl-etilenodiamina. A solução resultante é uma molécula de corante azo cor-de-rosa, a intensidade da qual está diretamente correlacionada com a concentração NO_x. Esta concentração pode então ser determinada usando um espectotômetro UV-Vis.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à espectroscopia visível UV. Agora você deve entender o básico da operação UV-Vis, como medir uma amostra usando um UV-Vis e como correlacionar a absorvência à concentração amostral.

Obrigado por assistir!

Results

UV-Vis pode ser usado para obter um espectro de compostos coloridos. Na Figura 1A,o espectro de absorvância de um corante azul é mostrado. O fundo mostra as cores de luz no espectro visível. O corante azul tem uma absorvância_máxima λ no laranja/vermelho. A Figura 1B mostra um espectro de um corante vermelho, com λ_max no verde.

Cinética pode ser medida a partir de um gráfico de absorvância em um comprimento de onda ao longo do tempo. A Figura 2 mostra um gráfico da absorção de um corante azul (a 630 nm) enquanto reage com alvejante.

Figura 1. Espectros de absorção UV-Vis. A. Corante azul #1 tem máxima absorção no laranja/vermelho. B. Corante vermelho #40 tem máxima absorvância no verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. UV-Vis para cinética. A absorção de corante azul #1 como ele reage com alvejante. A curva pode ser encaixada com uma decadência exponencial, indicando cinética de primeira ordem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Applications and Summary

UV-Vis é usado em muitas análises químicas. É usado para quantificar a quantidade de proteína em uma solução, pois a maioria das proteínas absorve fortemente a 280 nm. A Figura 3 mostra um exemplo de espectro de citocromo C, que tem uma alta absorvância em 280 e também em 450 por causa de um grupo de heme. UV-Vis também é usado como uma técnica padrão para quantificar a quantidade de DNA em uma amostra, já que todas as bases absorvem fortemente a 260 nm. RNA e proteínas também absorvem a 260 nm, de modo que a absorção em outros comprimentos de onda pode ser medida para verificar se há interferências. Especificamente, as proteínas absorvem fortemente a 280 nm, de modo que a razão de absorvância em 280/260 pode dar uma medida da razão de proteína para DNA em uma amostra.

A maioria das análises simples mede a absorvência de um comprimento de onda de cada vez. No entanto, mais informações químicas estão presentes se as medições forem feitas em muitos comprimentos de onda simultaneamente. Instrumentos de matriz de diodo capturam toda a luz que é transmitida, dividem a luz em cores diferentes usando um prisma ou grade holográfica e, em seguida, a absorção em diferentes comprimentos de onda é capturada em uma matriz linear de fotodiodos. A vantagem deste método é que ele é útil para medir muitas moléculas diferentes simultaneamente.

Figura 3. Espectro UV-Vis de uma proteína. O pico de 280 nm é indicativo de uma proteína. O pico em 450 é devido à absorção do grupo heme no citocromo C.

Transcript

Ultraviolet-visible, or UV-Vis, spectroscopy is one of the most popular analytical techniques in the laboratory.

In UV-Vis spectroscopy, light is passed through a sample at a specific wavelength in the UV or visible spectrum. If the sample absorbs some of the light, not all of the light will be pass through, or be transmitted. Transmission is the ratio of the intensity of the transmitted light to the incident light, and is correlated to absorbance. The absorbance can be used in a quantitative manner, to obtain the concentration of a sample. It can also be used in a qualitative manner, to identify a compound by matching the measured absorbance over a range of wavelengths, called the absorbance spectrum, to the published data. This video will introduce UV-Vis spectroscopy, and demonstrate its use in the laboratory in determining sample concentration and reaction kinetics.

When a photon hits a molecule and is absorbed, the molecule is promoted from its ground state into a higher energy state. The energy difference between the two is the band gap. The energy of the photon must exactly match the band gap in order for the photon to be absorbed. The chemical structure determines the band gap; therefore molecules each have unique absorbance spectra.

Absorbance follows Beer’s Law, which states absorbance equals the molar attenuation coefficient times the path length and concentration. The molar attenuation coefficient is related to the individual compound’s ability to absorb light of a specific wavelength. Path length refers to the distance traveled by light through the sample, which is typically 1 cm for standard cuvettes. Beer’s law can be used to calculate sample concentration, if the absorptivity is known, or a calibration curve can be used.

UV-Vis is often called a general technique, as most molecules absorb light in the UV-visible wavelength range. The UV range extends from 100–400 nm, and the visible spectrum ranges from 400–700 nm. However, most spectrophotometers do not operate in the deep UV range of 100–200 nm, as light sources in this range are expensive. Most UV-Vis spectrophotometers use a deuterium lamp for the UV range, which produces light from 170–375 nm, and a tungsten filament lamp for the visible range, which produces light from 350–2,500 nm.

