What factors determine which blood withdrawal method to use in mice and rats?

Blood withdrawal method selection depends on four key factors: the volume of blood needed, frequency of sampling, the animal's health status, and the technician's skill level. These considerations ensure the procedure is safe, effective, and appropriate for the specific research requirements. Different methods—retro-orbital, tail snip, and intracardiac—suit different experimental needs.

What is the difference between plasma and serum in blood samples?

Plasma is collected from whole blood with anticoagulant and contains fibrinogen and clotting factors. Serum is collected from whole blood without anticoagulant; after clotting, the top layer lacks fibrinogen and clotting factors. The choice depends on experimental requirements, as each sample type has distinct biochemical properties and applications.

Why is needle selection important for blood collection in rodents?

Needle selection depends on animal size and venipuncture site. Large bore needles cause less blood cell damage and enable rapid collection but risk vessel damage. Needle length matters too—if too long, blood may clot inside the needle. Appropriate sizes range from 18 to 29 gauge and 0.5 to 1.5 inches, with specific sizes recommended for each collection method.

How is the retro-orbital bleeding technique performed in mice?

After anesthetizing the animal with inhalation anesthetic, place it in lateral recumbency. Pull skin back along the jaw to induce eye protrusion. Insert a micro-hematocrit tube into the medial canthus at 30-45 degrees, rotating gently to rupture the ocular sinus. Blood flows by capillary action. Release skin to stop bleeding and allow minimum 10 days between repeated collections for tissue healing.

What are the main complications associated with retro-orbital bleeding?

Complications include excessive swelling causing eye protrusion and corneal drying, improper tube placement severing the optic nerve causing blindness, eyeball displacement, orbital bone fracturing, eye globe penetration, and hematoma formation. Despite these risks, when performed by a skilled technician on a fully anesthetized animal, retro-orbital bleeding remains an effective collection method.

How does tail snip collection differ from tail vessel nick collection?

Tail snip uses a sterile scalpel to cut the tail tip, allowing serial collections by disrupting the original scab. Tail vessel nick is less invasive, making a small cut over the lateral tail vein two-thirds from the rump. Both methods may contain tissue product contamination. Tail snips produce arterial and venous blood, while nicks target venous blood specifically.

What is the procedure for intracardiac blood collection and how much blood can be collected?

After euthanizing with carbon dioxide, hold the rodent by the scruff with body hanging vertically. Insert the needle bevel-up into the chest at the notch left of the xiphoid, parallel to the spine. Apply slight backpressure; blood flows if needle is in heart. Approximately half the total blood volume can be collected—about 1 mL from mice and 10 mL from rats using anesthesia induction and maintenance protocols.

Retirada de Sangue I

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1. Sangramento retro-orbital

Equipamento
1. Prepare um frasco de sino, ou câmara de indução anestésico, para administrar um gás anestésico como isoflurano. Ao usar um frasco de sino, é imprescindível que o anestésico líquido não entre em contato com o animal, para evitar a absorção através da pele. Uma plataforma com pequenos buracos pode ser usada.
2. São preferidos tubos de microhematocrito que possuem 50-75 microliters. Os tubos embrulhados mylar são menos propensos a quebrar entre os dedos do operador e devem ser considerados como uma medida de segurança.
3. Várias espessuras de papel toalha, ou outros materiais isolantes, são colocadas na superfície de trabalho para manter o calor corporal do animal durante o procedimento.
Preparação e posicionamento do animal
1. O animal é anestesiado com um anestésico de inalação, como isoflurano, em um frasco de sino ou câmara de indução de anestesia a gás, para efeito.
2. Uma vez que o animal é totalmente anestesiado, ele é removido e colocado em recumedência lateral.
3. O olho é salientes colocando um dedo na parte superior da cabeça e ao longo da mandíbula, e puxando a pele para trás e para baixo.
4. Evite aplicar pressão na traqueia, pois isso pode entrar em colapso ou ocluir as vias aéreas causando a morte por asfixia.
Retirada de sangue
1. O microhematocrit é colocado no canthus medial do olho e direcionado caudally a um ângulo de 30-45° do plano do nariz.
2. Aplique pressão enquanto gira suavemente o tubo hematócrito. Isso cortará as membranas conjuntivistas e romperá o plexo ocular.
3. O sangue fluirá para o tubo hematócrito por ação capilar.
4. Evite empurrar tão fundo que você atingiu o osso na parte de trás da cavidade ocular.
5. Uma vez que o sangue começa a fluir, mantenha a pressão para manter o olho salientes.
6. Para coletar vários tubos de sangue, não é necessário colocar o próximo tubo no plexo ocular, pois o sangue continuará a fluir e pode ser coletado como vem do canthus medial.
7. Para parar de sangrar, solte a pele e deixe o olho voltar à posição normal. Aplique pressão na órbita para garantir hemostasia.

