Ensaios ELISA: Indireto, Sanduíche e Competitivo

1. Elisa indireta

Um ELISA indireto é aquele em que o anticorpo primário específico do antígeno é reconhecido por um anticorpo conjugado secundário. O protocolo a seguir é um exemplo de um método ELISA indireto, onde as amostras de soro de camundongos infectados pelo vírus influenza A (IAV) são testadas para a presença de anticorpo IgG específico do IAV. Uma força deste exemplo é que diferentes anticorpos secundários podem ser usados que reconhecem todos os isótipos de anticorpos ou isótipos específicos (por exemplo, IgG).

Revestimento de antígeno para a microplacão

1. Cubra os poços de uma placa ELISA de 96 poços com antígeno purificado por tubos de 50 μL de antígeno purificado (2 mg/mL de vírus purificado A/PR/8 Influenza A em 0,05M Tampão Tris-HCl (pH 9,5)) em cada poço da placa.
2. Cubra a placa com uma tampa adesiva e incuba-a durante a noite a 4°C para permitir que o antígeno se ligue à placa.
3. Após a conclusão da incubação, remova a solução de revestimento, jogando a placa sobre uma pia.

Bloqueio

4. Bloqueie os locais de ligação de proteína restantes nos poços revestidos adicionando 200 μL de tampão de bloqueio, 5% de soro de burro em 1X PBS é usado aqui, por poço. Os reagentes de bloqueio alternativos incluem 5% de leite seco não gordo ou BSA em PBS ou soro normal de um animal no qual o anticorpo secundário foi gerado.
5. Incubar por pelo menos 2 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C.
6. Após a incubação, remova o tampão de bloqueio apertando a placa e, em seguida, lave a placa com PBS contendo 1% de Interpol-20.

Incubação com o anticorpo primário

7. Prepare uma diluição serial da amostra de soro, que contém o anticorpo primário, para obter uma faixa de diluição de 1 a 204.800, utilizando 1X PBS. Para isso, primeiro dilua o soro 1:12.5 e depois realize uma diluição de 4X (faixa de diluição - 1:12.5 a 1:204.800).
8. Adicione 100 μL das amostras de soro diluídas em série aos poços.
9. Cubra a placa com tampa adesiva e incubar à temperatura ambiente por 1-2 h.
10. Após a incubação, passe a placa sobre uma pia e lave a placa com PBS contendo 1% de Interpol-20.

Incubação com o anticorpo secundário

11. Adicione 100 μL de um anticorpo secundário conjugado por enzimas, peroxidase de rabanete, anti-rato de burro conjugado hrp neste experimento, para cada poço.
12. Incubar a placa por 1 hora em temperatura ambiente.
13. Após a incubação, passe a placa sobre uma pia e depois lave a placa com PBS contendo 1% de Interpol-20.

Detecção

14. Adicione 100 μL do substrato indicador (3,3',5,5'-tetramebenzidina (TMB)) a uma concentração de 1 mg/mL para cada poço.
15. Incubar a placa com o substrato por 5-10 min em temperatura ambiente.
16. Após 10 min, pare a reação enzimática adicionando 100 μL 2N ácido sulfúrico (H₂SO₄).
    Dentro de 30 minutos de adicionar a solução stop, leia a placa usando um leitor de microplacas a 405 nm para determinar a absorvância dos poços.

2. Sanduíche ELISA

Nesta versão ELISA, a amostra experimental é "sanduíche" entre um anticorpo de captura não conjugado e um anticorpo de detecção conjugado, ambos específicos para a mesma proteína, mas em epítopos diferentes. No exemplo elisa sanduíche a seguir, a concentração de TNFα humano foi determinada em amostra desconhecida usando uma curva padrão gerada a partir da diluição serial de 2,5X de um TNFα humano padrão e recombinante conhecido (indicando na concentração de 75 pg/mL).

Revestimento captura anticorpo para a microplacão

1. Cubra os poços de uma placa ELISA de 96 poços com anticorpo de captura purificado adicionando 100 μL de anticorpo de captura (1-10 μg/mL de alcance) a cada poço da placa.
2. Cubra a placa com uma tampa de placa adesiva e incuba-a durante a noite a 4°C.
3. Após a incubação, remova a solução de revestimento da placa, jogando a placa sobre uma pia.

Bloqueio

4. Bloqueie os locais de ligação de proteína restantes nos poços revestidos de anticorpos adicionando 200 μL de solução de bloqueio, 5% de leite seco sem gordura contendo PBS, aos poços.
5. Incubar por pelo menos 2 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C.
6. Após a incubação, remova o tampão de bloqueio apertando a placa e, em seguida, lave a placa com PBS contendo 1% de Interpol-20.

