Retirada de Sangue II

A coleta de sangue de camundongos e ratos é necessária para uma ampla variedade de estudos científicos, e os pesquisadores desenvolveram diferentes métodos para atingir objetivos experimentais específicos.

Na primeira parte, discutimos a consideração geral da retirada de sangue e revisamos o sangramento ocular retroorbital, cortes e cortes na cauda, bem como os métodos de coleta de sangue intracardíaco. Aqui, descreveremos os procedimentos para coleta de sangue das veias facial, submandibular, safena e femoral. Esses métodos são menos invasivos e não requerem anestesia, o que os torna métodos de escolha quando o uso de anestésicos pode confundir os resultados sanguíneos ou outros dados.

Vamos começar com o procedimento para obter uma amostra de sangue de uma veia facial murina. No mouse, há uma veia facial de fácil acesso que atravessa a bochecha. Comece escolhendo o equipamento adequado para o procedimento. Basicamente, você precisa de um pequeno tubo de centrífuga para coleta de sangue e uma lanceta, que está disponível em diferentes tamanhos. A seleção da lanceta correta depende da idade, sexo e peso corporal do animal e tamanho da amostra a ser coletada. Consulte o protocolo de texto para obter detalhes sobre a seleção de lancetas.

Comece o procedimento restringindo o animal usando a técnica de scruffing. A contenção adequada minimiza o movimento lateral da cabeça e ajuda a garantir uma punção venosa precisa e segura com a lanceta. Se o aperto estiver muito apertado, o fluxo sanguíneo pode ser restrito, resultando em um volume reduzido coletado. Uma vez que o animal esteja contido, localize a área aproximada da veia facial medindo o comprimento do olho abaixo do canto lateral e a largura do olho caudalmente. Com a ponta da lanceta, sinta suavemente o ponto em que o maxilar termina. Para melhor precisão na perfuração do recipiente, você pode posicionar o mouse de lado.

Agora, no local de inserção, segure a lanceta perpendicularmente à superfície da pele com a ponta voltada ligeiramente para o nariz. Isso é crítico, porque se a ponta da lanceta for direcionada caudalmente, o canal auditivo será perfurado, causando sangramento da orelha. Para perfurar a veia, aplique um empurrão firme e perfure a pele até o ombro da lanceta. Após a remoção, o sangue começará a fluir. Para auxiliar o fluxo, posicione o animal com a cabeça mais baixa que o coração. Para parar o sangramento, seque o local da punção para obter hemostasia e evitar perda excessiva de sangue. Por fim, libere a pressão sobre a nuca e retorne o animal à gaiola. Observe que os volumes de coleta variam, mas é imperativo NÃO exceder o volume máximo para coleta de sangue de sobrevivência. Consulte o protocolo de texto do vídeo Blood Withdrawal One para obter detalhes sobre o volume máximo recomendado de coleta. As amostras seriadas podem ser colhidas alternando o lado utilizado. Nenhum dos lados deve ser usado com mais frequência do que a cada 5-7 dias.

Agora vamos revisar o método de sangramento da veia submandibular. Embora seja muito semelhante à técnica para o sangramento das veias faciais, existem variações no equipamento e diferenças sutis no procedimento de sangramento.

A veia submandibular corre ao longo da mandíbula inferior do camundongo e converge com a veia facial para a veia jugular. Em vez de uma lanceta, esse método é realizado com agulhas. Mas, semelhante às lancetas, a seleção do calibre da agulha depende da idade, sexo e peso do animal e tamanho da amostra - consulte o protocolo de texto para obter detalhes.

Para começar, limpe o animal da mesma maneira que para o sangramento da veia facial, para que haja um movimento mínimo de um lado para o outro da cabeça. Recall - aperto excessivamente apertado pode diminuir o volume de coleta de sangue. Enquanto prende o mouse, imagine uma linha do canto da boca através do rosto e uma linha do canto lateral do olho. O ponto de intersecção dessas linhas é a área aproximada da veia submandibular. Isso coincide com uma pequena covinha sem pêlos encontrada caudal ao canto da boca e ligeiramente abaixo da linha da mandíbula.

Para uma melhor precisão, colocar o animal em decúbito lateral (3.6.1). Em seguida, segure a agulha perpendicularmente à superfície da pele e insira-a com um empurrão firme. NÃO insira a agulha além da ponta chanfrada, pois a profundidade de inserção maior que isso pode resultar em trauma nos músculos, nervos e outros vasos que estão na cabeça, pescoço e cavidade oral. Após a remoção da agulha, o sangue começará a fluir. Como para sangramento de veias faciais, posicione o mouse com a cabeça mais baixa que o coração para ajudar no fluxo sanguíneo. Finalmente, seque o local da punção para obter hemostasia e libere a pressão na nuca para retornar o animal à sua gaiola.

Agora, vamos aprender como coletar sangue da veia safena. Esta veia é um vaso superficial que corre dorsalmente e depois lateralmente através da articulação do tarso.

O equipamento necessário para este procedimento inclui um dispositivo de contenção, que pode ser um dispositivo de plástico flexível para ratos ou, para camundongos, um tubo cônico de plástico modificado de 50 mililitros pode ser usado. Observe que a extremidade do tubo é cortada para permitir um orifício de respiração, e uma ranhura de meia polegada de largura e 2 polegadas de comprimento é cortada da extremidade da tampa. As bordas são cobertas com fita adesiva para a segurança do animal. Este procedimento também requer um torniquete - fabricado com uma seringa de 3 cc e um comprimento de sutura não absorvível 0-2, pomada antibiótica tripla com um cotonete - para ser usado como uma barreira à prova de umidade entre a pele e a gota de sangue, um aparador de cabelo, uma agulha de calibre 22 para punção venosa e tubo de hematócrito para coleta de sangue.