Figura 1. Retirada de sangue orbital retrô em camundongos.

2. Procedimentos de sangramento na cauda: corte de cauda e corte de cauda

Equipamento
1. Uma lâmina de bisturi estéril, de preferência uma lâmina número 11 ou uma lâmina de barbear de um lado único, é usada para fazer a amputação inicial para o método de corte de cauda. A tesoura não deve ser utilizada porque o corte feito por tesoura é esmagamento, promovendo assim a coagulação e a redução do fluxo sanguíneo. Para o procedimento de corte da cauda, uma lâmina de bisturi número 11 ou 15 é usada para fazer o corte.
2. Um tubo de contenção que permite o acesso à cauda do mouse é preparado.
3. Toalhas de papel absorvente ou gaze são usadas como substrato para a realização do corte de cauda.
4. Também são necessários tubos de coleta ou tubos hematócritos.
5. O pó esticado deve estar disponível para auxiliar na hemostasia.
Restrição
1. O animal é colocado no tubo de tal forma que a cauda é acessível. Para os contê-inérculos do tipo Broome, o animal é puxado garupa primeiro para dentro do tubo. Para outros tubos, o animal é colocado de cabeça.
2. Os animais são fixados no tubo de tal forma que não podem se virar ou retirar a cauda.
3. Alguns camundongos permitirão a coleta de cauda e sangue com mínima contenção manual se eles forem autorizados a pegar uma superfície áspera.
4. Alguns ratos exigirão anestesia por inalação para este método de coleta de sangue.
Retirada de sangue
1. A cauda é limpa com água morna para remover detritos e causar leve vasodilatação. NÃO use água quente.
2. Para o corte da cauda, a cauda é estendida, e a extremidade da cauda (0,5-1 mm para ratos e até 2 mm para ratos) é cortada com a lâmina do bisturi.
3. Para o corte da cauda, a cauda é estendida, e um corte é feito com a lâmina do bisturi aproximadamente 2/3 a distância da garupa, diretamente sobre a veia traseira lateral.
4. A cauda pode ser acariciada de garupa para ponta para incentivar o fluxo sanguíneo; no entanto, isso diminuirá a qualidade da amostra.
5. O sangue é coletado da ponta ou corte usando tubos hematócritos ou permitido pingar em um frasco de coleta.

3. Coleta de sangue cardíaco

Equipamento
1. Para um rato, é preferível uma seringa de 3 cc com uma agulha calibre 22-25 x 1". Seringas menores não têm a mesma pressão nas costas e podem dificultar a retirada de sangue. Agulhas menores que 25 medidores restringem o fluxo de sangue, levando ao aumento da coagulação e danos às células sanguíneas. Agulhas menores que 1" podem não atingir o nível do coração quando se aproximam do diafragma.
2. Para um rato, é preferível uma seringa de 10-12 cc com uma agulha de calibre x 1,5". Dependendo do tamanho do rato, uma seringa menor pode não conter todo o volume sanguíneo a ser coletado, e assim a seringa teria que ser alterada durante o procedimento. Agulhas menores que 20 medidores restringem o fluxo do sangue, levando ao aumento da coagulação. Agulhas menores que 1,5" podem não atingir o nível do coração quando se aproximam do diafragma.
3. Um tubo de coleta de sangue de tamanho suficiente é usado para manter o sangue coletado.
Restrição
1. A contenção adequada é essencial para o sucesso deste método. O animal é segurado pelo scruff com o corpo pendurado verticalmente. É importante que o corpo seja reto para evitar a deflexão do coração ou uma torção do peito.
2. Uma posição alternativa é a recumbência dorsal ao colocar a agulha entre as costelas do lado esquerdo do animal. Isso é especialmente útil para ratos muito grandes ou quando vários animais devem ser sangrados.

Figura 2. Retirada de sangue cardíaco com rato mantido verticalmente.