Since the light source is usually a lamp with broad wavelength ranges, the specific absorbance wavelength is selected using filters or a monochromator. A monochromator is a device that separates the wavelengths of light spatially, and then places an exit slit where the desired wavelength of light is. The monochromator can be scanned over a wavelength range to provide an entire absorbance spectrum. This makes the technique useful for quantifying and identifying a wide range of molecules.

Now that the basics of UV-Vis spectroscopy have been outlined, lets take a look at a simple UV-Vis experiment in the laboratory.

Before beginning the measurement, turn on the spectrophotometer, and allow the lamps to warm up for an appropriate period of time to stabilize them.

Prepare a blank by filling a clean cuvette with the sample solvent, and then wipe the outside with lint-free paper to remove any fingerprints.

Ensure that the cuvette is aligned properly with any grooved sides out of the beam-path, and insert it into the spectrophotometer. Secure the lid to prevent ambient light from entering the system.

Measure the absorbance of the blank at one wavelength, or over a wavelength range. Record or save the absorbance, as it must be subtracted from the absorbance of the sample.

Next, discard the blank and rinse the cuvette twice with sample. Then, fill the cuvette about ¾ full with sample. Wipe the outside of the cuvette again, to ensure that it is clean and free of fingerprints.

Place the cuvette in the spectrophotometer in the correct orientation, and secure the lid.

Collect an absorbance measurement or spectrum at the same wavelength or wavelength range as the blank. Subtract the blank spectrum or measurement, if the instrument does not automatically do so.

From the collected absorbance spectrum, determine the absorbance maximum, or λmax.

To quantify the amount of analyte in the sample, create a calibration curve using a range of known analyte concentrations. For more information on how to construct and use a calibration curve, please watch this collection’s video “Calibration Curves”.

The absorbance measurement can also be used to calculate reaction kinetics by measuring the increase or decrease in a compounds concentration throughout the reaction. Begin by taking an initial reading of the sample, blue dye in this case, at the absorbance maximum before the reaction.

Next, quickly add the reagent, bleach in this case, to start the chemical reaction. Stir it well, so that it mixes with the sample.

Measure the absorbance at the absorbance maximum over time.

The initial absorbance spectrum of the blue dye sample is shown. The background colors show the colors of light in the visible spectrum. The blue dye has an absorbance maximum at about 630 nm.

The kinetics of the reaction between blue dye and bleach was measured over time. The absorbance of blue dye decreases over time, as it reacts with the bleach. The absorbance reaches near zero after 300 s, indicating that the reaction has neared completion. For more information on kinetics and reactions, please watch the JoVE Science Education video “Reaction Rate Laws”.

UV-Vis spectroscopy is used heavily in many different research areas to identify or quantify a sample.

For example, UV-Vis spectroscopy is used heavily in biological fields to quantify the amount of protein in a sample. A Bradford assay is often used to quantify proteins, with the aid of a dye. First, a calibration curve of known protein concentrations is prepared, typically using Bovine Serum Albumin, or BSA. Then Coomassie blue stain is added to each of the standards and to the sample. The absorbance of the protein-dye complex is then measured at 595 nm.

Alternatively, proteins can be measured directly by their absorbance at 280 nm. In this example, protein concentration is quantified using an ultra low volume spectrophotometer. For many proteins, an absorbance of 1 correlates to a concentration of 1 mg/mL.

UV-Vis spectroscopy is also used to quantify the amount of bacterial cells in a cell culture. For this measurement, the absorbance, or optical density, is measured at 600 nm. Typically, an OD600 measurement of 1 indicates the presence of 8 x 108 bacterial cells per mL. Measuring the cell density throughout culture growth enables the determination of the bacterial growth curve, and can help to identify when a culture is in its exponential growth phase.

Nitrogen oxide and nitrogen dioxide, or NOx, is a by-product of automobile exhaust, and can be harmful to the environment because it forms damaging tropospheric ozone. NOx can be measured by reacting it with a solution of sulfanilic acid and napthyl-ethylenediamine. The resulting solution is a pink colored azo dye molecule, the intensity of which is directly correlated to NOx concentration. This concentration can then be determined using a UV-Vis spectrophotometer.

You’ve just watched JoVE’s introduction to UV-visible spectroscopy. You should now understand the basics of UV-Vis operation, how to measure a sample using a UV-Vis and how to correlate absorbance to sample concentration.

Thanks for watching!