Preparação de uma única célula Suspensões de Spleen rato com o Dissociator gentleMACS
11 de dezembro de 2008
Este vídeo descreve uma técnica simples e que economiza tempo para a dissociação de tecidos automatizado utilizando o Dissociator gentleMACS para preparar uma única célula suspensões de esplenócitos mouse.
Neste protocolo em vídeo, você verá como dissociar baços de camundongos usando o Gentle Max, um dispositivo automático de bancada que pode romper mecanicamente tecidos utilizando tubos especiais para produzir suspensões celulares viáveis. Após a dissociação, os baços são filtrados com filtros de separação Max Pres, centrifugados e suspensos para aplicações posteriores. Olá, meu nome é Melanie Mlu.
Sou cientista na Milton Biotech aqui no BE Lab Park, Alemanha. Hoje vou mostrar a vocês o preparo de uma suspensão de células isoladas a partir do baço de camundongo utilizando a dissociação GenX. A dissociação GenX permite o preparo muito fácil e rápido de uma suspensão de células isoladas.
Então vamos começar. Para evitar dissociações manuais tediosas e muitas vezes dolorosas, o dissociador gentle max di permite dissociar tecidos de forma muito eficiente sob condições controladas e reprodutíveis. O tecido é dissociado suavemente utilizando tubos violet C, obtendo-se suspensões viáveis de células isoladas.
O tubo C possui uma abertura selada com septo no centro da tampa, permitindo a pipetagem diretamente do tubo mantendo sempre a esterilidade. Para suspender as células dissociadas, você precisará usar o tampão adequado de P-B-S-B-S-A-E-D-T-A. O tampão é preparado adicionando uma parte da solução estoque de BSA a 20 partes da solução de AutoMax contendo EDTA.
Usando os filtros de separação Max Pres, amostras de tecido são livradas de todos os agregados celulares, promovendo uma separação máxima bem-sucedida e a subsequente análise. Para iniciar o procedimento, carregamos o tubo C com um volume de tampão. De acordo com a massa dos baços, um baço saudável de um camundongo fêmea de biópsia com seis a sete semanas de idade pesa cerca de 80 a 120 miligramas.
A cada um ou dois baços dessa massa são necessários três mililitros de tampão. Não exceda um volume total de 10 mililitros. Agora podemos adicionar nosso baço dissecado ao tubo C contendo três mililitros de tampão. Baços de animais mais velhos ou de animais com infecções são frequentemente maiores e devem ser pesados em tampão.
Os volumes dos tampões devem então ser ajustados proporcionalmente, mas novamente não devem exceder um volume total de 10 mililitros. Agora, certifique-se de que a tampa do tubo C está bem fechada e conecte o tubo C ao dissociador. Com a tampa voltada para baixo, ligue o dissociador para um ou dois baços e selecione o Programa M baço oh um. O programa levará 56 segundos para ser concluído; se o número de baços for maior, utilize o Programa M baço oh quatro.
Este programa pode ser usado para até 720 miligramas de tecido esplênico. Após a conclusão do programa, o tecido esplênico nativo é dissociado em uma suspensão de células PLE, que tem esta aparência; centrifugue brevemente para recolher a amostra no fundo do tubo. Isso garantirá que o rotor e o estator fiquem livres de todas as células, que são recolhidas no fundo do tubo C.
Retiramos a amostra através da abertura selada com septo na tampa do tubo C utilizando uma pipeta de mil microlitros. Para iniciar a etapa de filtração, aplicamos o tecido dissociado no filtro de pré-separação ou numa peneira com poros de 30 mícrons. A peneira deve se encaixar num tubo de 15 mililitros para um ou dois baços, ou num tubo de 50 mililitros para mais de dois baços.
Deixe a suspensão celular passar pelo filtro e, em seguida, lave o filtro aplicando cinco mililitros de tampão. Agora, centrifugue o tubo com a suspensão celular a 300 Gs, em temperatura ambiente, por 10 minutos para recolher todos os cítos em um pellet de células esplênicas. Agora que temos um pellet de cítos dissociados, devemos aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em uma quantidade apropriada de tampão para dissociação esplênica.
O uso do gentle max produzirá uma alta porcentagem de citoes PLE viáveis, o que é demonstrado por citometria de fluxo utilizando o max quant. As células mortas são coradas com iodeto de propídio e o exemplo fornecido. O gráfico de dispersão lateral e direta mostra citoes SP preparados. Ok.
Mostrei a você como dissociar o tecido esplênico utilizando essa dissociação suave X. Quando realizar este procedimento, é importante ajustar a quantidade de tampão ao tamanho da amostra e escolher o programa Gentle X adequado. Ok, é isso.
