5.2: Seleção de Células Ativadas por Magnetismo (MACS): Isolamento de Linfócitos T Tímicos

1. Preparação

1. Antes de começar, coloque luvas de laboratório e roupas de proteção apropriadas.
2. Lave todas as ferramentas de dissecção, primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois seque-as com uma toalha de papel limpa.
3. Prepare 200 mL da solução de sal balanceada da Hank (HBSS) contendo 2% de soro fetal de bezerro (FCS).

2. Dissecção

1. Fixar um rato eutanizado em uma placa de dissecção na posição supina.
2. Usando tesouras e fórceps, faça uma laparotomia longitudinal para acessar a cavidade torácica.
3. Remova o coração para ter acesso ao timo, que está localizado acima do coração. Em seguida, identifique o timo, que é composto por dois lobos brancos e está localizado na cavidade torácica acima do coração.
4. Usando fórceps cuidadosamente desprender o timo e colocá-lo na placa de Petri com 5 mL de HBSS 2% FCS.

3. Isolamento de células imunes

1. Coloque o timo em um coador de célula de 40 μm sobre a mesma placa de Petri. Esmague o timo com um êmbolo para dissociá-lo no mesmo prato.
2. Transfira o timo dissociado e o fluido em um tubo de centrífuga de 15 mL.
3. Lave a placa de Petri com 5 mL de HBSS 2% FCS e transfira o meio lavado também para o mesmo tubo de centrífuga.
4. Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 20°C e descartar o supernatante evitando a pelota.
5. Resuspenque a pelota em 2 mL de acetato de potássio para lise os eritrócitos. Aguarde 2 min e, em seguida, compor o volume de até 14 mL usando HBSS 2% FCS.
6. Centrifugar o tubo novamente a 370 x g por 7 min a 20°C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 5 mL de HBSS 2% FCS.
7. Estime a concentração celular usando o ensaio de coloração azul trypan e ajuste a concentração celular final para 10⁷ células/mL usando volume apropriado de HBSS 2% FCS.

4. Rotulagem magnética de células imunes

1. Pegue dois tubos FACS. Rotular um tubo, "células T não enriquecidas", e o outro tubo, "células T enriquecidas", que serão separados usando rotulagem magnética.
2. Distribuição da solução celular em cada um dos dois tubos FACS.
3. Centrifugar o tubo "células T enriquecidas" a 370 x g por 3 min a 20°C e descartar o supernatante evitando a pelota.
4. Resuspende a pelota em 250 μL de mistura de anticorpos biotinilados anti-CD3 (Tabela 1, Mix 1).

Tabela 1: Mistura de anticorpos. Misturas 1 e 2 são usadas para separação magnética. Mix 3 é usado para avaliar o enriquecimento celular após a separação magnética.

5. Incubar a mistura de anticorpos suspensão celular por 15 minutos a 4°C no escuro.
6. Adicione 3 mL de HBSS 2% FCS aos tubos e centrífugue novamente a 370 x g por 3 min a 20°C.
7. Descarte o supernatante e resuspenda a pelota em 250 contas acoplado streptavidin (Tabela 1, Mix 2).
8. Incubar a mistura celular e as contas por 20 minutos no gelo.
9. Em seguida, adicione 3 mL de HBSS 2% FCS e misture bem e centrífuga novamente a 370 x g para 3 min a 20°C.
10. Resuspense a pelota em 2 mL de HBSS 2% FCS.

5. Separação magnética de células CD3-Positivas

1. Coloque a coluna no ímã e adicione 3 mL de HBSS 2% FCS para umidificar o sistema. Espere 5 minutos.
2. Em seguida, coloque as células rotuladas na coluna.
3. Após a suspensão do celular passar pela coluna, lave a coluna X3 vezes com 3 mL de HBSS 2% FCS.
4. Em seguida, remova a coluna do ímã e coloque-a em um tubo de coleta de 15 mL.
5. Para elutar as células-alvo, adicione 5 mL de HBSS 2% FCS à coluna e lave a coluna com o êmbolo.
6. Repetir a etapa de eluição com mais 5 mL de HBSS 2% FCS.

