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Advanced Biology

Geração de anticorpos: produzindo anticorpos monoclonais usando hibridomas

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Immunology

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Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

5.5: Immunohistochemistry and Immunocytochemistry: Tissue Imaging via Light Microscopy

5.7: Immunofluorescence Microscopy: Immunofluorescence Staining of Paraffin-Embedded Tissue Sections

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13:21 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3e Thomas S. Griffith^1,2,3,4
¹ Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Imunologia e Biologia do Câncer, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Centro de Imunologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Departamento de Urologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Centro de Câncer Maçônico, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Anticorpos policlonais são definidos como uma coleção de anticorpos direcionados contra diferentes determinantes antigênicos de um antígeno ou vários antígenos (1). Embora os anticorpos policlonais sejam ferramentas poderosas para identificar moléculas biológicas, há uma limitação importante – eles são incapazes de distinguir entre antígenos que compartilham determinantes antigênicos. Por exemplo, quando a albumina de soro bovino é usada para imunizar um animal, células B com diferentes ig de superfície responderão a diferentes determinantes antigênicos na albumina de soro bovino. O resultado é uma mistura de anticorpos no antissoro. Como o álbum de soro bovino compartilha alguns epítopos com albumina de soro humano em regiões evolutivamente conservadas da proteína, este antissoro anti-bovino também reagirá com a albumina de soro humano. Portanto, este antissoro não será útil para distinguir entre albuminas bovinas e humanas.

Várias abordagens foram tomadas para superar a questão da especificidade da antisera policlonal. Uma delas é absorver os anticorpos indesejados passando o antiserum através de uma coluna de cromatografia de antígenos imobilizados (2). Este método é tedioso e frequentemente incapaz de remover completamente os anticorpos indesejados. Outra abordagem é isolar células B produtoras de anticorpos individuais e expandi-las na cultura. No entanto, como a maioria das células não transformadas normais, as células B não sobrevivem na cultura de longo prazo.

Para superar a incapacidade das células B de sobreviver na cultura, uma abordagem é preparar um híbridoma de células mieloma-B. Em 1847, Henry Bence-Jones descobriu que pacientes com mieloma múltiplo, um tumor linfoide, produziam uma grande quantidade de anticorpos (3). As células B nesses pacientes tornaram-se malignas e crescem incontrolavelmente. Uma vez que as células B malignas são derivadas de um único clone, elas são idênticas e produzem apenas um único tipo de anticorpo (ou seja,um anticorpo monoclonal, ou mAb). No entanto, a maioria dessas células de mieloma produz anticorpos de especificidades desconhecidas. Em 1975, ao fundir uma célula de mieloma a uma célula B, Cesar Milstein e Georges Kohler conseguiram produzir um hibridoma que pode ser cultivado indefinidamente in vitro e produz um número ilimitado de anticorpos monoclonais de especificidade antigênica conhecida (4). A lógica por trás de sua abordagem é combinar as propriedades imortais da célula de mieloma e as propriedades produtoras de anticorpos da célula B. Sua técnica revolucionou a produção de anticorpos e fornece um meio poderoso para identificação e purificação de moléculas biológicas usando anticorpos monoclonais.

Geralmente, preparar um anticorpo monoclonal requer vários meses. O procedimento geral inclui as seguintes etapas:

Imunização e triagem de titer de anticorpos
Fusão de células B produtoras de anticorpos e células de mieloma
Crescimento seletivo do hybridoma
Triagem dos híbridos para produzir o anticorpo monoclonal desejado
Clonagem limitando a diluição – um processo pelo qual as células são diluídas a uma concentração para permitir estatisticamente que menos de 1 célula seja adicionada aos poços de uma placa de 96 poços. Alguns poços acabarão com 0 células e outros terão 1 célula. Os poços com semeadas com 1 célula eventualmente crescerão em uma população monoclonal de células.
Crescimento do hibridoma e preparação de anticorpo monoclonal

Este protocolo se concentra na última etapa – crescimento do hibridoma e preparação do anticorpo monoclonal. O anticorpo é purificado da cultura supernascida pela precipitação de sulfato de amônio (muitas vezes referido como salgadinho) – um método comumente usado para remover proteínas de uma solução. Proteínas em solução formam ligações de hidrogênio, juntamente com outras interações hidrofílicas, com a água através de seus grupos polares e iônicos expostos. Quando são adicionadas concentrações de íons pequenos e altamente carregados (como amônio ou sulfato), esses grupos competem com as proteínas para a ligação à água. Isso remove as moléculas de água da proteína e diminui sua solubilidade, resultando na precipitação da proteína.

