Métodos única molécula para acompanhar as alterações nas propriedades elásticas bicamada

Olá, sou a Dra. Ola Anderson do Departamento de Fisiologia e Biofísica do Weill Cornell Medical College na cidade de Nova York. Meu nome é Olson. Sou estudante de biomedicina computacional no laboratório de Olive Anderson.

E eu sou Shail Collingwood, técnica de pesquisa também do laboratório Anderson. Hoje vamos mostrar como formar uma bicamada, uma bicamada lipídica, como isolar uma pequena membrana utilizando o eletrodo Biolayer Punch, como registrar a atividade de canais individuais e como analisar os resultados, utilizando assim canais Gramin como sondas das propriedades da bicamada lipídica. Em um vídeo anterior, mostramos como se preparar para esses experimentos.

Mostramos a você como preparar a câmara que utilizamos e como preparar o eletrodo de perfuração de bicamada que usamos para isolar a fina camada de membrana na qual registramos a atividade do canal. Vamos, então, perfurar algumas bicamadas. Para começar a montagem dos experimentos de bicamada, adicione 2,5 mililitros da solução eletrolítica equilibrada em temperatura a cada compartimento da câmara previamente pintada. A solução que geralmente utilizamos é cloreto de sódio 1 molar mais 10 milimolar.

He piece tamponado a pH sete, ajuste o microscópio e a fonte de luz para que o orifício no teflon fique centralizado no seu campo de visão e iluminado intensamente. Insira a micropipeta de vidro em um porta-microeletrodo. Conecte uma seringa ao porta com um pedaço de tubo de tigon.

Encha a pipeta no suporte do eletrodo por sucção. Tenha cuidado para evitar bolhas, pois elas podem interromper a conexão elétrica entre o pellet de prata no suporte do eletrodo e a ponta da pipeta. Aplique uma pequena quantidade de vaselina na rosca, em seguida coloque-a no suporte de microeletrodo.

A vaselina ajuda a criar um selo hermético. Conecte o porta-eletrodo ao estágio de cabeça do clamp de patch dentro da gaiola de Faraday. Posicione a ponta da micropipeta centralizada e logo atrás do orifício na divisória de teflon.

Coloque o eletrodo de prata enrolado na câmara frontal. Fixe-o no lugar com massa de modelar e conecte-o ao circuito de comando de tensão. Por fim, equilibre os eletrodos.

Isso é crítico porque os dois eletrodos, o da frente e o no porta-eletrodo micro, podem ter potenciais de meia-célula ligeiramente diferentes. O potencial de meia-célula é a diferença entre o metal de prata do eletrodo e a solução eletrolítica adjacente ao revestimento de cloreto de prata. Equilibre os eletrodos ajustando o deslocamento manual de modo que a corrente que flui entre os dois compartimentos varie entre menos 200 e mais 200 picoampères no patch clamp.

O potencial de deslocamento mudará com o tempo, portanto você equilibra os eletrodos em intervalos regulares durante todo o experimento para formar a membrana de bicamada lipídica. Limpe uma pipeta de vidro polida ao fogo com solução fch conforme descrito no vídeo anexo. Mergulhe a pipeta limpa na solução lipídica e deixe-a subir cerca de um milímetro para dentro da pipeta.

Coloque a ponta da pipeta logo à frente do orifício na divisória de teflon e delicadamente forme uma bolha da solução lipídica sobre o orifício. Quando bem-sucedido, forma-se uma bolha lipídica brilhante atravessando o orifício, com uma forma de tórus ou de rosca, ligando-a à divisória de teflon. Deixe a membrana afinar, o que pode ser facilitado pela aplicação de um potencial de 100 a 200 milivolts através da membrana.

Coloque a ponta da micropipeta de vidro no Taurus e deixe repousar por alguns minutos para garantir um melhor selamento entre a pipeta e a bicamada. Neste momento, você está pronto para isolar um remendo de membrana utilizando uma micropipeta de vidro. Agora, dope a membrana com gramin.

Essa solução de gramin foi preparada a partir de um estoque de um micromolar que foi diluído para um a 10 nanomolares. Em óxido de sulfeto de dimetila, geralmente de um a 10 microlitros da diluição são adicionados a cada lado da membrana, de modo que a concentração final esteja na faixa de picomolar. Utilize as barras magnéticas de agitação para agitar a solução por cerca de dois minutos e aguarde mais 10 minutos antes de formar uma nova membrana pequena para registrar a atividade de canal individual.

Este tempo de peso permite que a gramicidina seja incorporada na membrana. Verifique a atividade do canal aplicando uma tensão. Geralmente, desejamos cerca de um evento de canal por segundo.

Os canais são visíveis como mudanças discretas para cima e para baixo na corrente da membrana. Agora você está pronto para iniciar o experimento real. Primeiro, registre os traços da corrente controle.

Equilibre o eletrodo conforme demonstrado anteriormente, forme uma pequena membrana ou selo conforme descrito no vídeo complementar. Aplique 200 milivolts positivos e registre a atividade de canal único. Você deve coletar de 100 a 200 transições de corrente de canal único.

