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Eletroforese Capilar (CE)

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Capillary Electrophoresis (CE)

3.10: Ion-Exchange Chromatography

3.15: Cyclic Voltammetry (CV)

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08:50 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratório da Dra.B. Jill Venton – Universidade da Virgínia

A eletroforese capilar (CE) é uma técnica de separação que separa moléculas em um campo elétrico de acordo com o tamanho e a carga. Ce é realizado em um pequeno tubo de vidro chamado capilar que é preenchido com uma solução de eletrólitos. Os analitos são separados devido a diferenças na mobilidade eletroforética, que varia de acordo com carga, viscosidade solvente e tamanho. A eletroforese tradicional em géis é limitada na quantidade de tensão que pode ser aplicada porque os efeitos de aquecimento de Joule arruinarão o gel e a separação. Os capilares têm uma grande relação superfície-área-volume e, assim, dissipam melhor o calor. Portanto, as tensões aplicadas para um experimento de eletroforese capilar são bastante grandes, muitas vezes de 10.000 a 20.000 V.

A eletroforese capilar é útil para separações de alto desempenho. Em comparação com a cromatografia líquida, as separações ce são muitas vezes mais rápidas e eficientes. No entanto, a eletroforese capilar funciona melhor para separar moléculas carregadas, o que não é uma limitação da cromatografia líquida. A CE tem uma capacidade máxima maior do que a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), o que significa que as separações são mais eficientes e mais picos podem ser detectados. A instrumentação pode ser muito simples. No entanto, o HPLC é mais versátil e muitas fases estacionárias e móveis foram desenvolvidas para diferentes tipos de moléculas.

Principles

A eletroforese capilar separa moléculas devido às suas mobilidades eletroforéticas. A mobilidade eletroforética de uma molécula depende de sua carga e do quanto ela é atraída ou repelida pela tensão, bem como pela força de arrasto de atrito que resiste ao movimento. O atrito é proporcional ao raio da molécula. Assim, a mobilidade eletroforética é baseada no tamanho e na carga. A velocidade que uma molécula carregada viaja por um capilar é o produto de sua mobilidade eletroforética e do campo elétrico aplicado. Tensões mais altas, portanto, levam a velocidades mais rápidas e separações mais rápidas.

A maioria dos instrumentos de eletroforese capilar são configurados com a tensão negativa na extremidade do detector e a tensão positiva na entrada. Isso significa que moléculas carregadas positivamente migram para o cátodo no final, enquanto moléculas carregadas negativamente migram para o outro lado. Todas as moléculas são vistas no detector, no entanto, porque há um fluxo de fluido a granel chamado fluxo eletroosmótico. A ordem de migração é, portanto, positivamente carregada, neutra e, em seguida, moléculas carregadas negativamente.

O fluxo eletroosmótico é causado pela aplicação de uma alta tensão a um pequeno capilar de vidro cheio de uma solução de sal. Os íons carregados positivamente na solução de sal formam uma camada dupla com os grupos de silanol carregados negativamente nas paredes do vidro. Quando uma tensão negativa é aplicada na extremidade do capilar, ela puxa os cáations da camada dupla, que também puxa a solução ao seu redor devido às forças de atrito. Este tipo de fluxo é em forma de plug-in e leva a menos ampliação de banda do que os plugues de fluxo em forma de parabólica do HPLC.

Moléculas neutras fluem na mesma velocidade do fluxo eletroosmótico. No entanto, uma fase pseudo-estacionária pode ser adicionada ao buffer de execução para formar micelas que as moléculas podem dividir dentro e fora. Uma fase pseudo-estacionária típica é o dodecylsulfato de sódio. As micelas são carregadas negativamente do lado de fora, então elas têm uma mobilidade eletroforética, então o tempo gasto na micela determina o tempo de migração. Esta forma de eletroforese capilar é chamada de cromatografia eletrocinética micelar (MEKC).

A detecção em CE é semelhante à do HPLC. UV-Vis é geral e não requer marcação enquanto a molécula tiver uma ligação dupla. No entanto, a absorvância depende do comprimento do caminho, que é pequeno para um capilar de 50 μm. Uma célula bolha ou célula z aumentará o comprimento do caminho. Fluorescência induzida por laser é um método de detecção mais sensível. Um laser é brilhado através de uma janela na capilaridade e fluorescência do produto medido. Embora a fluorescência forneça sensibilidade muito alta, geralmente requer que as moléculas sejam marcadas porque a maioria não é fluorescente. Detecção eletroquímica e detecção de espectrometria de massa eletrospray estão ganhando popularidade. O problema com qualquer um desses detectores é que a alta tensão da separação deve ser levada ao solo antes da detecção, pois eletroquímica e eletrospray requerem a aplicação de uma tensão e a tensão CE pode interferir. Novos métodos de desacoplamento da tensão CE, utilizando eletrodos para drenar a corrente ou uma pequena rachadura no capilar, estão superando esses desafios.