Procedure

Nota: A técnica de cultura celular estéril deve ser mantida ao manusear as células hibridoma e a mídia de forma estéril (por exemplo, em um armário de biossegurança) até que a purificação de anticorpos se estéreo se estéreo.

1. Descongelamento de células híbridas congeladas

Incubar o frasco contendo as células híbridas congeladas em um banho de água de 37°C até apenas descongelar (aproximadamente 2 minutos).
Adicione as células descongeladas a um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de RPMI completo (RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 u/mL penicilina, 100 μg/mL streptomicina, piruvato de sódio 1mM, 1x aminoácidos não essenciais, 50 μM 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES).
Centrifugar por 5 min a 1200 RPM para lavar qualquer mídia congelante contaminante.
Após a centrifugação, descarte o supernanato líquido e resuspenque a pelota celular em RPMI completo de 5 mL. Em seguida, adicione as células a um frasco de cultura tecidual T75 contendo RPMI completo de 15 mL (o volume final de RPMI é de 20 mL).
Cultivar as células em uma incubadora padrão a 37°C com 5% de CO₂. As células não são aderentes enquanto estão na cultura.

2. Expansão hybridoma

Permita que as células se expandam por aproximadamente 3 dias até que o frasco seja ~80% confluente.
Nota: Esse tempo pode variar de acordo com o número inicial de células, bem como diferenças inerentes nas taxas de crescimento de diferentes células. É importante que as células estejam em fase de crescimento exponencial.
Uma vez que o frasco inicial atinja ~80% de confluência, remova as células deste frasco inicial de T75, coloque em um tubo de centrífuga cônica e gire (1200 RPM por 5 minutos) para pelotar as células.
Resuspenque as células em 6 mL de RPMI completo e, em seguida, distribua a suspensão da célula em três novos frascos T75 (frasco de 2 mL/frasco contendo 18 mL RPMI). Incubar esses três frascos T75 a 37°C com 5% de CO₂ até que sejam ~80% confluentes (Isso deve levar aproximadamente 3 dias).

3. Produção de anticorpos em meio livre de soro

Nota: Neste ponto, as células estão prontas para continuar seu crescimento em um meio livre de soro projetado para o crescimento de linhas celulares hybridoma. Neste protocolo, utilizamos o meio HB Basal Liquid pronto e comercialmente disponível contendo o Produto Hb101 Suplemento HB101.

As células de cada um dos três frascos T75 (a ~80% de confluência) são coletadas e centrífugas (1200 RPM por 5 min).
A pelota celular de cada frasco T75 é resuspended em 10 mL complementado hb101 meio sem soro e, em seguida, adicionado a dois frascos T225 complementados HB101 sem soro médio (ou seja, suspensão de célula de 5 mL em cada um dos 6 frascos contendo ~220-240 mL HB101 em cada frasco).
Continue crescendo as células em frascos T225 e mídia HB101 a 37°C com 5% de CO₂ por três semanas, ou até que as células comecem a morrer. As células estão produzindo mAb durante essas 3 semanas e secretando-a no meio da cultura. Uma vez que as células estão começando a morrer, elas não estão mais produzindo qualquer mAb.

4. Purificação de Anticorpos – Dia 1

Nota: Neste ponto, a esterilidade não precisa ser mantida, portanto, lidar com a mídia de forma estéril (por exemplo, em um armário de biossegurança) não é necessário. Além disso, os híbridos não são considerados um agente de “nível BSL2”.

