Name: Preparação de uma única célula Suspensões de Spleen rato com o Dissociator gentleMACS (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Aprenda a dissociar baços de camundongo usando o gentleMACS Dissociator para obter suspensões de células viáveis. Este método automatizado simplifica a preparação de amostras para análises de imunologia e biologia celular.

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Introdução ao Equipamento <ol><li> Tecido é cuidadosamente dissociada, utilizando tubos de violeta C em uma única célula viável suspensões. </li><li> O PBS / BSA-tampão de EDTA é utilizado para dissociar as células. O buffer é preparada por adição de 1 parte de solução de BSA estoque para 20 partes de autoMACS lavagem solução contendo EDTA. </li><li> O MACS pré-separação Filtros são usados ​​para que as amostras de tecido dissociado estão livres de todos os aglomerados de células, promovendo a separação MACS sucesso e posterior análise. </li></ol> Dissociar as células do baço <ol><li> Baços todo são disscociated em uma única célula suspensões de esplenócitos usando o Dissociator gentleMACS. </li><li> Para iniciar o procedimento, coloque o tubo C com um volume de tampão de acordo com a massa do baço. Um baço saudável de um jovem adulto camundongo BALB / c fêmeas pesa cerca de 80-120 mg. Cada 1 a 2 baços dessa massa necessitam de 3 mL de tampão. Baços de animais mais velhos ou animais com infecções são muitas vezes maiores e devem ser pesados ​​em buffer. Os volumes de buffer deve ser adaptado em conformidade. Não exceder o volume total do buffer de 10 mL. </li><li> Adicione o baço dissecados para o tubo C contendo 3 ml de tampão. </li><li> Certifique-se de que a tampa do tubo C é apertado e conecte o tubo C ao dissociator com a tampa para baixo. </li><li> Ligue o dissociator. Por 1-2 baços, selecione m_spleen_01 programa. O programa terá 56 segundo para ser concluído. Se o número de baços é maior, usar o programa m_spleen_04; este programa pode ser usado para até 720 mg de tecido esplênico. </li><li> Após a conclusão do programa, o tecido do baço nativa é dissociada em uma suspensão esplenócitos. </li><li> Girar a suspensão de células inteiras em 300xg em temperatura ambiente por cerca de 30 seg. Isso irá garantir que o rotor eo estator são libertados de todas as células que são coletados na parte inferior do tubo C. </li><li> Retirar a amostra através do septo, selada abertura da tampa do tubo C usando uma pipeta 1000 microlitro. </li></ol> Etapa de filtração <ol><li> Para começar a etapa de filtração, aplicar o tecido dissociado para o Filtro de pré-separação ou um filtro de células com 30 mM tamanho dos poros. O filtro deve caber um tubo de 15 mL por 1-2 baços ou um tubo de 50 mL por mais de 2 baços. </li><li> Deixe a suspensão de células passar. Em seguida, lave o filtro através da aplicação de 5 mL de tampão. </li><li> Agora, centrifugar o tubo com a suspensão de células em 300xg, em temperatura ambiente por 10 minutos para coletar todos os esplenócitos em um baço pellet celular. </li><li> Agora, que temos uma pelota de esplenócitos dissociados, devemos aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em uma quantidade adequada de buffer. </li></ol> Dissociação baço usando o Dissociator gentleMACS renderá uma elevada percentagem de esplenócitos viável, o que é demonstrado por citometria de fluxo usando o Analisador MACSQuant. Células mortas estão manchadas pelo iodeto de propídio. No exemplo fornecido, o atacante lado gráfico de pontos de dispersão mostra o esplenócitos preparado.

Todos os protocolos e fichas de dados estão disponíveis em<a href="http://www.miltenyibiotec.com"&gt; Http://www.miltenyibiotec.com.</a&gt;.

Para evitar dissociações manuais entediantes e muitas vezes doloroso, o Dissociator gentleMACS permite dissociar o tecido de forma muito eficiente sob condições controladas e reproduzíveis. O tecido procedimento de dissociação é suave para as células e suspensões colheitas de células com uma taxa alta viabilidade. O Dissociator gentleMACS em combinação com C Tubes é projetado para a preparação de uma única célula suspensões de vários tecidos. O instrumento é equipado com uma série de programas pré-definidos para dissociar baço mouse, fígado, pulmão, ou tecido neural. A gama de programas e protocolos será continuamente ampliado para incluir outros tecidos.