Procedure

1. Configuração de instrumentação CE

Ligue o instrumento CE e o computador. Usando o software do computador, ligue a fonte de luz para análise UV para permitir que ele se aqueça. Alguns softwares têm um indicador quando a lâmpada está pronta para uso (o ícone da lâmpada vira cor).
Faça um arquivo de métodos. Defina os parâmetros importantes para a execução do CE. Nesta análise, as temperaturas do cartucho e do armazenamento da amostra são de 35 °C. O comprimento de onda para detecção de UV é de 214 nm.
Escreva um programa de tempo. O programa geralmente consiste em passos de lavagem (para limpar o capilar antes da análise), passos de injeção e, em seguida, um passo de eletroforese. Para a etapa de lavagem, realize 2 enxágües por 1 min usando 20 psi de pressão. A primeira lavagem é com NaOH, que ajuda a garantir que os grupos de silanol na parede capilar sejam desprodoados. A segunda lavagem é com buffer de execução (tampão de 0,025 M de borate aqui) para garantir que o capilar seja deixado equilibrado com buffer.
Para a injeção, a injeção de pressão é usada a 0,5 psi para 5 s.
Para o passo da eletroforese, as condições são tensão de separação: 20 kV, tempo: 5 min, polaridade normal. Para cada etapa, indique também qual frasco é a entrada e qual frasco é a saída. Salve o arquivo de métodos depois que todos os parâmetros forem inseridos.

2. Preparação das Normas e Amostras de Refrigerante

Faça soluções de estoque de 500 ppm de aspartame, cafeína e ácido benzoico na água. Faça 50 mL de cada um, usando um frasco volumoso.
Faça uma solução padrão de 150 ppm aspartame, 150 ppm de cafeína e 100 ppm de ácido benzoico em um frasco volumoso de 10 mL.
Faça soluções padrão de cafeína de 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm e 200 ppm em frascos volumosos de 10 mL.

3. Execute as amostras no CE

Coloque os frascos contendo normas ou amostras de refrigerante no porta-frascos de amostra. Certifique-se de anotar qual amostra está em qual slot. Dois slots têm o buffer de execução de borate e a solução de enxaguante NaOH de 0,1 M.
No arquivo do método, entrada que slot o primeiro frasco de amostra está dentro
Adquira uma única execução, certificando-se de inserir todas as informações de dados que o programa solicita.
Continue a adquirir dados, alterando o frasco de entrada para cada amostra. Execute o padrão de combinação, as 3 concentrações de cafeína, e uma amostra pepsi e pepsi diet.
Insira o alvo no instrumento e escolha o instrumento apropriado.
Analise os dados no computador. Calcule as áreas de pico e os padrões de sobreposição e amostras reais para ajudar a identificar picos. Faça uma curva de calibração para os dados da cafeína.

A eletroforese capilar, ou CE, é uma técnica usada na análise química para separar moléculas em um campo elétrico de acordo com o tamanho e a carga.

A Eletroforese capilar é realizada em um tubo de diâmetro submilímetro, chamado capilar, que contém uma solução de eletrólito fluindo. A amostra é injetada no capilar, e um campo elétrico é aplicado. As moléculas são então separadas com base na diferença em sua velocidade, que é influenciada pela carga, tamanho e viscosidade do solvente. Ce é ideal para a separação de moléculas carregadas e tem uma resolução maior do que a cromatografia líquida de alto desempenho, tornando-a mais eficiente e sensível.

Este vídeo introduzirá o básico da eletroforese capilar e demonstrará seu uso determinando a composição de um refrigerante.

Em CE, um campo elétrico é aplicado a um capilar cheio de eletrólito. O campo elétrico induz uma carga positiva na entrada capilar, e uma carga negativa na tomada.

O eletrólito flui dentro do capilar, induzido pelo campo elétrico. Este fluxo, chamado fluxo eletro-osmótico, é causado pelo movimento de uma camada discreta de íons de sal carregados positivamente ao longo das paredes capilares carregadas negativamente.