Retirada de sangue
1. A abordagem do aspecto posterior, pontuando o diafragma é mais facilmente realizada quando o rato ou rato é mantido verticalmente pelo scruff.
  1. A agulha é avançada no entalhe apenas à esquerda do xiphoide do animal.
  2. A agulha deve ser paralela à coluna vertebral e colocada logo abaixo das costelas.
  3. O coração está localizado aproximadamente ao nível do cotovelo.
  4. Coloque a agulha, bisbida, no peito, e perfure o coração.
  5. Aplique uma leve pressão nas costas com a seringa. Se a agulha estiver no coração, o sangue fluirá para dentro da seringa.
  6. Espere até que o sangue tenha enchido a seringa antes de adicionar pressão adicional nas costas na seringa.
2. A abordagem lateral do lado esquerdo do animal requer o posicionamento do animal na recumbência dorsal.
  1. O ponto de entrada é medido contra o ponto do cotovelo na parede do peito. O coração está localizado aproximadamente ao nível do cotovelo.
  2. A agulha é inserida perpendicular ao plano da mesa em um ponto no meio da parede do peito como medido dorsoventrally.
  3. Coloque a agulha, bisbida, no peito, e perfure o coração.
  4. Aplique uma leve pressão nas costas com a seringa. Se a agulha estiver no coração, o sangue fluirá para dentro da seringa.
  5. Espere até que o sangue tenha enchido a seringa antes de adicionar pressão adicional na seringa.

Figura 3. Retirada de sangue cardíaco com rato em posição de recumbência dorsal.

Dicas técnicas
1. O coração normal está situado com o ápice apontando para a esquerda. Em raros casos, o coração pode ser invertido, resultando em dificuldade em perfurar o coração.
2. A pressão excessiva nas costas na seringa pode colapsar o coração, ocluindo o bisel da agulha e impedindo o fluxo sanguíneo para dentro da seringa.
3. Aplicar pressão traseira e liberá-la repetidamente iniciará a coagulação na seringa.
4. Aplicar suavemente pressão no fígado pode forçar o volume sanguíneo adicional para o sistema circulatório, tornando-o disponível para retirada.

4. Retirada posterior de sangue vena cava

Equipamento
1. Uma seringa de tuberculose com uma agulha calibre 25-29 é usada para coleta de sangue no camundongo. Para ratos, é necessária uma seringa de 10-12 cc com uma agulha calibre 22-25 x 1".
2. Uma plataforma cirúrgica, bandeja de dissecção ou outra superfície para proteger o animal são necessárias, juntamente com laços, fita ou pinos para afixar os membros em posição.
3. A anestesia injetável ou a anestesia da inalação é necessária. Se usar anestesia de inalação, é desejável que o anestésico seja entregue através de um vaporizador de precisão com um cone de nariz. O comprimento do procedimento é tal que o uso de uma câmara de indução sem entrega adicional de gás anestésico não fornecerá tempo suficiente para completar a retirada de sangue antes que o animal reaviva.
4. São necessárias tesouras de íris para o rato, ou uma tesoura afiada para o rato, juntamente com pequenas fórceps atraumáticas do polegar e uma esponja de gaze de 2"x 2".
Restrição
1. Quando o animal é totalmente anestesiado, determinado por pinça do dedo do dedo ou beliscão da cauda, o animal é colocado em recumbência dorsal.
2. Os membros são fixados na plataforma com fita ou pinos. Os membros devem ser estendidos para longe do corpo.
Retirada
1. A pele é levantada e um pequeno corte transverso é feito através da pele logo acima da pelve em fêmeas, ou logo acima do prepuce em machos.
2. O ponto da tesoura é colocado no corte, e uma incisão midline é feita através da pele da pelve/prepuce para o xifoide.
3. A pele é refletida lateralmente para cada lado. Dissecção contundente pode ser necessária para soltá-lo do músculo subjacente.
4. O músculo é levantado, e um pequeno corte transverso é feito através do músculo logo acima do corte da pele.
5. O ponto da tesoura é colocado no abdômen e uma incisão média é feita através do músculo para o xiphoide. Certifique-se de inclinar o ponto da tesoura para cima para evitar o corte de quaisquer órgãos.
6. Corte transversalmente ao longo da curva das costelas de cada lado. Tenha cuidado extra para não perfurar o fígado.
7. Mova suavemente os intestinos para a esquerda do animal para expor a veia cava posterior.
8. Coloque uma almofada de gaze no fígado, e descanse o índice e o dedo médio no fígado.
9. Por outro lado, insira a agulha, bivele para cima, na veia cava no meio do caminho entre a junção dos vasos renais e a bifurcação ilícíaca.
10. Retire lentamente o sangue enquanto aplica pressão no fígado.