Name: Preparação de Bicamadas Artificial para Experimentos Eletrofisiologia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-31T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a preparar bicamadas lipídicas planas para estudos de canais iônicos em eletrofisiologia. Este protocolo detalha a montagem da câmara, eletrodos e técnicas de limpeza essenciais para medições de canal único.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Visite <a href="http://springerprotocols.com/index.vm">Protocolos Springer</a> para mais informações sobre como preparar bicamadas artificial e uso de canais gramicidin para sondar a elasticidade da membrana.

Os autores não têm nada a declarar.

preparação de bicamadas artificial para experimentos eletrofisiologia

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Bicamadas lipídicas planas, também chamado de bicamadas lipídicas artificiais, permitem a realização de estudo de iões de canais em um ambiente bem definido. Estes bicamadas pode ser usado para diversos cursos, tais como a caracterização de peptídeos de membrana-ativa, a reconstituição de canais iônicos ou investigações sobre como as alterações nas propriedades bicamada lipídica alterar a função da bicamada-spanning canais. Aqui, mostramos como para formar uma bicamada planar e como isolar pequenas manchas da bicamada, e em um segundo vídeo também irá demonstrar um procedimento para a utilização de canais gramicidin para determinar as mudanças nas propriedades elásticas bicamada lipídica. Nós também demonstramos os passos individuais necessários para preparar a câmara de bicamada, os eletrodos e como testar se a bicamada é adequado para um único canal de medições.

Bicamadas lipídicas planas, também chamado de bicamadas lipídicas artificiais, permitem a realização de estudo de iões de canais em um ambiente bem definido. Aqui, demonstramos os passos individuais necessários para preparar a câmara de bicamada, os eletrodos e como testar se a bicamada é adequado para um único canal de medições.

Preparação de Bicamadas Artificial para Experimentos Eletrofisiologia

Bicamadas lipídicas planas, também chamadas de bicamadas lipídicas artificiais, permitem estudar canais de condução iônica em um ambiente bem definido. Estas bicamadas podem...