6. Avaliação do enriquecimento de células-alvo por citometria de fluxo

1. Transfira 500 μL de suspensão celular elucida para um tubo FACS rotulado de "células T enriquecidas". Transfira 200 μL de suspensão "células T não enriquecidas" para um segundo FACS.
2. Em seguida, centrifugar ambos os tubos a 370 x g por 7 min a 20°C.
3. Descarte o supernatante e adicione 100 μL de anticorpo fluorescente Mix 3 (ver Tabela 1) a ambos os tubos.
4. Incubar os dois tubos por 20 min a 4°C no escuro.
5. Em seguida, adicione 3 mL de HBSS 2% FCS aos tubos e centrífugue-os a 370 x g por 3 min a 20°C.
6. Descarte o supernasal, depois resuspende cada tubo em 250 μL de HBSS 2% FCS.
7. Agora, avalie a taxa de enriquecimento celular CD3 positivo por citometria de fluxo.

7. Análise de dados

1. Abra o ícone 'FlowJo' e arraste os arquivos para cada tubo na janela "All Sample".
2. Clique duas vezes no arquivo "células T enriquecidas" para exibir o gráfico de pontos exibindo dispersão para a frente (FSC-A) no eixo X e dispersão lateral (SSC-A) no eixo Y.
3. Clique em "Polígono" para circular as populações de linfócitos.
4. Em seguida, clique duas vezes na população circulada para criar uma nova janela.
5. Selecione "FSC-W" no eixo Y e "FSC-A" no eixo X, e circule as células negativas FSA-W. Na janela"Identificação de Subpopulação",nomeie a população celular como "células únicas".
6. Clique duas vezes na população circulada para criar uma nova janela. Selecione "CD3" no eixo Y e circule as células CD3 positivos. Na janela"Identificação de Subpopulação"nomeie sua população celular "células T".
7. Repita com as "células T não enriquecidas".
8. Para visualizar a população celular, clique em "Editor de layout" e arraste a população de "células T" de arquivos "células T enriquecidas" e "células T não enriquecidas" na guia.
9. Gráficos de ponto representando linfócitos CD3+aparecerão. As células CD3+ só devem aparecer na população de interesse do tubo enriquecido CD3+.
10. Para avaliar o enriquecimento de linfócitos CD3+ nas células classificadas, clique em "Table editor", e depois arraste a população de "células T" de arquivos "células T enriquecidas" e "células T não enriquecidas" para a mesa.
11. No menu "Estatística", selecione "Frequência de linfócitos" para verificar a porcentagem de células CD3+ em todos os linfócitos, em seguida, clique em "Criar tabela".
12. Os valores dos parâmetros aparecerão em uma nova tabela. Para as "células T enriquecidas", a frequência das células CD3+ deve ser em torno de 80%.

A classificação de células ativadas por magnetismo, ou MACS, é uma técnica que permite aos pesquisadores separar células com base em epítopos específicos expressos em suas superfícies.

O processo normalmente começa com a extração de um órgão ou tecido, como o timo. Em seguida, as células são separadas mecanicamente, geralmente por esmagamento, até que o tecido seja dissociado em células únicas. As células indesejadas podem ser removidas nesta fase através da adição de produtos químicos. Por exemplo, cloreto de amônio-potássio, ou tampão ACK, pode ser usado para lisar eritrócitos indesejados.

