Preparação de Bicamadas Artificial para Experimentos Eletrofisiologia

Olá, sou o Dr. Olaf Anderson no Departamento de Fisiologia e Biofísica do Weill Cornell Medical College na cidade de Nova York. Olá, sou Ruchi Kaur, um estudante de doutorado em MD no laboratório do Dr. Olaf Anderson. Olá, meu nome é John Kim.

Sou técnico em pesquisa. Hoje mostraremos como se preparar para experimentos de canal único em bicamadas lipídicas simples. Mostraremos como preparar a câmara e como preparar os eletrodos Bilayer Punch.

Costumávamos isolar as pequenas áreas de membrana onde fazemos as medições. Então, vamos começar. Nossa configuração eletrofisiológica consiste no seguinte, uma mesa antivibração suspensa a ar para minimizar as vibrações mecânicas, uma gaiola de Faraday para proteger contra ruídos elétricos, som e vibração e um suporte.

Para a câmara de bicamada, usamos uma camisa de água circulante para controle de temperatura na qual a câmara de bicamada é colocada e um micro manipulador para montar o estágio principal do amplificador de grampo de remendo. Uma unidade de filtro eletrônico é usada para filtrar ainda mais a saída do amplificador de grampo de remendo a 500 hertz. Para visualizar as transições de corrente, um osciloscópio é usado para exibir o sinal de corrente, tanto a saída do amplificador patch clamp quanto do filtro eletrônico.

Por último, mas não menos importante, você precisará de um computador com um sistema de aquisição de dados que digitalize o sinal do patch clamp. Com 20 kilohertz, usamos um software desenvolvido internamente para registro e análise de dados. Todo o equipamento é ligado 20 minutos antes de começar.

Em seguida, prepararemos a câmara onde os experimentos são realizados. A câmara é dividida em duas metades via septo, que é feito de uma fina folha de Teflon, com cerca de 100 mícrons de espessura e preenchida com uma solução eletrolítica. Formamos a bicamada através do orifício no septo, que fornece a conexão entre as soluções eletrolíticas.

O orifício deve ter um diâmetro de um a 1,5 milímetros usando vaselina como local selante. Uma janela de vidro na metade frontal da câmara de Teflon, rosqueia parafusos de aço inoxidável através de uma cinta de metal e os quatro orifícios na metade da câmara traseira. Usando vaselina como local selante, uma partição circular de Teflon de modo que seja imprensada entre as duas metades da câmara montada.

Certifique-se de que o orifício na divisória esteja centralizado. Aplique vaselina em ambos os lados da divisória para garantir que os compartimentos de eletrólitos sejam estanques e isolados eletricamente. Continue enfiando os parafusos na metade frontal da câmara e na cinta de metal frontal.

Aperte o conjunto para garantir que todos os componentes estejam firmemente no lugar, mas não muito apertados para limpar a câmara e remover a vaselina. Uma pipeta de pastagem é de fogo, polida e dobrada em ângulo reto. Fogo. Polir a pipeta até obter uma ponta lisa ajuda a evitar arranhar o vidro ou o Teflon.

Em seguida, limpe a câmara com uma mistura de dois para um de clorofórmio e metanol ou solução de fch. Usando a pipeta, remova o excesso de vaselina com a solução fch sem espalhar todo o Teflon e vidro. Use pelo menos 10 volumes de fch.

Feito isso, barras de agitação magnéticas são adicionadas às câmaras. Em seguida, limpe a câmara com etanol a 95%. E, finalmente, com água de alta pureza, água destilada, água UE ou equivalente.

Como antes, você usa um pasto polido pelo fogo, sua pipeta para aspirar o líquido. Por fim, repita a limpeza com etanol fch e água. Em seguida, água, etanol e fol.

Agora vamos fazer a micropipeta de eletrodo de vidro, que servirá como conexão elétrica ao compartimento traseiro da câmara usando uma micropipeta marrom flamejante P 97 Polar da Sutter instruments puxou o capilar de vidro para fazer duas micropipetas, cada uma com um cone afiado e curto. Usamos capilares feitos de vidro de silicato bo com diâmetro externo de 0,8 milímetros e diâmetro interno de 0,5 milímetros. Um capilar de vidro é colocado no polar e preso em preparação para puxar o filamento.