Olá, sou o Dr. Olaf Anderson do Departamento de Fisiologia e Biofísica do Weill Cornell Medical College na cidade de Nova York. Olá, sou Ruchi Kaur, aluna de medicina e doutorado no laboratório do Dr. Olaf Anderson. Olá, meu nome é John Kim.Sou técnico de pesquisa. Hoje vamos mostrar como se preparar para experimentos com canais únicos em bicamadas lipídicas simples. Vamos mostrar como preparar a câmara e como preparar os eletrodos para o método Bilayer Punch.Costumávamos isolar as pequenas áreas da membrana onde realizamos as medições. Então, vamos começar. Nossa configuração eletrofisiológica consiste no seguinte: uma mesa suspensa no ar com proteção contra vibrações para minimizar vibrações mecânicas, uma gaiola de Faraday para proteger contra ruídos elétricos, sons e vibrações, e um suporte.Para a câmara de bicamada, utilizamos uma jaqueta de água circulante para controle de temperatura na qual a câmara de bicamada é colocada e um micromanipulador para montar o estágio principal do amplificador de patch clamp. Uma unidade de filtro eletrônico é usada para filtrar ainda mais a saída do amplificador de patch clamp em 500 hertz. Para visualizar as transições de corrente, um osciloscópio é utilizado para exibir o sinal de corrente, tanto a saída do amplificador de patch clamp quanto a do filtro eletrônico.Por último, mas não menos importante, você precisará de um computador com um sistema de aquisição de dados que digitalize o sinal do patch clamp. A 20 quilohertz, utilizamos um software desenvolvido internamente para gravação e análise de dados. Todos os equipamentos são ligados 20 minutos antes do início. A seguir, vamos preparar a câmara onde os experimentos são realizados. A câmara é dividida em duas metades por meio de um septo, que é feito de uma folha fina de teflon, com cerca de 100 mícrons de espessura e preenchida com uma solução eletrolítica. Formamos a bicamada sobre o orifício no septo, o que permite a conexão entre as soluções eletrolíticas.O orifício deve ter um diâmetro de um a 1,5 milímetros usando vaselina como selante. Coloque uma janela de vidro na metade frontal da câmara de teflon, passe parafusos de aço inoxidável por um suporte metálico e pelos quatro orifícios na metade traseira da câmara. Usando vaselina como selante, posicione uma divisória circular de teflon de modo que ela fique sanduichada entre as duas metades da câmara montada.Certifique-se de que o orifício na partição esteja centralizado. Aplique vaselina em ambos os lados da partição para garantir que os compartimentos do eletrólito fiquem impermeáveis e eletricamente isolados. Continue enroscando os parafusos através da metade frontal da câmara e do suporte metálico frontal.Ajuste o conjunto para garantir que todos os componentes estejam firmemente fixos, mas sem apertar demais, a fim de limpar a câmara e remover a vaselina. Uma pipeta de pasteur é aquecida, polida e dobrada em ângulo reto. Aquecer e polir a pipeta até obter uma ponta lisa ajuda a evitar arranhões no vidro ou no teflon.Em seguida, limpe a câmara com uma mistura na proporção de dois para um de clorofórmio e metanol ou solução fch. Usando a pipeta, remova o excesso de vaselina com a solução fch sem espalhá-la por toda a teflon e o vidro. Use pelo menos 10 volumes de fch.Uma vez feito isso, barras de agitação magnética são adicionadas às câmaras. Em seguida, limpe a câmara com etanol a 95%. E, finalmente, com água de alta pureza, seja água destilada, água UE ou equivalente.Como antes, utilize uma pastilha de pasteurização com ponta polida pelo fogo e sua pipeta para aspirar o líquido. Por fim, repita a limpeza com etanol FCH e água. Em seguida, água, etanol e fol.Agora vamos confeccionar a micropipeta de eletrodo de vidro, que servirá como conexão elétrica com o compartimento traseiro da câmara. Utilizando um micropipetador P-97 Flaming/Brown da Sutter Instruments, puxamos o capilar de vidro para obter duas micropipetas, cada uma com uma ponta afilada e um cone curto. Utilizamos capilares feitos de vidro borossilicato com diâmetro externo de 0,8 