Citometria de Fluxo e Separação de Células Ativadas por Fluorescência (FACS): Isolamento de Linfócitos B Esplênicos

1. Preparação

1. Antes de começar, coloque luvas de laboratório e as roupas de proteção apropriadas.
2. Esterilize todas as ferramentas de dissecção, primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois seque bem.
3. Prepare 50mL da solução de sal balanceada da Hank (HBSS) contendo 2% de soro fetal de bezerro (FCS).

2. Dissecção

1. Usando um sistema de entrega de dióxido de carbono, eutanize o rato por hipóxia. Fixar o rato eutanizado em uma placa de dissecção na posição supina e realizar uma laparotomia longitudinal usando tesouras e fórceps.
2. Usando fórceps, mova os intestinos e o estômago do lado direito do abdômen para expor o estômago e o baço. O baço está preso ao estômago.
3. Usando fórceps, retire cuidadosamente o baço do estômago e coloque-o na placa de Petri contendo 5mL de HBSS 2% FCS.

3. Isolamento de células imunes

1. Coloque o baço em um coador de células de 40μm sobre a mesma placa de Petri. Esmague o baço com um êmbolo para dissociá-lo no mesmo prato.
2. Transfira o baço dissociado e o fluido em um tubo centrífuga de 15mL.
3. Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C e descartar o supernatante, evitando a pelota.
4. Resuspenque a pelota em 2mL de acetato de potássio para lise os eritrócitos. Aguarde 2 min e, em seguida, compor o volume até 15mL usando HBSS 2% FCS.
5. Centrifugar o tubo novamente a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 5mL de HBSS 2% FCS.
6. Conte as células usando um ensaio de coloração azul trypan e ajuste a concentração final da célula para 10⁷ células/mL usando o volume apropriado de HBSS 2% FCS.

4. Coloração celular

1. Transfira 200μL da suspensão celular para seis tubos FACS, rotulados de 1 a 6.
2. Centrifugar os tubos a 370 x g por 7 min a 10°C e descartar o supernatante evitando a pelota.
3. Em seguida, prepare seis novas misturas de anticorpos adicionando quantidade apropriada de anticorpo ao HBSS 2% FCS de acordo com a Tabela 1.
4. Em seguida, transfira essas misturas de anticorpos para os tubos FACS numerados correspondentes.
5. Incubar as suspensões celulares misturadas com os anticorpos por 20 minutos no gelo no escuro.
6. Adicione 1mL de HBSS 2% FCS a cada tubo e, em seguida, centrífugue novamente a 370 x g por 3 min a 10°C.
7. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 200μL de HBSS 2% FCS.
8. Transfira as pelotas resuspendadas para novos tubos FACS.

Tabela 1: Mistura de anticorpos. Seis misturas de 200μL de HBSS + anticorpos foram preparadas para o experimento. Mix 1 é para configuração PMT, mistura 2 a 5 são para configurações de compensação, e mix 6 é para classificação celular.