Em seguida, um anticorpo conjugado a uma molécula chamada biotina é adicionado à suspensão, e esses complexos se ligam aos epítopos da superfície das células-alvo. A biotina tem uma alta afinidade por outra molécula chamada estreptavidina. Na próxima etapa, as moléculas de estreptavidina fundidas a esferas magnéticas são adicionadas às células marcadas com anticorpos. Quando a biotina e a estreptavidina entram em contato, elas se ligam firmemente. O resultado é que as células de interesse são revestidas com esferas magnéticas. Este complexo às vezes é chamado de sanduíche. Neste caso, CD3 na membrana celular na parte inferior, depois anti-CD3 conjugado à biotina e, finalmente, estreptavidina conjugada a esferas magnéticas.

Essas células marcadas agora podem ser colocadas em uma coluna contendo uma matriz que, auxiliada pela gravidade, permite que as células passem lentamente por um ímã. Ao fazer isso, as células marcadas com esferas magnéticas grudarão na borda do tubo mais próximo do ímã, enquanto as células não marcadas continuarão em um tubo de coleta abaixo. Em seguida, as células marcadas podem ser removidas da coluna simplesmente removendo o ímã, adicionando uma solução eluente e aplicando uma leve pressão com um êmbolo para liberá-las da coluna e colocá-las em um novo tubo de coleta. Em última análise, esse processo permite a recuperação de 60 a 98% das células de interesse.

Neste procedimento, isolaremos leucócitos tímicos de um camundongo e usaremos MACS para classificar células T CD3-positivas antes de confirmar a eficiência da classificação usando FACS.

Para começar, coloque qualquer equipamento de proteção apropriado, incluindo jaleco e luvas. Em seguida, lave uma tesoura de dissecação e uma pinça com etanol a 70% e seque-as com uma toalha de papel limpa. Em seguida, prepare 200 mililitros de soro fetal de bezerro HBSS a 2%, ou FCS, misturando quatro mililitros de FCS com 196 mililitros de HBSS.

Prenda um camundongo sacrificado em decúbito dorsal em uma placa de dissecação. Usando tesoura e fórceps, realize uma laparotomia longitudinal para acessar a cavidade torácica. Primeiro, remova o coração para obter acesso ao timo, que está localizado acima do coração. Em seguida, identifique o timo, que é composto por dois lóbulos brancos. Usando uma pinça, retire cuidadosamente o timo e coloque-o em uma placa de Petri com cinco mililitros de HBSS 2% FCS.

Para isolar as células imunológicas, primeiro coloque o timo em um filtro de células de 40 micrômetros na placa de Petri. Esmague o tecido com um êmbolo para dissociá-lo no prato. Depois disso, enxágue o êmbolo e o filtro com HBSS 2% FCS para recuperar as células aderidas. Em seguida, pipete as células dissociadas do timo e o fluido da placa de Petri para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Lave a placa de Petri com cinco mililitros de HBSS 2% FCS e transfira esta solução de lavagem para o tubo de centrífuga de 15 mililitros também.

Em seguida, centrifugue o tubo a 370 vezes g por sete minutos a 20 graus Celsius. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em dois mililitros de tampão de lise ACK para lisar os eritrócitos. Incube por dois minutos em temperatura ambiente na bancada. Em seguida, aumente o volume para 14 mililitros com HBSS 2% FCS. Centrifugue o tubo a 370 vezes g por sete minutos a 20 graus Celsius. Em seguida, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em cinco mililitros de HBSS 2% FCS.

Estime a concentração celular usando uma lâmina de Malassez, conforme mostrado no protocolo para isolamento FACS de linfócitos B e ajuste a concentração celular para 10 elevado a sétimo células por mililitro com HBSS 2% FCS.

Transfira 500 microlitros de solução celular para dois tubos FACS. Rotule um tubo de células T não enriquecidas e o outro tubo de células T enriquecidas, que serão separadas usando marcação magnética.