Despeje a mídia dos frascos em tubos para um rotor de ângulo fixo. Gire os tubos em uma centrífuga com um rotor de ângulo fixo a 10.000 RPM por 8 minutos. Esta etapa foi projetada para remover os detritos celulares da cultura supernante.
Nota: Os tamanhos do tubo podem variar dependendo do rotor utilizado. O importante a lembrar é ter o mesmo volume nos tubos para garantir que o rotor esteja devidamente equilibrado antes da centrifugação. É provável que todo o volume da mídia não se encaixe na centrífuga de uma só vez. As demais mídias serão centrifugadas mais tarde (passo 4.5) usando os mesmos tubos.
Prepare um béquer de plástico 2L com uma barra de agitação em um balde cercado de gelo. Coloque em um prato de agitação.
Conecte uma parte superior do filtro de 500 mL em uma garrafa 1L. Conecte a unidade do filtro superior da garrafa ao vácuo da casa através de tubos apropriados.
Despeje o supernatante da etapa 4.1 (que ainda contém o mAb produzido pelas células hibridoma) na parte superior do filtro.
Continue usando o mesmo conjunto de tubos para pelotas detritos celulares da mídia (a pelota continuará a ser construída). Aguarde para executar o vácuo até que a parte superior do filtro esteja cheia e outro lote de supernaspeso esteja pronto para entrar. Não deixe o filtro secar ou a filtragem ficará muito lenta.
Quando a garrafa 1L estiver perto do máximo, remova a parte superior do filtro e despeje o supernatante em béquer 2L preparado na etapa 4.2. Recoloque a parte superior do filtro. Acompanhe o volume.
Repita as etapas de centrifugação e filtragem até que toda a mídia seja processada.
Meça 295g de sulfato de amônio por 1L de supernanato filtrado coletado. Enquanto mexe, adicione lentamente o sulfato de amônio ao supernascente nas próximas duas horas (~25 g a cada 15 minutos) para evitar uma alta concentração localizada de sal de sulfato de amônio que pode causar a precipitação de proteínas indesejadas.
Uma vez que todo o sulfato de amônio tenha sido adicionado, cubra o béquer com papel alumínio e mova-se com a placa de agitação a 4°C (por exemplo, geladeira walk-in ou sala fria). Mexa durante a noite. A agitação constante da solução é necessária para solubilizar o sal, mas a agitação prolongada pode levar à desnaturação de proteínas na solução na interface superfície/ar.
Lave os tubos usando o rotor de ângulo fixo.

5. Purificação de Anticorpos – Dia 2

Despeje o sulfato de amônio contendo supernanato do béquer 2L em tubos para um rotor de ângulo fixo. Gire em centrífuga com rotor de ângulo fixo a 6500 RPM por 20 minutos sem freio.
Aspirar o aspirador, tomando cuidado para não sugar a pelota, pois ela será macia. Continue usando o mesmo conjunto de tubos para coletar pelotas do sulfato de amônio contendo supernanato.
Após a última aspiração, resuspenda cada pelota (que contém anticorpos) em ~1 ml PBS.
Remova o sulfato de amônio da solução mAb precipitada por diálise contra grandes volumes de PBS. Para isso, primeiro cortei aproximadamente 1 polegada de tubo de diálise (por exemplo, Membra-Cel MD25-14 MWCO 12.000-14.000 Dalton corte de tubos de diálise de celulose) para cada mL de solução mAb. Molhe a tubulação com dH₂O. Amarre um nó em uma extremidade da tubulação e encha com dH₂O para verificar se o nó não vaza. DH_{vazio 2}O da tubulação.
Solução pipeta PBS/anticorpos na tubulação. Enxágüe os tubos com um PBS adicional de 0,25 ml e transfira para a tubulação.
Fixar a parte superior da tubulação o mais perto possível da solução com um clipe de diálise laranja.
Tape a parte superior da tubulação na parte externa de um béquer 4L. Deixe a parte cheia da tubulação pendurada no béquer. Encha o béquer com PBS e adicione uma barra de mexida.
Mexa durante a noite por ~8 horas a 4°C.
Substitua o PBS no béquer por PBS fresco e mexa por ~8 horas mais duas vezes.
Transfira o anticorpo da tubulação para tubos cônicos de 15 ou 50 ml. Centrifugar por 5 minutos a 1200 RPM para remover qualquer precipitado que possa ter se formado. Transfira o supernatante para um tubo fresco.
Diluir uma alíquota de anticorpo 1:20 com PBS (anticorpo de 5 μl + 95 μl PBS). Quantita a concentração de anticorpos com um espectotômetro (em branco com PBS) a 280 nm. Use um coeficiente de extinção (ε) de 1,43. A concentração é calculada como
Aliquotar o anticorpo em frascos de tampa de parafuso e armazenar a -80°C.