<table><tbody><tr><td>Kit Inicial gentleMACS&amp;#8482;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tubos C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tubos de 13 mL</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-596</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Solução de Lavagem autoMACS&amp;#8482;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Solução Estoque de BSA MACS&amp;#174;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Filtros Pré-Separação</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Analisador MACSQuant</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-197</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Iodeto de Propídio</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

preparação de uma única célula suspensões de spleen rato com o dissociator gentlemacs

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

De uma única célula suspensões são um pré-requisito para experimentos na separação de células, a análise de células e cultura de células. Para evitar dissociações manual tedioso e doloroso o Dissociator gentleMACS permite dissociar o tecido de forma muito eficiente sob condições controladas e reproduzíveis. O Dissociator gentleMACS pode perfeitamente dissociar baço mouse, combinando economia de tempo e padronização com segurança do usuário. Este vídeo descreve como dissociar baços mouse usando o Dissociator gentleMACS, um dispositivo de bancada automatizado que pode atrapalhar mecanicamente tecidos utilizando tubos especiais para produzir suspensões de células viáveis. Após a dissociação, baços são filtradas, centrifugadas e ressuspendidas para outras aplicações.

Este vídeo descreve uma técnica simples e que economiza tempo para a dissociação de tecidos automatizado utilizando o Dissociator gentleMACS para preparar uma única célula suspensões de esplenócitos mouse.

Preparação de uma única célula Suspensões de Spleen rato com o Dissociator gentleMACS

Suspensões de células únicas são um pré-requisito para experimentos de separação, análise e cultura celular. Para evitar a tedious e frequentemente dolorosa manipulação manual...

Neste protocolo em vídeo, você verá como dissociar baços de camundongos usando o Gentle Max, um dispositivo automático de bancada que pode romper mecanicamente tecidos utilizando tubos especiais para produzir suspensões celulares viáveis. Após a dissociação, os baços são filtrados com filtros de separação Max Pres, centrifugados e suspensos para aplicações posteriores. Olá, meu nome é Melanie Mlu.Sou cientista na Milton Biotech aqui no BE Lab Park, Alemanha. Hoje vou mostrar a vocês o preparo de uma suspensão de células isoladas a partir do baço de camundongo utilizando a dissociação GenX. A dissociação GenX permite o preparo muito fácil e rápido de uma suspensão de células isoladas.Então vamos começar. Para evitar dissociações manuais tediosas e muitas vezes dolorosas, o dissociador gentle max di permite dissociar tecidos de forma muito eficiente sob condições controladas e reprodutíveis. O tecido é dissociado suavemente utilizando tubos violet C, obtendo-se suspensões viáveis de células isoladas.O tubo C possui uma abertura selada com septo no centro da tampa, permitindo a pipetagem diretamente do tubo mantendo sempre a esterilidade. Para suspender as células dissociadas, você precisará usar o tampão adequado de P-B-S-B-S-A-E-D-T-A. O tampão é preparado adicionando uma parte da solução estoque de BSA a 20 partes da solução de AutoMax contendo EDTA.Usando os filtros de separação Max Pres, amostras de tecido são livradas de todos os agregados celulares, promovendo uma separação máxima bem-sucedida e a subsequente análise. Para iniciar o procedimento, carregamos o tubo C com um volume de tampão. De acordo com a massa dos baços, um baço saudável de um camundongo fêmea de biópsia com seis a sete semanas de idade pesa cerca de 80 a 120 miligramas.A cada um ou dois baços dessa massa são necessários três mililitros de tampão. Não exceda um volume total de 10 mililitros. Agora podemos adicionar nosso baço dissecado ao tubo C contendo três mililitros de tampão. Baços de animais mais velhos ou de animais com infecções são frequentemente maiores e devem ser pesados em tampão.Os volumes dos tamp&otilde;es devem ent&atilde;o ser ajustados proporcionalmente, mas novamente n&atilde;o devem exceder um volume total de 10 mililitros. Agora, certifique-se de que a tampa do tubo C est&aacute; bem fechada e conecte o tubo C ao dissociador. Com a tampa voltada para baixo, ligue o dissociador para um ou dois ba&ccedil;os e selecione o Programa M ba&ccedil;o oh um. O programa levar&aacute; 56 segundos para ser conclu&iacute;do; se o n&uacute;mero de ba&ccedil;os for maior, utilize o Programa M ba&ccedil;o oh quatro.Este programa pode ser usado para até 720 miligramas de tecido esplênico. Após a conclusão do programa, o tecido esplênico nativo é dissociado em uma suspensão de células PLE, que tem esta aparência; centrifugue brevemente para recolher a amostra no fundo do tubo. Isso garantirá que o rotor e o estator fiquem livres de todas as células, que são recolhidas no fundo do tubo C.Retiramos a amostra através da abertura selada com septo na tampa do tubo C utilizando uma pipeta de mil microlitros. Para iniciar a etapa de filtração, aplicamos o tecido dissociado no filtro de pré-separação ou numa peneira com poros de 30 mícrons. A peneira deve se encaixar num tubo de 15 mililitros para um ou dois baços, ou num tubo de 50 mililitros para mais de dois baços.Deixe a suspensão celular passar pelo filtro e, em seguida, lave o filtro aplicando cinco mililitros de tampão. Agora, centrifugue o tubo com a suspensão celular a 300 Gs, em temperatura ambiente, por 10 minutos para recolher todos os cítos em um pellet de células esplênicas. Agora que temos um pellet de cítos dissociados, devemos aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em uma quantidade apropriada de tampão para dissociação esplênica.O uso do gentle max produzirá uma alta porcentagem de citoes PLE viáveis, o que é demonstrado por citometria de fluxo utilizando o max quant. As células mortas são coradas com iodeto de propídio e o exemplo fornecido. O gráfico de dispersão lateral e direta mostra citoes SP preparados. Ok.Mostrei a você como dissociar o tecido esplênico utilizando essa dissociação suave X. Quando realizar este procedimento, é importante ajustar a quantidade de tampão ao tamanho da amostra e escolher o programa Gentle X adequado. Ok, é isso.Boa sorte com seu experimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descrevemos a preparação de fator de crescimento de células T utilizado para a expansão in vitro de antígeno-específica de linfócitos T linhas rato.

