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A eletroforese capilar, ou CE, é uma técnica usada em análise química para separar moléculas em um campo elétrico de acordo com o tamanho e a carga.
A eletroforese capilar é realizada em um tubo de diâmetro submilimétrico, chamado capilar, que contém uma solução eletrolítica fluida. A amostra é injetada no capilar e um campo elétrico é aplicado. As moléculas são então separadas com base na diferença em sua velocidade, que é influenciada pela carga, tamanho e viscosidade do solvente. O CE é ideal para a separação de moléculas carregadas e tem uma resolução maior do que a cromatografia líquida de alta eficiência, tornando-o mais eficiente e sensível.
Este vídeo apresentará os fundamentos da eletroforese capilar e demonstrará seu uso determinando a composição de um refrigerante.
Na EC, um campo elétrico é aplicado a um capilar preenchido com um eletrólito. O campo elétrico induz uma carga positiva na entrada capilar e uma carga negativa na saída.
O eletrólito flui dentro do capilar, induzido pelo campo elétrico. Esse fluxo, chamado fluxo eletro-osmótico, é causado pelo movimento de uma camada discreta de íons de sal carregados positivamente ao longo das paredes capilares carregadas negativamente.
À medida que a corrente elétrica passa pelo capilar, os cátions ao longo da parede se movem em direção à extremidade negativa. Este fluxo de íons puxa a solução no centro através do tubo.
As moléculas da amostra são então separadas com base em sua velocidade dentro do capilar. Essa velocidade, chamada mobilidade eletroforética, depende da carga e do tamanho das moléculas e de quanto ela é atraída ou repelida por um campo elétrico.
Moléculas carregadas positivamente fluem mais rapidamente através do capilar, pois são mais atraídas pelo potencial na saída. Moléculas carregadas negativamente fluem muito mais devagar, pois são mais atraídas pelo potencial na entrada. Moléculas neutras são transportadas junto com o fluxo em massa. Assim, a ordem das moléculas que saem do capilar é carregada positivamente, neutra e, em seguida, carregada negativamente. Além disso, o fluxo de eletrólitos puxa moléculas menores mais rapidamente do que moléculas maiores devido às forças de atrito.
As moléculas são registradas por um detector, como o UV-Vis, à medida que saem da coluna e são visualizadas em um gráfico de intensidade do sinal do detector versus tempo, chamado eletroferograma.
Os eletroferogramas podem fornecer uma série de informações; como quantos compostos diferentes estão presentes em uma amostra e a quantidade de cada substância.
Agora que você viu uma breve sinopse da eletroforese capilar, vamos dar uma olhada em como ela é realizada em laboratório.
Primeiro, ligue o instrumento de eletroforese capilar e o computador. Em seguida, ligue o detector UV para permitir que ele aqueça.
Defina os parâmetros para executar o experimento. Primeiro, defina a temperatura do cartucho e do armazenamento da amostra para 35 ? C e o comprimento de onda para detecção de UV para 214 nm.
Em seguida, defina as duas etapas de enxágue. O primeiro enxágue é com hidróxido de sódio para garantir que os grupos silanol na parede capilar sejam protonados. O segundo enxágue usa tampão de corrida para equilibrar o capilar. Em seguida, defina a amostra para injetar a 0,5 psi por 5 s.
}Defina a etapa de eletroforese, selecionando a tensão de separação. Neste caso, use 20 kV por 5 min usando polaridade normal, o que significa que o campo elétrico é positivo na entrada e negativo na saída.
Primeiro, prepare 50 mL de soluções de estoque dos componentes do refrigerante aspartame, cafeína e ácido benzóico a 500 partes por milhão em água.
A partir das soluções padrão, faça uma solução padrão de 150 ppm de aspartame, 150 ppm de cafeína e 100 ppm de ácido benzóico.
Em seguida, faça 4 soluções padrão de cafeína a 50, 100, 150 e 200 ppm. Essas amostras serão usadas para fazer uma curva de calibração. Para mais informações, veja o vídeo desta coleção sobre curvas de calibração.
Por fim, prepare as amostras de refrigerante desgaseificando-as com nitrogênio. As amostras de refrigerante serão analisadas sem diluição.
Coloque os frascos contendo amostras padrão ou de refrigerante no suporte do frasco. Coloque também os frascos para injetáveis que contêm o tampão de corrida e a solução de enxágue de hidróxido de sódio no porta-amostras. Certifique-se de registrar a localização de cada um.
No software do instrumento CE, indique quais slots contêm as duas soluções de enxágue e o primeiro frasco de amostra. Agora, execute o primeiro exemplo.
Em seguida, execute o padrão de combinação, as 4 concentrações de cafeína e uma amostra de refrigerante regular e diet, alterando o frasco de entrada.
Quando todas as soluções tiverem sido separadas, analise os dados.
Primeiro, use os padrões para identificar os picos nas amostras de refrigerante. Uma comparação dos três picos observados na amostra de refrigerante diet com os padrões mostra que cafeína, aspartame e ácido benzóico estão presentes no refrigerante diet. Na amostra de refrigerante regular, apenas o pico de cafeína está presente, mas não os picos de aspartame e ácido benzóico.
Em seguida, calcule a área do pico para cada solução padrão de cafeína e faça uma curva de calibração. A curva de calibração para cafeína pode ser usada para calcular a concentração de cafeína em cada amostra.
A eletroforese capilar é usada para muitas separações especializadas em ambientes acadêmicos e industriais.
O CE é frequentemente usado como um componente dos testes de controle de qualidade da indústria farmacêutica. Os medicamentos, como pequenas moléculas ou biológicos, podem ser executados por eletroforese capilar para ver se algum produto secundário está presente. Também pode ser usado para determinar se as proteínas estão dobradas corretamente, pois o dobramento pode afetar a carga da proteína.
O CE também pode ser usado para separar o DNA. Usando uma placa de micropoços e várias matrizes de capilares, os pesquisadores podem aumentar o rendimento de um único experimento, como mostrado aqui. Os fragmentos de DNA foram separados com base no tamanho, com resolução de até 1 par de bases. Isso possibilita o sequenciamento de fragmentos de DNA, juntamente com a determinação de outros parâmetros, como variantes do número de cópias, que são usadas para diagnosticar possíveis doenças genéticas.
Uma proteína pode ser modificada por vários grupos funcionais que estão quimicamente ligados a diferentes locais. Diferentes cópias da mesma proteína podem variar com diferentes modificações, o que mudará a carga e o tamanho de cada proteína. A execução das proteínas purificadas através de um CE que está ligado a um espectrômetro de massa pode separar proteínas com base nas modificações presentes e também identificar o tipo e a localização da modificação.
Você acabou de assistir à introdução de JoVE à eletroforese capilar. Agora você deve entender como o CE separa as moléculas com base na carga e na massa e como executar uma amostra no CE no laboratório.
Obrigado por assistir!