À medida que a corrente elétrica atravessa o capilar, os cáations ao longo da parede se movem em direção ao final negativo. Este fluxo de íons puxa a solução no centro através do tubo.

As moléculas da amostra são então separadas com base em sua velocidade dentro do capilar. Essa velocidade, chamada mobilidade eletroforética, depende da carga e tamanho das moléculas, e do quanto ela é atraída ou repelida por um campo elétrico.

Moléculas carregadas positivamente fluem mais rapidamente através do capilar, pois são mais atraídas pelo potencial na tomada. Moléculas carregadas negativamente fluem muito mais lentamente, pois são mais atraídas pelo potencial na entrada. Moléculas neutras são transportadas junto com o fluxo a granel. Assim, a ordem das moléculas que saem do capilar é positivamente carregada, neutra e, em seguida, carregada negativamente. Além disso, o fluxo de eletrólitos puxa moléculas menores mais rápido do que moléculas maiores devido às forças de atrito.

As moléculas são registradas por um detector, como o UV-Vis, quando saem da coluna, e são visualizadas em um gráfico de intensidade de sinal detector versus tempo, chamado de eletroferograma.

Eletroferogramas podem gerar uma gama de informações; como quantos compostos diferentes estão presentes em uma amostra e a quantidade de cada substância.

Agora que você viu uma breve sinopse de eletroforese capilar, vamos dar uma olhada em como é realizada em laboratório.

Primeiro, ligue o instrumento de eletroforese capilar e o computador. Em seguida, ligue o detector UV para permitir que ele aqueça.

Defina os parâmetros para executar o experimento. Primeiro, defina a temperatura do cartucho e o armazenamento da amostra para 35 °C e o comprimento de onda para detecção de UV para 214 nm.

Em seguida, coloque os dois passos de enxágue. A primeira lavagem é com hidróxido de sódio para garantir que os grupos de silanol na parede capilar sejam protoados. A segunda lavagem usa tampão de corrida para equilibrar o capilar. Em seguida, defina a amostra para injetar em 0,5 psi para 5 s.

Defina a etapa de eletroforese, selecionando a tensão de separação. Neste caso, use 20 kV por 5 min usando polaridade normal, o que significa que o campo elétrico é positivo na entrada e negativo na tomada.

Primeiro, prepare 50 mL de soluções de estoque dos componentes de refrigerante aspartame, cafeína e ácido benzoico a 500 partes por milhão de água.

A partir das soluções de estoque, faça uma solução padrão de 150 ppm aspartame, 150 ppm de cafeína e 100 ppm de ácido benzoico.

Em seguida, faça 4 soluções padrão de cafeína a 50, 100, 150 e 200 ppm. Estas amostras serão usadas para fazer uma curva de calibração. Antes de mais informações, veja o vídeo desta coleção em curvas de calibração.

Finalmente, prepare as amostras de refrigerante desgaseando-as com nitrogênio. As amostras de refrigerante serão analisadas sem diluição.

Coloque os frascos contendo amostras padrão ou refrigerante no porta-frascos. Coloque os frascos que contêm o tampão de execução e a solução de lavagem de hidróxido de sódio no suporte da amostra também. Certifique-se de registrar a localização de cada um.

No software de instrumento CE, indique quais slots contêm as duas soluções de enxágue e o primeiro frasco de amostra. Agora, execute a primeira amostra.

Em seguida, execute o padrão de combinação, as 4 concentrações de cafeína, e uma amostra regular de refrigerante diet alterando o frasco de entrada.

Quando todas as soluções tiverem sido separadas, analise os dados.

Primeiro, use os padrões para identificar os picos nas amostras de refrigerante. Uma comparação dos três picos observados na amostra de refrigerante diet aos padrões mostra que cafeína, aspartame e ácido benzoico estão presentes no refrigerante diet. Na amostra regular de refrigerante, apenas o pico da cafeína está presente, mas não os picos de ácido aspartame e benzoico.

Em seguida, calcule a área de pico para cada solução padrão de cafeína e faça uma curva de calibração. A curva de calibração da cafeína pode ser usada para calcular a concentração de cafeína em cada amostra.

A eletroforese capilar é usada para muitas separações especializadas em ambientes acadêmicos e industriais.