milímetros e diâmetro interno de 0,5 milímetros. Um capilar de vidro é colocado no polar e fixado em preparação para o aquecimento e puxamento do filamento.O polar deve ser feito de platina, pois não obtivemos sucesso. Puxando os micropipetadores em polares de eletrodo com filamentos de tungstênio, os próximos passos serão realizados em uma micro-fornalha com um filamento de platina. Antes de usar a micro-fornalha, você deve garantir que o filamento esteja bem revestido com vidro com.Você pode usar um vidro de soda-cálcio macio ou um vidro de borossilicato duro. Será necessário ajustar o calor em sua micro-fornalha para que o vidro flua suavemente e cubra o filamento uniformemente com uma camada fina. Agora, fixe a micropipeta na micro-fornalha e quebre a ponta.Fazemos isso suavemente amolecendo o revestimento de vidro no filamento com um calor relativamente baixo. Em seguida, mova suavemente a ponta da micropipeta em direção ao revestimento de vidro no filamento, de modo que os dois se fundam; desligue então o calor do filamento, que retrai e faz a pipeta quebrar. Agora ficamos com uma abertura afiada e uniforme de cerca de 30 mícrons de diâmetro.Novamente, utilizando o micro-foice, crie uma curva em ângulo reto no microcapilar a três ou quatro milímetros da ponta, posicione o capilar a algumas centenas de mícrons acima do filamento e, em seguida, ligue o aquecimento até que o filamento fique vermelho. O filamento se moverá devido à expansão térmica. Em seguida, abaixe suavemente o capilar sobre o filamento e o filamento se curvará.Você controla a quantidade de curvatura pelo calor do filamento. Quando a curvatura for de aproximadamente 80 graus, mova rapidamente a pipeta para cima e para frente. Isso exige alguma coordenação.Você deseja obter uma curvatura de 90 graus utilizando as mesmas configurações. Polir a ponta da micropipeta com chama, mantendo o filamento revestido com vidro. Agora silanizamos a ponta da pipeta com uma solução a 10% de tri-octil-sileno em benzeno.Isso torna a superfície da pipeta hidrofóbica, permitindo que ela interaja bem com a membrana. Deixe a solução subir alguns milímetros para dentro da pipeta por ação capilar. Evapore o sane usando a micro-fornalha em temperatura baixa e você terá concluído.Agora vamos mostrar como preparar o eletrodo de prata. Pegue um pedaço de fio de prata de cinco centímetros de comprimento e cerca de um milímetro de diâmetro. Enrole-o de três a quatro vezes em uma bobina com diâmetro interno de dois a três milímetros.Mantenha o restante como uma cauda que se dobrará de forma a ficar em ângulo reto com a hélice. Revesta a cauda e os cinco a dez milímetros adjacentes do fio de prata com cloreto de prata fundido. Agora prepare a solução para formação da bicamada.No nosso caso, o lipídio é o difosfatidilcolina em decano. O lipídio é armazenado em tubos de vidro a menos 40 graus Celsius, na forma de alíquotas de 150 microlitros contendo lipídio e clorofórmio. Retire um tubo de vidro do congelador, deixe aquecer até a temperatura ambiente e evapore o clorofórmio sob um jato de nitrogênio seco.Em uma capela química, adicione 50 microlitros de decano final e vortex. Para obter um bom contato entre a solução formadora da bicamada e o teflon ao redor do orifício sobre o qual formamos a bicamada, repintamos a divisória de teflon ao redor do orifício. Primeiro, limpe uma pipeta Pasteur polida ao fogo com fch.Em seguida, mergulhe a pipeta limpa em 2,5% de fosfolipídio em decano final, permitindo que o lipídio suba cerca de um milímetro para dentro da pipeta. Deposite uma gota de lipídio como uma película sobre o orifício na divisória de teflon. Deixe o lipídio secar por cerca de 10 a 15 minutos e repita.Hoje mostramos como preparar bicamadas lipídicas para experimentos de canal único. No vídeo complementar, mostraremos como isolar pequenos fragmentos de membrana, como registrar a atividade de canais individuais, como modificar a atividade com moléculas pequenas e como analisar os resultados. Ok, é isso.Obrigado por assistir. Boa sorte com seu experimento.