Boa sorte com seu experimento.
Visão Geral
Este protocolo em vídeo demonstra uma técnica eficiente para dissociação automatizada de tecidos de baços de camundongo utilizando o Dissociador gentleMACS. O método produz suspensões de células únicas viáveis adequadas para aplicações posteriores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Imunologia
Antecedentes
- A dissociação tecidual é essencial para obter suspensões de células isoladas.
- A dissociação manual pode ser tediosa e ineficiente.
- O Dissociador gentleMACS fornece um método reprodutível e controlado.
- Suspensões celulares viáveis são fundamentais para aplicações posteriores.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar uma técnica que economiza tempo para dissociação de tecidos.
- Preparar suspensões de células isoladas a partir de baços de camundongos.
- Ampliar a eficiência do preparo de células para pesquisa.
Métodos Utilizados
- Uso do Dissociador gentleMACS com tubos especializados.
- Preparação da solução tampão para suspensão do tecido.
- Filtração do tecido dissociado utilizando filtros de separação Max Pres.
- Centrifugação para coletar pellets de células viáveis.
Resultados Principais
- Dissociação eficiente de baços de camundongos em suspensões de células únicas.
- Alta porcentagem de células viáveis demonstrada por citometria de fluxo.
- Remoção bem-sucedida de agregados celulares para análise precisa.
- Reprodutibilidade dos resultados em diferentes tamanhos de amostra.
Conclusões
- O Dissociador gentleMACS simplifica significativamente a dissociação de tecidos.
- A preparação adequada do tampão é essencial para resultados bem-sucedidos.
- Este método pode ser aplicado a diversos tipos de tecidos para análise celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A preparação automatizada de suspensões de células únicas a partir do baço de camundongo utilizando o Dissociador gentleMACS resolve um gargalo crítico nos fluxos de trabalho iniciais de descoberta e imunologia. A dissociação padronizada e reprodutível permite separação, análise e cultivo celular confiáveis em etapas subsequentes, reforçando a confiabilidade na validação de alvos e triagem. Essa capacidade reduz a variabilidade manual e acelera a transição de tecido para dados acionáveis de células únicas em diversos portfólios de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a geração rápida de suspensões viáveis de células isoladas para imunofenotipagem e ensaios funcionais.
- Apoia a desmistificação biológica ao fornecer material de entrada consistente para investigação de vias e alvos.
- Facilita a preparação reprodutível de amostras, reduzindo variáveis confundidoras em estudos de validação de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece suspensões celulares padronizadas para o desenvolvimento de ensaios e plataformas de triagem de alto rendimento.
- Melhora a reprodutibilidade dos ensaios ao minimizar a variabilidade da dissociação manual.
- Prepara amostras compatíveis com citometria de fluxo e separação celular, permitindo saídas quantitativas robustas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Fornece suspensões celulares com alta viabilidade para estudos translacionais de biomarcadores e caracterização imunológica pré-clínica.
- Garante continuidade desde a coleta do tecido até as análises funcionais e fenotípicas subsequentes.
- Reduz o risco de perda ou degradação da amostra, apoiando decisões pré-clínicas confiáveis.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se na interface entre coleta de tecidos e ensaios celulares subsequentes, conectando fluxos de trabalho de descoberta inicial, triagem e pesquisa translacional.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses e estudos mecanicistas ao fornecer entradas de alta qualidade de células individuais.
- Triagem: Fornece suspensões celulares reprodutíveis e escalonáveis prontas para ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Permite avaliação quantitativa da viabilidade e do fenótipo por citometria de fluxo e leituras relacionadas.
- Pesquisa Translacional: Atende às necessidades de perfilagem de biomarcadores e células imunes em modelos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma padronizada e automatizável de dissociação adaptável a diferentes tipos de tecidos e estudos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos baseados em células.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade, padronização e produtividade no preparo de amostras.
- Valor Estratégico: Acelera decisões de prosseguimento ou interrupção e reduz o desperdício de recursos devido a preparações falhas ou inconsistentes.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao garantir material de entrada confiável para múltiplos programas.
Considerações sobre a Implementação
- Exige familiaridade com protocolos automatizados de dissociação de tecidos e preparação de tampões.
- Requer acesso ao Dissociador gentleMACS, tubos C e equipamentos compatíveis de filtração e centrifugação.
- Exige padronização entre equipes quanto à quantidade de amostra e volumes de tampão para garantir reprodutibilidade.
- Adaptável a diferentes tamanhos de baço e potencialmente a outros tipos de tecidos, com ajustes no protocolo.
- O volume de tampão e a seleção do programa devem ser ajustados à massa da amostra para assegurar dissociação ideal.