Os anticorpos são uma poderosa ferramenta para pesquisa e diagnóstico, o que significa que produzi-los em grandes quantidades é muitas vezes necessário.

O primeiro passo para gerar anticorpos é injetar o antígeno de interesse em um animal hospedeiro. O antígeno ativa as células B do hospedeiro que, em seguida, produzem e liberam anticorpos específicos desse antígeno. Em seguida, é realizada a triagem regular da antisera do animal hospedeiro para a presença do anticorpo alvo, utilizando ELISA ou outro método de detecção. Uma vez detectado, o baço do animal hospedeiro, que contém as células B, é removido. Se todas as células B do baço estão agora isoladas, isso deve incluir uma população que está secretando anticorpos ao antígeno de interesse. Nós nos referimos a esta população como policlonal, porque cada célula provavelmente ligada a um epítope diferente do antígeno, e, portanto, gerou seu próprio anticorpo individual e único.

Para gerar anticorpos monoclonais, anticorpos levantados para reconhecer um epítope específico, a célula B individual que produz o anticorpo desejado deve primeiro ser isolada e cultivada. Infelizmente, as células B não sobrevivem bem na cultura. Então, para superar esse obstáculo, os cientistas fundem células B com células imortais de mieloma, resultando em hibridomas. Essas células são então cultivadas em um meio seletivo que só permite que os híbridos cresçam e liberem anticorpos. Novamente, o meio é examinado usando um método como o ELISA para o anticorpo desejado. Uma vez detectados, os híbridos são clonados através de um processo chamado diluição limitante, uma diluição serial da cultura dos pais, o que deve resultar em células únicas sendo semeadas nos poços de uma placa de triagem. Isso permite o crescimento de hibridomas a partir de uma célula mãe solteira, produzindo uma linha celular monoclonal que só libera o anticorpo desejado. Essas linhas monoclonais podem ser expandidas em frascos de cultura tecidual para produzir grandes quantidades de anticorpo monoclonal. Depois disso, à medida que as células começam a morrer, os anticorpos podem ser precipitados a partir do meio com sulfato de amônio. Normalmente, em solução, os anticorpos interagem com a água através de interações hidrofílicas. No entanto, amônio e sulfato são íons altamente carregados que separam as moléculas de água dos anticorpos, diminuindo a solubilidade dos anticorpos e fazendo com que eles precipitam.

Para começar, primeiro verifique a lista de materiais e prepare todas as mídias, suprimentos e superfícies de trabalho para o protocolo.

Em seguida, ligue um banho de água e coloque-o a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 10 mililitros de RPMI completo a um tubo cônico de 15 mililitros e 15 mililitros de RPMI completo a um frasco de cultura celular T75 e reserve-os. Usando cautela e usando os equipamentos de proteção individual apropriados, remova o frasco congelado contendo células hibridoma do armazenamento de nitrogênio líquido. Para liberar a pressão dentro do frasco, solte ligeiramente a tampa. Agora, incuba cuidadosamente o frasco no banho de água, certificando-se de que a tampa permaneça acima da superfície da água para minimizar as chances de contaminação. Quando as células estão quase descongeladas, o que normalmente leva cerca de dois minutos, mova o frasco para a capa da cultura tecidual.

Em seguida, limpe o lado de fora do frasco com 70% de etanol antes de remover a tampa. Usando uma pipeta estéril, transfira as células para o tubo cônico que contém 10 mililitros de meio RPMI completo. Em seguida, centrifugar o tubo por cinco minutos a 1200 RPM. Após a centrifugação, mova o tubo de volta para a capa de tecido e limpe o lado de fora do tubo com etanol. Sem perturbar a pelota, descarte o supernasce e adicione cinco mililitros de rpmi completo fresco médio e suavemente pipeta para cima e para baixo para resuspend. Em seguida, transfira as células para o frasco de cultura celular T75 e coloque o frasco dentro de uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius. Permita que as células atinjam aproximadamente 80% de confluência, o que geralmente leva cerca de três dias. Observe que as células hybridoma não são aadeentes e crescerão suspensas no meio. O tempo para alcançar confluência suficiente pode variar de acordo com o número inicial de células vivas e o tipo de célula hybridoma utilizada.

