Retirada de Sangue I

1. Sangramento retro-orbital

1. Equipamento
   1. Prepare um frasco de sino, ou câmara de indução anestésico, para administrar um gás anestésico como isoflurano. Ao usar um frasco de sino, é imprescindível que o anestésico líquido não entre em contato com o animal, para evitar a absorção através da pele. Uma plataforma com pequenos buracos pode ser usada.
   2. São preferidos tubos de microhematocrito que possuem 50-75 microliters. Os tubos embrulhados mylar são menos propensos a quebrar entre os dedos do operador e devem ser considerados como uma medida de segurança.
   3. Várias espessuras de papel toalha, ou outros materiais isolantes, são colocadas na superfície de trabalho para manter o calor corporal do animal durante o procedimento.
2. Preparação e posicionamento do animal
   1. O animal é anestesiado com um anestésico de inalação, como isoflurano, em um frasco de sino ou câmara de indução de anestesia a gás, para efeito.
   2. Uma vez que o animal é totalmente anestesiado, ele é removido e colocado em recumedência lateral.
   3. O olho é salientes colocando um dedo na parte superior da cabeça e ao longo da mandíbula, e puxando a pele para trás e para baixo.
   4. Evite aplicar pressão na traqueia, pois isso pode entrar em colapso ou ocluir as vias aéreas causando a morte por asfixia.
3. Retirada de sangue
   1. O microhematocrit é colocado no canthus medial do olho e direcionado caudally a um ângulo de 30-45° do plano do nariz.
   2. Aplique pressão enquanto gira suavemente o tubo hematócrito. Isso cortará as membranas conjuntivistas e romperá o plexo ocular.
   3. O sangue fluirá para o tubo hematócrito por ação capilar.
   4. Evite empurrar tão fundo que você atingiu o osso na parte de trás da cavidade ocular.
   5. Uma vez que o sangue começa a fluir, mantenha a pressão para manter o olho salientes.
   6. Para coletar vários tubos de sangue, não é necessário colocar o próximo tubo no plexo ocular, pois o sangue continuará a fluir e pode ser coletado como vem do canthus medial.
   7. Para parar de sangrar, solte a pele e deixe o olho voltar à posição normal. Aplique pressão na órbita para garantir hemostasia.

Figura 1. Retirada de sangue orbital retrô em camundongos.

2. Procedimentos de sangramento na cauda: corte de cauda e corte de cauda

1. Equipamento
   1. Uma lâmina de bisturi estéril, de preferência uma lâmina número 11 ou uma lâmina de barbear de um lado único, é usada para fazer a amputação inicial para o método de corte de cauda. A tesoura não deve ser utilizada porque o corte feito por tesoura é esmagamento, promovendo assim a coagulação e a redução do fluxo sanguíneo. Para o procedimento de corte da cauda, uma lâmina de bisturi número 11 ou 15 é usada para fazer o corte.
   2. Um tubo de contenção que permite o acesso à cauda do mouse é preparado.
   3. Toalhas de papel absorvente ou gaze são usadas como substrato para a realização do corte de cauda.
   4. Também são necessários tubos de coleta ou tubos hematócritos.
   5. O pó esticado deve estar disponível para auxiliar na hemostasia.
2. Restrição
   1. O animal é colocado no tubo de tal forma que a cauda é acessível. Para os contê-inérculos do tipo Broome, o animal é puxado garupa primeiro para dentro do tubo. Para outros tubos, o animal é colocado de cabeça.
   2. Os animais são fixados no tubo de tal forma que não podem se virar ou retirar a cauda.
   3. Alguns camundongos permitirão a coleta de cauda e sangue com mínima contenção manual se eles forem autorizados a pegar uma superfície áspera.
   4. Alguns ratos exigirão anestesia por inalação para este método de coleta de sangue.
3. Retirada de sangue
   1. A cauda é limpa com água morna para remover detritos e causar leve vasodilatação. NÃO use água quente.
   2. Para o corte da cauda, a cauda é estendida, e a extremidade da cauda (0,5-1 mm para ratos e até 2 mm para ratos) é cortada com a lâmina do bisturi.
   3. Para o corte da cauda, a cauda é estendida, e um corte é feito com a lâmina do bisturi aproximadamente 2/3 a distância da garupa, diretamente sobre a veia traseira lateral.
   4. A cauda pode ser acariciada de garupa para ponta para incentivar o fluxo sanguíneo; no entanto, isso diminuirá a qualidade da amostra.
   5. O sangue é coletado da ponta ou corte usando tubos hematócritos ou permitido pingar em um frasco de coleta.

3. Coleta de sangue cardíaco

1. Equipamento
   1. Para um rato, é preferível uma seringa de 3 cc com uma agulha calibre 22-25 x 1". Seringas menores não têm a mesma pressão nas costas e podem dificultar a retirada de sangue. Agulhas menores que 25 medidores restringem o fluxo de sangue, levando ao aumento da coagulação e danos às células sanguíneas. Agulhas menores que 1" podem não atingir o nível do coração quando se aproximam do diafragma.
   2. Para um rato, é preferível uma seringa de 10-12 cc com uma agulha de calibre x 1,5". Dependendo do tamanho do rato, uma seringa menor pode não conter todo o volume sanguíneo a ser coletado, e assim a seringa teria que ser alterada durante o procedimento. Agulhas menores que 20 medidores restringem o fluxo do sangue, levando ao aumento da coagulação. Agulhas menores que 1,5" podem não atingir o nível do coração quando se aproximam do diafragma.
   3. Um tubo de coleta de sangue de tamanho suficiente é usado para manter o sangue coletado.
2. Restrição
   1. A contenção adequada é essencial para o sucesso deste método. O animal é segurado pelo scruff com o corpo pendurado verticalmente. É importante que o corpo seja reto para evitar a deflexão do coração ou uma torção do peito.
   2. Uma posição alternativa é a recumbência dorsal ao colocar a agulha entre as costelas do lado esquerdo do animal. Isso é especialmente útil para ratos muito grandes ou quando vários animais devem ser sangrados.