Repita este passo com menos 200 milivolts. Rompa o selamento expelindo o eletrólito através da ponta da pipeta. Usando o parafuso de náilon, reequilibre os eletrodos, retire a pipeta para a câmara traseira, remova o excesso de lipídio e forme um novo selamento.

Você também pode repetir esses passos para obter gravações em outros potenciais. Agora você está pronto para registrar os traços de corrente experimentais no modificador da bicamada. Neste caso, o antidepressivo fluoxetina é adicionado a ambos os lados da membrana.

A solução estoque de fluoxetina deve ser diluída para 25 milimolar em DMSO. Adicione cinco microlitros dessa solução para atingir uma concentração de 50 micromolar na câmara. O DMSO pode afetar as propriedades da bicamada lipídica. Portanto, é importante limitar a quantidade de DMSO na solução a 25 microlitros (1% ou 150 milimolar).

Agite durante cinco minutos e aguarde 10 minutos para permitir que o modificador atinja o equilíbrio entre a solução aquosa e a membrana. Agora, registre a atividade do canal conforme descrito anteriormente, na presença do modificador. Repita esses passos para registrar a atividade do canal em concentrações crescentes do modificador.

Aprendemos muito sobre as alterações na bicamada ao quantificar os tempos de vida dos canais e as taxas de aparecimento. Para realizar tal análise, precisamos detectar a formação e o desaparecimento dos canais. Aqui, utilizamos um algoritmo baseado em transições, no qual o computador calcula a derivada primeira para determinar mudanças rápidas na corrente e as marca como eventos de canal.

Os eventos são armazenados como uma série temporal para nos ajudar a determinar as durações dos canais antes e após a transição. Os níveis de corrente também são armazenados e auxiliam na determinação das amplitudes dos canais à medida que o experimento progride. O computador constrói um histograma de amplitude de transição de corrente, o que permite acompanhar a aquisição de transições de corrente.

Ele também permite que você avalie a qualidade do experimento. Se as amplitudes de transição atuais apresentarem grande dispersão, você tem problemas. Se o histograma for estreito, você está obtendo bons resultados.

Quando você tiver acumulado mais de 200 eventos de transição, calcule a corrente média e o desvio padrão para as transições no pico principal. Você pode estimar a taxa de aparecimento do canal simplesmente dividindo o número de transições no histograma de amplitude de transição de corrente pelo tempo de observação. Lembre-se de também dividir por dois, porque um canal é contado duas vezes no histograma: uma vez quando aparece e outra quando desaparece.

Analise a série temporal de eventos de transição para obter as distribuições de tempo de vida do canal. A determinação dos tempos de vida é direta em registros de corrente onde não há mais do que um canal condutor em qualquer momento. Nesse caso, o computador detecta se cada transição é uma aparição ou desaparecimento do canal, e um evento de desaparecimento só pode pertencer ao evento de aparição imediatamente anterior.

O tempo entre as duas transições é a duração do canal. Em casos em que as transições do canal ocorrem muito próximas para serem distinguidas, é necessário atribuir manualmente os aparecimentos e desaparecimentos. A atribuição é mais complexa quando há dois ou mais canais conduzindo simultaneamente, pois agora não se sabe a qual aparecimento de canal pertence cada desaparecimento.

Por esse motivo, é preferível ter uma baixa atividade do canal. Você pode resolver o problema de atribuição utilizando um gerador de números aleatórios para atribuir aparecimentos a desaparecimentos. Assim, obtém-se uma série de tempos de vida dos canais.

Isso é convertido em um histograma de tempo de vida, que por sua vez é convertido em um gráfico de sobrevida, determinando o tempo de vida médio por meio do ajuste de uma distribuição exponencial simples ao gráfico de sobrevida utilizando o método de mínimos quadrados não lineares, e em experimentos nos quais a membrana grande não se rompe. Quando se adiciona o modificador da bicamada, pode-se comparar o efeito sobre as taxas de aparecimento dos canais. Essa comparação não é justificada se a membrana grande se rompe, pois a função das proteínas de membrana é regulada pela composição lipídica da membrana celular.

Essa regulação é devida a uma combinação de interações específicas entre lipídios e proteínas e interações mais gerais entre a bicamada lipídica e as proteínas de membrana. Essas interações são particularmente importantes na pesquisa farmacológica. Como muitos fármacos atuais disponíveis no mercado são anfifílicos e podem alterar as propriedades da bicamada lipídica, o que por sua vez pode levar a alterações na função das proteínas de membrana.

Os canais gramin podem ser utilizados como transdutores moleculares de força para indicar se os anfifílicos podem alterar as propriedades da bicamada lipídica. A representação gráfica das alterações na duração e na taxa de aparecimento em função da concentração do modificador fornece informações sobre mudanças nas propriedades da bicamada.

Uma frequência aumentada significa que a bicamada é mais facilmente deformada para acomodar o sítio Gram e a dimerização. Um tempo de vida aumentado significa que a deformação da bicamada associada à formação do canal não é tão custosa energeticamente. Um modificador pode aumentar a frequência e o tempo de vida ao aumentar a elasticidade da membrana ou afetar a curvatura.

Agora demonstramos como usar canais cromogênicos para verificar se moléculas pequenas alteram as propriedades elásticas de bicamadas. E é isso. Obrigado por assistir.

Boa sorte com seus experimentos.