preparation-of-artificial-bilayers-for-electrophysiology-experiments

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Suportados bicamadas planar são ferramentas poderosas que podem ser usados ​​para modelar as interações moleculares em uma sinapse imunológica. Aqui, vamos mostrar os métodos de ancoragem de proteínas de adesão celular que modula a formação de sinapses para o folheto superior do bilyer lipídico e visualize a formação de sinapses através de microscopia TIRF.

Suportados Bicamadas Planar para a Formação do Estudo da Sinapses imunológicas e Kinapse

Função das proteínas da membrana é regulada pela composição lipídica da membrana celular. Este artigo detalhes de vídeo-how para formar um remendo adesivo utilizando eletrodos bicamada, bem como a forma de utilizar os canais gramicidin como repórteres de propriedades da membrana alterada.

Métodos única molécula para acompanhar as alterações nas propriedades elásticas bicamada

Procedimentos para a reconstituição completa da voltagem dependentes do canal de potássio protótipo em membranas lipídicas são descritos. Os canais reconstituídos são adequados para ensaios bioquímicos, gravações elétricas, triagem ligante e estudos de cristalografia de elétrons. Esses métodos podem ter aplicações gerais para os estudos estruturais e funcionais de outras proteínas de membrana.

Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais

Canais mechanosensitive bacterianas podem ser utilizados como transdutores mecanoelétrica em dispositivos biomoleculares. Bilayers de interface de gotículas (DIBs), de inspiração celulares blocos de construção para tais dispositivos, representam novas plataformas para incorporar e estimular canais mechanosensitive. Aqui, demonstramos um novo método baseado na micropipeta de formar DIB, permitindo que o estudo de canais mechanosensitive sob estimulação mecânica.

Método multifuncional, baseado em Micropipeta de Incorporação e estimulação do bacteriana Mechanosensitive canais iônicos em gotículas de interface Bicamadas

Nós demonstramos um sistema armazenável e transportável de lípidos em bicamada. Uma membrana de bicamada de lípido pode ser formado dentro de 1 hora com uma taxa de sucesso superior a 80% quando um precursor de membrana congelada é levada até à temperatura ambiente. Este sistema irá reduzir os processos laboriosos e conhecimentos associados com canais de íons.

Formação Automated Lipid bicamada da membrana Usando um polidimetilsiloxano Thin Film

Aqui, apresentamos um protocolo para a formação de bilayers do lipid usando um método de BICAMADA contato bolha. Uma bolha de água é explodida em um solvente orgânico, segundo a qual uma monocamada é constituída na interface água-óleo. Duas pipetas são manipuladas para encaixar as bolhas para formar uma BICAMADA.

Experimentos de bicamada lipídica com contato bolha Bilayers para Patch-Clampers

Macio, baixo consumo de energia, biomolecular memristors alavancar semelhante composição, estrutura e mecanismos de bio-sinapses de comutação. Apresentado aqui é um protocolo para montar e caracterizar biomolecular memristors obtido de isolamento bilayers do lipid formadas entre as gotículas de água em óleo. A incorporação dos resultados de peptídeos alamethicin tensão-ativado em memristive de condutância iônica através da membrana.

Montagem e caracterização de Biomolecular Memristors consiste em membranas de lipídios dopado com canal iônico

Este protocolo detalha o uso de um sistema de aquecimento controlado pela temperatura para promover a montagem de monocamadas lipídicas e a formação de bicamadas de interface de gotícula para lipídios com temperaturas elevadas de fusão e medidas de capacitância para caracterizar mudanças orientadas pela temperatura na membrana.

Montagem controlada por temperatura e caracterização de um Bilayer de interface de gotícula

Este protocolo descreve a formação de células imitando vesículas uni-lipídicas e multi-lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Estes modelos in vitro podem ser adaptados para incorporar uma variedade de tipos lipídes e podem ser usados para investigar várias interações de moléculas e macromoléculas.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

Aqui, um protocolo para realizar e analisar a ligação, mobilidade e montagem de moléculas individuais em membranas lipídicas artificiais apinhadas usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total de molécula única (smTIRF) é apresentado.

Difusão e Montagem de Molécula Única em Membranas Lipídicas Repletas de Polímeros

Um protocolo experimental é apresentado para montar, estimular eletricamente e analisar bicamadas de interface de gotículas dopadas com gramicidina A. As relações estrutura-função lipídio-proteína são quantificadas medindo mudanças na área da membrana, fluxo iônico e condutância de canal único, e relacionando essas respostas a mudanças semelhantes à plasticidade na condução iônica em um modelo de membrana inspirado em sinapses elétricas.

Caracterização da Estrutura e Função da Membrana Lipídio-Proteína usando Bicamadas de Interface de Gotículas

Aprenda a preparar bicamadas lipídicas planas para estudos de canais iônicos em eletrofisiologia. Este protocolo detalha a montagem da câmara, eletrodos e técnicas de limpeza essenciais para medições de canal único.

Preparação de Bicamadas Artificial para Experimentos Eletrofisiologia

Explorar mais vídeos