Figura 2. Retirada de sangue cardíaco com rato mantido verticalmente.

3. Retirada de sangue
   1. A abordagem do aspecto posterior, pontuando o diafragma é mais facilmente realizada quando o rato ou rato é mantido verticalmente pelo scruff.
      1. A agulha é avançada no entalhe apenas à esquerda do xiphoide do animal.
      2. A agulha deve ser paralela à coluna vertebral e colocada logo abaixo das costelas.
      3. O coração está localizado aproximadamente ao nível do cotovelo.
      4. Coloque a agulha, bisbida, no peito, e perfure o coração.
      5. Aplique uma leve pressão nas costas com a seringa. Se a agulha estiver no coração, o sangue fluirá para dentro da seringa.
      6. Espere até que o sangue tenha enchido a seringa antes de adicionar pressão adicional nas costas na seringa.
   2. A abordagem lateral do lado esquerdo do animal requer o posicionamento do animal na recumbência dorsal.
      1. O ponto de entrada é medido contra o ponto do cotovelo na parede do peito. O coração está localizado aproximadamente ao nível do cotovelo.
      2. A agulha é inserida perpendicular ao plano da mesa em um ponto no meio da parede do peito como medido dorsoventrally.
      3. Coloque a agulha, bisbida, no peito, e perfure o coração.
      4. Aplique uma leve pressão nas costas com a seringa. Se a agulha estiver no coração, o sangue fluirá para dentro da seringa.
      5. Espere até que o sangue tenha enchido a seringa antes de adicionar pressão adicional na seringa.

Figura 3. Retirada de sangue cardíaco com rato em posição de recumbência dorsal.

4. Dicas técnicas
   1. O coração normal está situado com o ápice apontando para a esquerda. Em raros casos, o coração pode ser invertido, resultando em dificuldade em perfurar o coração.
   2. A pressão excessiva nas costas na seringa pode colapsar o coração, ocluindo o bisel da agulha e impedindo o fluxo sanguíneo para dentro da seringa.
   3. Aplicar pressão traseira e liberá-la repetidamente iniciará a coagulação na seringa.
   4. Aplicar suavemente pressão no fígado pode forçar o volume sanguíneo adicional para o sistema circulatório, tornando-o disponível para retirada.

4. Retirada posterior de sangue vena cava

4. Equipamento
   1. Uma seringa de tuberculose com uma agulha calibre 25-29 é usada para coleta de sangue no camundongo. Para ratos, é necessária uma seringa de 10-12 cc com uma agulha calibre 22-25 x 1".
   2. Uma plataforma cirúrgica, bandeja de dissecção ou outra superfície para proteger o animal são necessárias, juntamente com laços, fita ou pinos para afixar os membros em posição.
   3. A anestesia injetável ou a anestesia da inalação é necessária. Se usar anestesia de inalação, é desejável que o anestésico seja entregue através de um vaporizador de precisão com um cone de nariz. O comprimento do procedimento é tal que o uso de uma câmara de indução sem entrega adicional de gás anestésico não fornecerá tempo suficiente para completar a retirada de sangue antes que o animal reaviva.
   4. São necessárias tesouras de íris para o rato, ou uma tesoura afiada para o rato, juntamente com pequenas fórceps atraumáticas do polegar e uma esponja de gaze de 2"x 2".
5. Restrição
   1. Quando o animal é totalmente anestesiado, determinado por pinça do dedo do dedo ou beliscão da cauda, o animal é colocado em recumbência dorsal.
   2. Os membros são fixados na plataforma com fita ou pinos. Os membros devem ser estendidos para longe do corpo.
6. Retirada
   1. A pele é levantada e um pequeno corte transverso é feito através da pele logo acima da pelve em fêmeas, ou logo acima do prepuce em machos.
   2. O ponto da tesoura é colocado no corte, e uma incisão midline é feita através da pele da pelve/prepuce para o xifoide.
   3. A pele é refletida lateralmente para cada lado. Dissecção contundente pode ser necessária para soltá-lo do músculo subjacente.
   4. O músculo é levantado, e um pequeno corte transverso é feito através do músculo logo acima do corte da pele.
   5. O ponto da tesoura é colocado no abdômen e uma incisão média é feita através do músculo para o xiphoide. Certifique-se de inclinar o ponto da tesoura para cima para evitar o corte de quaisquer órgãos.
   6. Corte transversalmente ao longo da curva das costelas de cada lado. Tenha cuidado extra para não perfurar o fígado.
   7. Mova suavemente os intestinos para a esquerda do animal para expor a veia cava posterior.
   8. Coloque uma almofada de gaze no fígado, e descanse o índice e o dedo médio no fígado.
   9. Por outro lado, insira a agulha, bivele para cima, na veia cava no meio do caminho entre a junção dos vasos renais e a bifurcação ilícíaca.
   10. Retire lentamente o sangue enquanto aplica pressão no fígado.

Figura 4. Retirada de sangue da veia cava posterior.