O polar deve ser feito de platina, pois não tivemos sucesso. Puxando as pipetas em eletrodos polares com filamentos de tungstênio, os próximos passos serão feitos em uma micro forja com um filamento de platina. Antes de usar a micro forja, você deve se certificar de que o filamento está bem revestido com vidro.

Você pode usar um vidro macio de soda-cal ou um vidro de silicato duro. Você precisará ajustar o calor em sua micro forja para que o vidro flua suavemente e cubra o filamento uniformemente com uma camada fina. Agora monte a micropipeta na micro forja e quebre a ponta.

Fazemos isso amolecendo suavemente a camada de vidro do filamento em um calor relativamente baixo. Em seguida, você move suavemente a ponta da micropipeta em direção ao revestimento de vidro do filamento para que os dois derretam juntos desligue o calor no filamento, que se retrai e a pipeta se quebra. Agora ficamos com uma abertura nítida e uniforme de cerca de 30 mícrons e diâmetro.

Novamente, usando a micro forja, crie uma curva em ângulo reto na micropipeta a três a quatro milímetros da ponta, coloque a pipeta algumas centenas de mícrons acima do filamento e, em seguida, ligue o fogo para que o filamento fique vermelho. O filamento se moverá devido à expansão térmica. Em seguida, abaixe suavemente a pipeta sobre o filamento e o filamento se dobrará.

Você controla a quantidade de flexão pelo calor do filamento. Quando a curva é de cerca de 80 graus, você move rapidamente a pipeta para cima e para frente. Isso requer alguma coordenação.

Você quer acabar com uma curva de 90 graus usando as mesmas configurações. Polir a ponta da micropipeta, manter o filamento revestido com vidro. Agora siloizamos a ponta da pipeta com uma solução a 10% de sileno trioctal em benzeno.

Isso torna a superfície da pipeta hidrofóbica, de modo que interage bem com a membrana. Deixe a solução subir alguns milímetros na pipeta por ação capilar. Evapore o sane usando a micro forja em fogo baixo e pronto.

Agora vamos mostrar como preparar o eletrodo de prata. Pegue um pedaço de fio de prata de cinco centímetros com cerca de um milímetro de diâmetro. Enrole-o três a quatro vezes em uma bobina com um diâmetro interno de dois a três milímetros.

Mantenha o resto como uma cauda que se dobrará de forma que fique em ângulo reto com a hélice. Cubra a cauda e os cinco a 10 milímetros adjacentes do fio de prata com cloreto de prata derretida. Agora prepare a solução formadora de bicamada.

No nosso caso, o dial lipídico fosfatidilcolina no final do decano. O lipídio é armazenado em tubos de vidro a menos 40 graus Celsius como 150 microlitros al quads de lipídio e clorofórmio. Pegue um tubo de vidro do freezer, deixe-o atingir a temperatura ambiente e evapore o clorofórmio sob um jato de nitrogênio seco.

Em uma coifa química, adicione 50 microlitros de decano final e vórtice. Para ter um bom contato entre a solução formadora de bicamada e o Teflon ao redor do orifício sobre o qual formamos a bicamada, repintamos a partição de Teflon ao redor do orifício. Primeiro, limpe uma pipeta de pasto polida com fch.

Em seguida, mergulhe a pipeta limpa em 2,5% de fosfolipídio no final do decano, permitindo que o lipídio suba cerca de um milímetro para dentro da pipeta. Deposite uma gota de lipídio como um filme sobre o orifício na partição de Teflon. Deixe o lipídio secar por cerca de 10 a 15 minutos e repita. Olá.

Então, hoje mostramos como preparar bicamadas lipídicas para experimentos de canal único. No vídeo que acompanha, mostraremos como isolar pequenas manchas de membrana, como registrar a atividade de canal único, como modificar a atividade com pequenas moléculas e como analisar os resultados. Ok, é isso.

Obrigado por assistir. Boa sorte com seu experimento.