Adicionar amostras de teste contendo antígenos

7. Adicione 100 μL da amostra de ensaio aos poços. Sele a placa com uma tampa adesiva.
8. Incubar por 1-2 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C.
9. Após a incubação, remova as amostras movendo a placa sobre a pia e, em seguida, lave os poços com 200 μL 1X PBS contendo 1% de Interpol-20.

Adicionar anticorpo de detecção conjugado por enzimas

10. Adicione 100 μL de anticorpo de detecção conjugado com enzimas aos poços em uma concentração pré-otimizada.
11. Sele a placa com uma tampa adesiva e incubar em temperatura ambiente por 2h.
12. Remova o anticorpo de detecção sem saída, movendo a placa sobre uma pia e lave os poços com 200 μL 1X PBS contendo 1% de Interpol-20.

Detecção

13. Adicione 100 μL do substrato indicador a uma concentração de 1 mg/mL. Qualquer anticorpo de detecção conjugado por enzimas ligadas converterá o substrato em um sinal detectável.
14. Incubar a placa por 5-10 min em temperatura ambiente.
15. Após 5-10 min, pare a reação enzimática adicionando 100 μL 2N H₂SO₄ aos poços. Dentro de 30 minutos de adicionar a solução stop, leia a placa usando um leitor de microplacão para determinar a absorção dos poços.

3. ELISA competitiva

As etapas de um ELISA competitivo são diferentes das utilizadas em ELISA indireta e sanduíche, sendo a principal diferença a etapa de vinculação competitiva entre o antígeno amostral e o antígeno "add-in". O antígeno amostra é incubado com o anticorpo primário não rotulado. Estes complexos anticorpos-antígenos são então adicionados à placa ELISA, que foi pré-revestida com o mesmo antígeno. Após um período de incubação, qualquer anticorpo desvinculado é lavado. Há uma correlação inversa entre a quantidade de anticorpos livres disponíveis para ligar o antígeno no poço e a quantidade de antígeno na amostra original. Por exemplo, uma amostra com antígeno abundante teria mais complexos de anticorpos primários de antígeno, deixando pouco anticorpo desvinculado para se ligar à placa ELISA. Um anticorpo secundário conjugado por enzimas específico para o anticorpo primário é então adicionado aos poços, seguido pelo substrato.

Revestimento de antígeno para a microplacão

1. Cubra os poços de uma placa ELISA de 96 poços com 100 μL de antígeno purificado a uma concentração de 1-10 μg/mL.
2. Cubra a placa com uma tampa de placa adesiva e incubar a placa durante a noite a 4°C.
3. Após a incubação, remova a solução de antígeno desvinculada dos poços, sacudindo a placa sobre uma pia.

Bloqueio

4. Bloqueie os locais de ligação de proteína restantes nos poços revestidos adicionando 200 μL de tampão de bloqueio a cada poço, que pode ser 5% de leite seco não gordo ou BSA em PBS.
5. Incubar a placa por pelo menos 2 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C.

Amostra de incubação (antígeno) com o anticorpo primário

6. Ao bloquear os poços, prepare a mistura de anticorpos de antígeno misturando antígeno de amostra de 150 μL e 150 μL de anticorpo primário para cada poço no ensaio.
7. Incubar esta mistura por 1h a 37°C.

Adicione mistura de anticorpos de antígeno ao poço

8. Agora, remova o tampão de bloqueio dos poços, jogando a placa sobre uma pia.
9. Em seguida, lave os poços com 1X PBS contendo Interpol-20.
10. Adicione 100 μL da mistura de anticorpos antígenos-primários.
11. Incubar a placa a 37°C por 1h.
12. Remova a mistura de amostra, movendo a placa sobre uma pia.
13. Em seguida, lave os poços com 1X PBS contendo 1% de Interpol-20 para remover qualquer anticorpo desvinculado.

Adicione o anticorpo secundário

14. Adicione 100 μL de um anticorpo secundário conjugado enzimático, que neste caso é anticorpo conjugado ap, a cada poço.
15. Incubar a placa por 1h a 37°C.
16. Após a incubação, lave a placa com 1X PBS contendo 1% de Interpol-20.

Detecção

17. Adicione 100 μL da solução do substrato a cada poço.
18. Espere 5-10 min.
19. Após 10 minutos, pare a reação enzimática adicionando 100 μL 2N de ácido sulfúrico aos poços. Em seguida, meça a absorvância em um leitor de microplacão dentro de 30 minutos de adicionar a solução stop