Preparando-se Fator de Crescimento de Células T esplenócitos Rat

Dissociar as células de tipos de tecido específico requer parâmetros específicos para a agitação do tecido para obter um volume elevado de viáveis, as células cultiváveis. A Miltenyi gentleMACS dissociator otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. Nesta publicação o uso deste aparelho no tecido pulmonar é explicado.

Preparação padronizado de uma única célula Suspensões do tecido pulmonar do rato usando o Dissociator gentleMACS

Dissociar as células de tipos de tecido específico requer parâmetros específicos para aggitation tecido para obter um volume elevado de viáveis, as células cultiváveis. A Miltenyi gentleMACS Dissociator otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. Nesta publicação o uso deste aparelho no tecido nerual é explicado.

Geração de Single-Cell Tissue Suspensões de rato Neural

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Um método para o tratamento com alto teor de sal de células dendríticas e sua transferência adotiva para camundongos

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Preparando uma suspensão unicelular de células imunes a partir de tecido cerebral murino

A citometria de fluxo pode ser utilizado para avaliar o estado da cromatina nas células T. Este protocolo permite que os cientistas interpretar evidência de descondensação da cromatina durante a activação das células T demonstrou por um aumento na intensidade de fluorescência média (IFM) de anticorpos fluorescentes Histona H3...

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Aqui, apresentamos um protocolo para isolar as células dendríticas de murino baços célula magnética classificando e subsequente transferência adotiva em ratos ingênuos. O modelo de células dendríticas ativadas de elevado-sal foi escolhido para explicar os procedimentos passo a passo de transferência adotiva e citometria de fluxo.

Isolamento e transferência adotiva de sal alta trataram apresentadoras de células dendríticas

Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

Aqui apresentamos um método simples e eficiente para isolar células germinativas vivas e pós-meiotic de testículos de camundongos adultos. Usando uma baixa citotoxicidade, corante de DNA com proteção violeta e classificação celular ativada por fluorescência, pode-se isolar populações de células espermatogênicas altamente enriquecidas para muitas aplicações a jusante.

Isolamento de células spermatogênicas murinas usando um corante de ligação de DNA permeável celular-permeável violeta

Este artigo descreve um protocolo para agregação e encapsulamento de células do baço dentro de uma matriz de membrana basal semissólida. Construções de matriz de membrana basal podem ser usadas em cultura tridimensional para estudar o desenvolvimento de organoides, ou para estudos de transplante in vivo e regeneração tecidual.

Agregação celular encapsulada da matriz da membrana basal para investigação da formação do tecido do baço murino

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar exossomos derivados do baço de camundongo usando uma combinação de digestão com colagenase tipo I e ultracentrifugação.

Isolamento e caracterização de exossomos derivados de tecidos de baço de camundongo

Aprenda a dissociar baços de camundongo usando o gentleMACS Dissociator para obter suspensões de células viáveis. Este método automatizado simplifica a preparação de amostras para análises de imunologia e biologia celular.

Preparação de uma única célula Suspensões de Spleen rato com o Dissociator gentleMACS

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