Centrifugue o tubo de células T enriquecido a 370 vezes g por três minutos a 20 graus Celsius. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 250 microlitros de anticorpo anti-CD3 acoplado à biotina, diluído um em 400 em HBSS 2% FCS. Incube as células por 20 minutos no gelo e no escuro. Adicione três mililitros de HBSS 2% FCS aos tubos e centrifugue-os novamente a 370 vezes g por três minutos a 20 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 250 microlitros de esferas acopladas à estreptavidina diluídas uma em cada cinco em HBSS 2% FCS. Incube a mistura de células e contas por 20 minutos no gelo. Em seguida, adicione três mililitros de HBSS 2% FCS ao tubo, pipete para cima e para baixo para misturar e centrifugue novamente a 370 vezes g por três minutos a 20 graus Celsius. Ressuspenda o pellet em dois mililitros de HBSS 2% FCS.

Coloque a coluna no ímã e adicione três mililitros de HBSS 2% FCS para umidificar o sistema. Em seguida, pipete as células coradas para a coluna. Depois que a suspensão da célula passar pela coluna, lave a coluna três vezes com três mililitros de HBSS 2% FCS. Em seguida, remova a coluna do ímã e coloque-a em um tubo de 15 mililitros. Para eluir as células-alvo, adicione cinco mililitros de HBSS 2% FCS à coluna e lave a coluna com um êmbolo. Repita esta etapa com mais cinco mililitros de HBSS 2% FCS.

Para avaliar a eficácia do isolamento da célula-alvo, primeiro transfira 500 microlitros de suspensão de células eluídas para um tubo FACS e rotule-o com células T enriquecidas. Em seguida, centrifugue os tubos enriquecidos e não enriquecidos a 370 vezes g por sete minutos a 20 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e adicione 100 microlitros de anticorpo fluorescente diluído um em 200 em HBSS 2% FCS em ambos os tubos. Incube as células por 20 minutos no gelo e no escuro. Em seguida, adicione três mililitros de HBSS 2% FCS aos tubos e centrifugue-os a 370 vezes g por três minutos a 20 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os pellets em 250 microlitros de HBSS 2% FCS. Agora, avalie a taxa de enriquecimento celular CD3-positivo usando citometria de fluxo, conforme mostrado no protocolo FACS.

Agora, determinaremos a frequência de linfócitos CD3-positivos entre todos os timócitos que foram isolados do timo de camundongo. Para começar, clique duas vezes no ícone do FlowJo e arraste os arquivos de cada tubo na janela de todas as amostras. Em seguida, clique duas vezes no arquivo de células T enriquecidas para exibir as células registradas dessa amostra em um gráfico de pontos que exibe dispersão direta, FSCA, no eixo x, e dispersão lateral, SSCA, no eixo y.

Clique no polígono para circular as populações de linfócitos. Em seguida, clique duas vezes na população circulada para criar uma nova janela. Selecione FSC-W no eixo y e FSC-A no eixo x e circule as células negativas FSA-W. Na janela de identificação da subpopulação, nomeie sua população de células como Células Únicas. Em seguida, clique em OK na janela de identificação da subpopulação e, em seguida, clique duas vezes na população circulada para criar uma nova janela. Selecione CD3 no eixo y e circule as células CD3-positivas. Na janela de identificação da subpopulação, nomeie as células T da população de células. Repita com o arquivo de células T não enriquecido. Para visualizar sua população de células, clique em Editor de layout e arraste a população de células T dos arquivos de células T enriquecidas e células T não enriquecidas para a guia.

Os gráficos de pontos que representam linfócitos CD3 positivos serão exibidos. As células CD3-positivas só devem aparecer na população de interesse no tubo enriquecido CD3-positivo. Para avaliar o enriquecimento de linfócitos CD3-positivos nas células classificadas, clique em Editor de tabelas e arraste a população de células T dos arquivos de células T enriquecidas e células T não enriquecidas para a tabela. No menu de estatísticas, selecione Frequência de células linfocitárias para verificar a porcentagem de células CD3 positivas em todos os linfócitos. Em seguida, clique em Criar tabela. Os valores dos parâmetros aparecerão em uma nova tabela. Para as células T enriquecidas, a frequência de células CD3 positivas deve ser de cerca de 80% ou mais.