Cromatografia em coluna

A cromatografia em coluna é um método de purificação versátil usado para separar compostos em uma solução. Uma mistura de solução é transportada por um solvente através de uma coluna contendo um sólido adsorvente, chamado de fase estacionária. A mistura combinada de solvente e amostra é chamada de fase móvel.

As moléculas na fase móvel viajam pela coluna em taxas diferentes com base em suas propriedades químicas - e sua afinidade com a fase estacionária. Assim, cada composto sai da coluna em um momento diferente. Uma vez que os compostos tenham sido separados e purificados, eles podem ser processados posteriormente ou estão prontos para distribuição. Este vídeo apresentará os fundamentos da cromatografia em coluna e, em seguida, demonstrará a técnica com a purificação de compostos orgânicos.

Na cromatografia em coluna, as moléculas adsorvem reversivelmente à fase estacionária à medida que fluem pela coluna, retardando assim seu progresso. Compostos que interagem fracamente com a fase estacionária são mais rápidos para sair da coluna ou eluir. Compostos que interagem fortemente com a fase estacionária são mais lentos para eluir. A fase estacionária é um pó ou gel adsorvente, como sílica gel ou alumina. O gel de sílica e a alumina são altamente polares - portanto, interagem fortemente com compostos polares e solventes e fracamente com moléculas apolares. A fase estacionária é carregada na coluna como uma pasta com o solvente e é então embalada pelo fluxo de solvente através da fase estacionária. Quando devidamente embalada, a fase estacionária é homogênea de cima para baixo e não contém bolhas de ar ou manchas secas, pois o fluxo desigual causado por essas irregularidades interfere na separação dos compostos. O solvente, ou eluente, é tipicamente um solvente orgânico fornecido por um reservatório. Em geral, os solventes apolares eluem apenas compostos apolares, enquanto os solventes polares eluem compostos polares e apolares. Se uma mistura contiver compostos de polaridades significativamente diferentes, uma série de solventes cada vez mais polares pode ser usada para eluir todos os compostos de interesse. A vazão da fase móvel é geralmente controlada por uma torneira na parte inferior da coluna. As pausas no fluxo são reduzidas ao mínimo para evitar a difusão dos compostos. A fase móvel que sai da coluna, chamada de eluato, é coletada em frações para preservar a separação dos compostos. Agora que você entende os princípios da cromatografia em coluna, vamos passar por um procedimento para a purificação de uma mistura de compostos orgânicos.

Para iniciar o procedimento, obtenha o equipamento conforme indicado no texto. Pesar um balão de fundo redondo para cada composto a isolar e registar a massa. Em seguida, pese a amostra e dissolva-a no volume mínimo de solvente necessário. O solvente adequado deve ser predeterminado por cromatografia em camada delgada. O valor de Rf deve estar entre 0,2?0,3. Em seguida, determine a quantidade de sílica gel necessária para a fase estacionária com base no peso seco da amostra e a diferença na distância de migração dos compostos de interesse com base na pré-triagem de TLC. Deitar a quantidade adequada de sílica-gel num Erlenmeyer. Adicionar o solvente à sílica-gel até que o chorume fique translúcido e se mova livremente quando o balão for agitado. Em seguida, selecione uma coluna grande o suficiente para que o gel de sílica a preencha até a metade. Se a coluna não tiver frita de vidro, coloque lã de vidro na coluna e pressione-a firmemente contra o fundo com uma haste longa. Cubra a lã de vidro com cerca de 2 cm de areia para evitar que a sílica passe pela lã de vidro. Em uma capela de exaustão, prenda a coluna a um suporte de anel, deixando espaço suficiente abaixo para acomodar os tubos de ensaio.

Coloque um funil na coluna e certifique-se de que a torneira esteja fechada. Despeje a pasta na coluna, batendo suavemente nas laterais enquanto a pasta assenta para excluir bolhas de ar. Enxágue o funil, o frasco e as paredes da coluna com solvente para transferir todo o gel para a coluna.

Colocar um Erlenmeyer sob a coluna. Abrir a torneira e deixar o solvente escorrer para o balão até que o nível do solvente esteja ligeiramente acima do gel de sílica e, em seguida, fechar a torneira. Despeje cerca de 2 cm de areia sobre o gel. Enxágue suavemente qualquer areia presa nas laterais da coluna com solvente. Drene o solvente conforme necessário para que a areia fique quase seca, mas a sílica permaneça completamente coberta.

Para iniciar a separação, adicione a amostra à coluna sem mexer na areia. Use pequenas porções de solvente para enxaguar qualquer amostra aderida às paredes da coluna e para enxaguar o recipiente de amostra. Drene cuidadosamente o solvente até que o nível esteja logo acima da sílica. Em seguida, com uma pipeta, adicione suavemente 4?5 mL de solvente sem perturbar a camada de areia. Coloque um funil na coluna e encha lentamente com solvente. Remova o frasco e substitua por um tubo de ensaio rotulado. Com o primeiro tubo de ensaio colocado, abra a torneira e recolha o eluído até que o tubo de ensaio esteja quase cheio.

Continue coletando frações até que todos os compostos desejados tenham sido eluídos, procedendo sequencialmente através dos tubos de ensaio rotulados. Quando terminar, feche a torneira.

Para cada composto isolado, combinar as fracções puras num balão de fundo redondo previamente pesado. Retirar o solvente do balão de um evaporador rotativo e pesar em seguida o balão de fundo redondo que contém a massa seca. Para mais informações, veja o vídeo desta coleção sobre evaporação rotativa.

Esta amostra continha uma mistura de tetrafenilporfirina, ou TPP, e flúor. O TPP roxo-avermelhado escuro foi eluído primeiro, seguido pelo fluorenona amarelo. A pureza de cada composto isolado foi confirmada por espectroscopia de RMN.

A cromatografia em coluna é usada na purificação e análise em uma variedade de campos científicos.

A cromatografia líquida de alta eficiência, ou HPLC, é uma forma de cromatografia em coluna que fornece excelente separação entre compostos e pode incorporar detectores especializados, como um detector de radiação para moléculas radiomarcadas. Usando HPLC, um fosfolipídio radiomarcado pode ser facilmente isolado de uma mistura de muitos outros, mesmo que constitua uma pequena porcentagem da mistura. Essas informações podem ajudar a elucidar a produção, regulação e funções de muitas biomoléculas importantes.

A cromatografia flash é uma variante da cromatografia em coluna na qual a fase móvel se move através da coluna sob pressão de ar ou gás, em vez de apenas pelo fluxo por gravidade.

Isso cria uma taxa de fluxo mais rápida, minimizando a difusão para melhor separação. O composto desejado é coletado em algumas frações puras e concentradas, conforme mostrado com cromatografia em camada fina, resultando em excelente rendimento e pureza pós-purificação.

O aparelho de coluna usual não é apropriado para separar pequenos volumes, mas algumas misturas não são compatíveis com técnicas especializadas, como HPLC. A purificação em pequena escala é realizada com colunas de pipeta de vidro, com um bulbo de pipeta usado para cromatografia flash em pequena escala. Isso é particularmente útil ao preparar uma amostra para técnicas de purificação especializadas ou como uma etapa final após a purificação em larga escala.

Você acabou de assistir à introdução da JoVE à cromatografia em coluna. Agora você deve estar familiarizado com os princípios da cromatografia em coluna, um procedimento para cromatografia em coluna de sílica gel e algumas aplicações da técnica.

Obrigado por assistir!