5. Calibração FACS

1. Primeiro, ligue o classificador e execute "Fluidics Startup".
2. Ligue o fluxo e espere 15 minutos para que o córrego se estabilize.
3. Ajuste a amplitude do fluxo para obter a formação de gotas isoladas. Em seguida, clique no "Ponto Doce" para completar o ajuste de amplitude.
4. Coloque o filtro de densidade neutra (N.D.) - 1.0 e abra a interface "CST" que significa configuração e rastreamento de citógrafos.
5. Para realizar o controle diário de qualidade, primeiro dilua as contas CST com meio FACS seguindo as instruções do fabricante e, em seguida, execute o controle CST.
6. Uma vez que o controle CST esteja concluído, substitua o filtro N.D. 1.0 pelo filtro N.D. 2.0 no cítmetro.
7. Em seguida, diluir as contas de atraso de queda no meio FACS seguindo as instruções do fabricante e, em seguida, carregar no FACS.
8. Para garantir a classificação adequada executar Drop Delay-
   1. Primeiro clique em "Tensão" e depois "Filtro Óptico". O quadrante direito deve ser igual a 100%. Se necessário, ajuste o parafuso laser vermelho no cítmetro esquerdo ou direito para obter 100% no quadrante direito.
   2. Em seguida, realize uma espécie de teste para garantir que o fluxo caia no tubo de coleta. Para isso, clique em "Gaveta de Resíduos" e inicie "Test Sort". Verifique se os fluxos laterais caem em tubos de coleta. Se não o fizerem, ajuste a tensão até que o façam.
   3. Navegue até o modelo experimental. Em seguida, abra o experimento "Accudrop Drop Delay" e clique no "Layout de classificação".
   4. Alterar a taxa de fluxo para obter 1000 a 3000 eventos por segundo.
   5. Clique em "Voltagem" e depois "Filtro Óptico". O quadrante esquerdo deve ser igual a 0 e quadrante direito a 100.
   6. No "Sort Layout" clique em "Sort" e clique em "Cancelar". O quadrante esquerdo deve ser igual a 100 e quadrante direito a 0. Se o quadrante esquerdo estiver a menos de 95 clique em "Atraso Automático" para ajustá-lo automaticamente.

6. Controle de Citometria de Fluxo e Pureza

1. Comece a citometria de fluxo começando com o tubo 1 (células não manchadas) para definir a morfologia celular e os picos negativos dos fluorochromes. Configure a dispersão para frente e lateral e defina as tensões de cada parâmetro fluorescente. Coloque a população negativa na primeira década usando as grades em cada parcela de ponto.
2. Em seguida, tubo de carga 2 (controle de cor única) no cítmetro. Ajuste a sobreposição espectral até que as medianas negativas e positivas da população estejam alinhadas ou use o software de cálculo automático. É importante manter o sinal em escala. Os controles de compensação devem coincidir com as configurações experimentais de fluorochromes e detectores. Recorde de 10.000 eventos.
3. Repita estas etapas com tubo 3, 4 e 5 (outros controles de cor única).
4. Em seguida, o tubo de carga 6 (células multi-manchadas) e definir populações celulares de interesse usando uma estratégia específica de gating.
5. Na janela Classificação layout, selecione a população celular de interesse. Selecione o limiar de célula no "Eventos de Destino" e o nível de precisão na "Precisão". Aqui, apenas uma população está sendo classificada, no entanto, quatro populações diferentes podem ser classificadas ao mesmo tempo.
6. Uma vez pronto clique em "Sort" e "OK", então espere pela classificação celular.
7. Uma vez que a classificação celular esteja completa, execute um controle de pureza pela primeira tubulação de 10μL de células classificadas em um novo tubo FACS com 90 microliters de HBSS 2% FCS.
8. Em seguida, carregue o tubo do cítmetro. Registo e analise os fenótipos das células para verificar se a estratégia de gating funcionou como pretendido.

7. Análise de dados

1. Abra o software 'FlowJo' e arraste os arquivos para cada tubo na janela "All sample".
2. Clique duas vezes em um arquivo para abri-lo em uma nova janela.
3. Clique na estratégia "Polígono" e recrie a estratégia de gating usada anteriormente.
4. Repita os passos com todos os outros arquivos.
5. Para visualizar os gráficos de pontos, clique em "Editor de layout" e arraste as populações de interesse do tubo 6 e controle de pureza na guia do editor de layout. As células só devem aparecer na população de interesse no controle da pureza (ver Figura 2).
6. Para verificar a pureza dos linfócitos B nas células classificadas, clique em "Editor de tabela". Arraste a população de linfócitos B do tubo 6 e controle de pureza na tabela.
7. No menu "Estatística" selecione a frequência de células CD45⁺ para testar a pureza desta população celular e clique em "Criar tabela".
8. Os valores dos parâmetros aparecem em uma nova tabela. Na janela de controle da pureza, verifique a frequência de linfócitos B dentro das células CD45^+, que devem ser superiores a 98% (ver figura 2, painel inferior).