A CE é frequentemente usada como um componente dos testes de controle de qualidade da indústria farmacêutica. Drogas, seja como pequenas moléculas ou biológicas, podem ser executadas através da eletroforese capilar para ver se algum produto lateral está presente. Também pode ser usado para determinar se as proteínas estão corretamente dobradas, pois a dobra pode afetar a carga proteica.

Ce também pode ser usado para separar DNA. Usando uma placa de microwell e várias matrizes de capilares, os pesquisadores podem aumentar o rendimento de um único experimento, como mostrado aqui. Fragmentos de DNA foram separados com base no tamanho, com uma resolução até 1 par base. Isso torna possível o sequenciamento de fragmentos de DNA, juntamente com a determinação de outros parâmetros como variantes de número de cópia, que é usado para diagnosticar doenças genéticas potenciais.

Uma proteína pode ser modificada por vários grupos funcionais que estão quimicamente ligados a diferentes locais. Diferentes cópias da mesma proteína podem variar com diferentes modificações, o que mudará a carga e o tamanho de cada proteína. Executar as proteínas purificadas através de um CE que é anexado a um espectrômetro de massa pode separar proteínas com base nas quais modificações estão presentes, e também identificar o tipo e a localização da modificação.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à eletroforese capilar. Agora você deve entender como a CE separa moléculas baseadas em carga e massa, e como executar uma amostra no CE no laboratório.

Obrigado por assistir!

Results

Eletroferogramas coletados para amostras diet pepsi e pepsi são mostrados nas Figuras 1 e 2, respectivamente. Os três picos de cafeína, aspartame e ácido benzoico são observados na Pepsi diet e têm tempos de migração semelhantes aos padrões. Para a Pepsi normal, o pico da cafeína está presente, mas não os picos de aspartame e ácido benzoico. A análise ce é rápida, pois os tempos de migração são de apenas 3 a 4 minutos.

A curva de calibração para cafeína é mostrada na Figura 3. Esta curva pode ser usada para calcular a concentração de cafeína em cada amostra.

Figura 1. Análise CE da Diet Pepsi. O vermelho são padrões de cafeína, aspartame e ácido benzoico. O preto é uma amostra diet pepsi. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Análise CE da Pepsi. O preto é uma amostra de Pepsi, enquanto o vermelho é uma amostra de padrões de cafeína, aspartame e ácido benzoico. Não há aspartame ou ácido benzoico, indicando que o refrigerante não é dieta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Gráfico de calibração da cafeína com CE. Um parcela da área de pico versus concentração para padrões de cafeína medidos com CE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Applications and Summary

A eletroforese capilar é usada para muitas separações especiais. Por exemplo, é usado na indústria farmacêutica para testes de qualidade, para se certificar de que não há produtos laterais ou interferentes. Ce é particularmente útil para separar drogas com um grupo de amino básico, pois as paredes do capilar podem ser neutras com um pH ácido e, portanto, a droga não vai grudar no capilar.

Um modo de CE também foi usado para sequenciar o genoma humano e separar o DNA. Este modo de CE é eletroforese de gel capilar e para essas separações, um polímero é injetado no capilar ce. O polímero dá um modo adicional de separação com base no tamanho, já que os fragmentos menores podem viajar mais rápido através do gel. Isso é chamado de peneira, e junto com a separação eletroforética, tem 1 resolução de par de base para análise de DNA.

Transcript

Capillary electrophoresis, or CE, is a technique used in chemical analysis to separate molecules in an electric field according to size and charge.

Capillary Electrophoresis is performed in a sub-millimeter diameter tube, called a capillary, which contains a flowing electrolyte solution. The sample is injected into the capillary, and an electric field is applied. The molecules are then separated based on the difference in their velocity, which is influenced by charge, size, and the solvent’s viscosity. CE is ideal for the separation of charged molecules and has a greater resolution than high-performance liquid chromatography, making it more efficient and sensitive.

This video will introduce the basics of capillary electrophoresis and demonstrate its use by determining the composition of a soft drink.

In CE, an electric field is applied to a capillary filled with an electrolyte. The electric field induces a positive charge at the capillary inlet, and a negative charge at the outlet.

The electrolyte flows within the capillary, induced by the electric field. This flow, called electro-osmotic flow, is caused by the movement of a discrete layer of positively-charged salt ions along the negatively-charged capillary walls.

As the electric current runs through the capillary, the cations along the wall move toward the negative end. This ion flow pulls the solution in the center through the tube.