Para conter um rato, coloque-o no tubo, nariz primeiro. Em seguida, guie suavemente a perna traseira na ranhura e estabilize-a usando o dedo indicador e o polegar. Posteriormente, raspe o cabelo da face lateral da perna, do jarrete ao joelho. Em seguida, espalhe uma camada muito fina da pomada antibiótica tripla na área sem pelos. Em seguida, aplique o torniquete o mais longe possível e aperte-o. O vaso safeno que atravessa a superfície externa do joelho ao tornozelo começará a se encher e se tornará elevado e fácil de visualizar.

Em seguida, segure uma agulha de calibre 22 diretamente sobre o vaso sanguíneo e perpendicular à superfície da pele. E perfure o vaso, tomando cuidado para não inserir a agulha muito profundamente e perfurar músculos ou ossos. O sangue se acumulará na superfície da perna para ser coletado em um tubo de hematócrito. Uma vez que o sangue tenha sido coletado, afrouxe o torniquete e aplique pressão sobre a punção para hemostasia. Depois que o sangramento parar, remova o animal da contenção e devolva-o à gaiola. Os volumes coletados com este método estão entre 10 e 150 ? L, dependendo da frequência da amostragem. E a qualidade da amostra é variável, pois pode conter produtos de tissue. Não devem ser colhidas mais de 4 amostras de sangue num período de 24 horas da mesma perna.

Por fim, aprenderemos como recolher sangue da veia femoral, que é outra opção para a colheita de sangue num rato. A veia femoral corre na face medial da perna traseira, da virilha até a articulação do joelho, antes de cruzar o joelho e se tornar a veia safena lateral, tornando-a facilmente acessível.

A vantagem do sangramento da veia femoral é que um volume maior é mais facilmente coletado do que da veia safena. A desvantagem é que esse procedimento, em um animal consciente, requer duas pessoas. Os equipamentos necessários para este procedimento são semelhantes ao método da veia safena, exceto que não requer o torniquete, e o dispositivo de contenção preferível é um cone flexível. Para selecionar o cone correto, meça-o em relação ao comprimento do corpo do animal e, em seguida, faça um corte oval na altura da coxa.

Para conter o animal, coloque-o no tubo, nariz primeiro. Em seguida, dobre a ponta do cone e feche-o usando um pequeno clipe de fichário para evitar que o animal saia. Agora puxe a perna traseira pela abertura oval para obter acesso à veia femoral. Não segure com muita força, pois isso pode exacerbar a formação de hematoma. Em seguida, raspe a superfície interna da perna, da virilha ao joelho, e aplique uma fina camada de pomada antibiótica tripla na área sem pelos. Posteriormente, a pessoa de contenção deve ocluir a veia femoral e agarrar o rato com a superfície interna da perna voltada para a pessoa que vai tirar sangue. Segurando a agulha de calibre 22 perpendicular ao vaso sanguíneo, perfure diretamente a veia e colete o sangue em tubos de hematócrito à medida que ele se espalha na superfície da pele. A punção deve estar o mais próximo possível do joelho para permitir futuras amostragens anteriores a este local. Além disso, certifique-se de que a profundidade da punção não seja maior do que o comprimento do chanfro da agulha. Para auxiliar o fluxo sanguíneo, posicione o rato com a perna mais baixa que o coração. Por fim, libere a pressão na perna e aplique pressão no local da punção para obter hemostasia e evitar perda excessiva de sangue. Observe que uma quantidade significativamente maior de sangue pode ser coletada usando este procedimento.

Depois de discutir os fundamentos das técnicas de coleta de sangue, vamos revisar alguns exemplos de por que esses procedimentos podem ser úteis para pesquisas científicas

O sangue é frequentemente analisado para confirmar a resposta imune durante o desenvolvimento da vacina. Aqui, os pesquisadores entregaram uma vacina peptídica a animais que sofrem de câncer de bexiga. Em seguida, eles coletaram sangue pela veia submandibular e separaram o soro para detectar os níveis de diferentes citocinas, que servem como indicadores da eficácia da vacina.

A coleta de sangue também é comumente realizada para testar a eficácia de um tratamento, estudando biomarcadores da doença humana, como os níveis de glicose no diabetes. Esses pesquisadores estavam interessados em testar a eficácia de uma nova terapia genética administrada através da veia da cauda em animais diabéticos. Após a injeção, esses pesquisadores coletaram sangue da veia safena em vários momentos para analisar o efeito de diferentes protocolos de tratamento no nível de glicose no sangue.

Por fim, para alguns experimentos, é importante conhecer o estado básico do animal, como níveis de inflamação ou estresse. Neste exemplo, o plasma sanguíneo foi coletado de um rato antes e depois de um evento estressante. E como você pode ver, o nível de corticosterona, ou hormônio do estresse, é maior em animais dez minutos após o evento estressante.

Você acabou de assistir à segunda parte da JoVE sobre técnicas de retirada de sangue para camundongos e ratos. Depois de assistir a esses dois vídeos, você deve ter uma melhor compreensão das considerações e procedimentos para coleta de sangue desses animais e como eles estão sendo usados na pesquisa biomédica hoje. Como sempre, obrigado por assistir!