The sample molecules are then separated based on their velocity within the capillary. This velocity, called electrophoretic mobility, depends on the molecules’ charge and size, and how much it is attracted or repelled by an electric field.

Positively-charged molecules flow faster through the capillary, as they are more attracted to the potential at the outlet. Negatively-charged molecules flow much slower, as they are more attracted to the potential at the inlet. Neutral molecules are carried along with the bulk flow. Thus, the order of molecules exiting the capillary is positively-charged, neutral, and then negatively-charged. Additionally, the electrolyte flow pulls smaller molecules faster than larger molecules due to frictional forces.

Molecules are recorded by a detector, such as UV-Vis, as they exit the column, and are visualized in a plot of detector signal intensity versus time, called an electropherogram.

Electropherograms can yield a range of information; such as how many different compounds are present in a sample and the amount of each substance.

Now that you’ve seen a brief synopsis of capillary electrophoresis, let’s take a look at how it is performed in the laboratory.

First, turn on the capillary electrophoresis instrument and computer. Then switch on the UV detector to allow it to warm up.

Set the parameters for running the experiment. First, set the temperature for the cartridge and sample storage to 35 °C and the wavelength for UV detection to 214 nm.

Next, set the two rinse steps. The first rinse is with sodium hydroxide to ensure that the silanol groups on the capillary wall are protonated. The second rinse uses running buffer to equilibrate the capillary. Then, set the sample to inject at 0.5 psi for 5 s.

Set the electrophoresis step, by selecting the separation voltage. In this case, use 20 kV for 5 min using normal polarity, meaning that the electric field is positive at the inlet and negative at the outlet.

First, prepare 50 mL stock solutions of the soda components aspartame, caffeine, and benzoic acid at 500 parts-per-million in water.

From the stock solutions, make a standard solution of 150 ppm aspartame, 150 ppm caffeine, and 100 ppm benzoic acid.

Then, make 4 standard solutions of caffeine at 50, 100, 150, and 200 ppm. These samples will be used to make a calibration curve. Fore more information, see this collection’s video on calibration curves.

Finally, prepare the soda samples by degassing them with nitrogen. The soda samples will be analyzed with no dilution.

Place the vials containing either standard or soda samples into the vial holder. Place the vials containing the run buffer and the sodium hydroxide rinse solution into the sample holder as well. Make sure to record the location of each.

In the CE instrument software, indicate which slots contain the two rinse solutions and the first sample vial. Now, run the first sample.

Then, run the combination standard, the 4 concentrations of caffeine, and a regular and diet soda sample by changing the input vial.

When all of the solutions have been separated, analyze the data.

First, use the standards to identify the peaks in the soda samples. A comparison of the three peaks observed in the diet soda sample to the standards shows that caffeine, aspartame, and benzoic acid are present in the diet soda. In the regular soda sample, only the caffeine peak is present, but not the aspartame and benzoic acid peaks.

Then, calculate the peak area for each caffeine standard solution, and make a calibration curve. The calibration curve for caffeine can be used to calculate the concentration of caffeine in each sample.

Capillary electrophoresis is used for many specialty separations in academic and industrial settings.

CE is often used as one component of pharmaceutical industry quality control testing. Drugs, either as small molecules or biologics, can be run through capillary electrophoresis to see if any side products are present. It can also be used to determine whether proteins are properly folded, as folding can affect protein charge.

CE can also be used to separate DNA. Using a microwell plate and multiple arrays of capillaries, researchers can increase the throughput of a single experiment, as shown here. DNA fragments were separated based on size, with a resolution down to 1 base pair. This makes sequencing fragments of DNA possible, along with determining other parameters like copy number variants, which is used to diagnose potential genetic diseases.

A protein can be modified by various functional groups that are chemically attached to different locations. Different copies of the same protein can vary with different modifications, which will change the charge and size of each protein. Running the purified proteins through a CE that is attached to a mass spectrometer can separate proteins based on which modifications are present, and also identify the type and location of the modification.

You’ve just watched JoVE’s introduction to capillary electrophoresis. You should now understand how CE separates molecules based on charge and mass, and how to run a sample on the CE in the lab.

Thanks for watching!

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Capillary Electrophoresis CE Chemical Analysis Separate Molecules Electric Field Size Charge Sub-millimeter Diameter Tube Capillary Flowing Electrolyte Solution Velocity Charge Size Solvent's Viscosity Resolution High-performance Liquid Chromatography Efficiency Sensitivity