Uma vez que as células sejam suficientemente confluentes, use uma pipeta estéril de 25 mililitros para transferi-las do frasco de cultura para um tubo de centrífuga cônica. Pelota as células por centrifugação a 1200 RPM por cinco minutos. Enquanto as células estão na centrífuga, adicione 18 mililitros de RPMI completos em cada um dos três novos frascos de cultura celular T75 e reserve-os. Após a centrifugação, remova o supernasce e ressuspenque suavemente a pelota da célula em seis mililitros de RPMI completo. Em seguida, adicione dois mililitros da suspensão celular em cada um dos três novos frascos de cultura celular. Por fim, coloque os frascos em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius e incubar até que os frascos estejam cerca de 80% confluentes, aproximadamente três dias.

Neste ponto, as células estão prontas para continuar seu crescimento no meio livre de soro projetado para linhas de células hibridoma, como o meio HB Basal Liquid disponível comercialmente contendo o suplemento HB101. Transfira as células de cada frasco de cultura celular em tubos cônicos centrífugas e, em seguida, pelota as células por centrifugação a 1200 RPM por cinco minutos. Agora, adicione 230 mililitros de meio hb101 sem soro suplementado em cada um dos seis frascos de cultura celular de 225 centímetros quadrados e reserve-os. Quando a centrifugação estiver completa, remova o supernasal e resuspenda cada pelota em 10 mililitros de meio HB101 suplementado. Em seguida, em cada frasco de cultura celular, adicione cinco mililitros da suspensão celular. Coloque os frascos na incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius e continue cultivando as células por cerca de três semanas. Durante este tempo, as células produzirão e liberarão o anticorpo monoclonal de interesse no meio da cultura e o anticorpo estará pronto para purificação quando as células começarem a morrer.

Para remover os detritos celulares dos meios culturais contendo anticorpos, despeje o conteúdo dos frascos de cultura em tubos para um rotor de ângulo fixo. Coloque os tubos no rotor e certifique-se de que está devidamente equilibrado antes da centrifugação. Gire os tubos a 10.000 RPM por oito minutos. Enquanto as amostras estão centrifugando, coloque um béquer de plástico de dois litros com uma barra de agitação em um balde de gelo e, em seguida, coloque o balde de gelo em uma placa de agitação.

Em seguida, conecte uma tampa de filtro de 500 mililitros a uma garrafa de um litro. Conecte esta unidade de filtro superior da garrafa a um vácuo doméstico usando o tubo apropriado. Em seguida, despeje o supernatante que contém o anticorpo na parte superior do filtro. Centrifugar a mídia restante para separar os detritos celulares do supernanato contendo anticorpos. Quando a parte superior do filtro estiver cheia de sobrenassite, inicie o vácuo. Em seguida, quando a garrafa de coleta de um litro estiver perto de cheia, remova a parte superior do filtro e despeje o supernatante filtrado no béquer de dois litros no gelo. Repita as etapas de filtragem até que todo o sobrenatante seja processado.

Quando toda a amostra for processada, pesar 295 gramas de sulfato de amônio por um litro de supernanato filtrado. Inicie a placa de mexida e adicione lentamente o sulfato de amônio ao sobrenatante nas próximas duas horas. Isso evita uma alta concentração localizada de sal de sulfato de amônio que pode causar a precipitação de proteínas indesejadas. Uma vez que todo o sulfato de amônio tenha sido adicionado, cubra o béquer com papel alumínio e mova-o, juntamente com a placa de agitação, para uma sala fria a quatro graus Celsius e coloque-o para agitar a solução de anticorpos durante a noite.

Na manhã seguinte, despeje a solução de anticorpos contendo sulfato de amônio do béquer de dois litros em tubos limpos para o rotor de ângulo fixo. Centrifugar os tubos a 6500 RPM por 20 minutos sem quebrar para pellet o anticorpo na parte inferior dos tubos. Em seguida, aspirar o aspirador de vácuo, usando cautela para não sugar a pelota macia. Continue usando o mesmo conjunto de tubos para coletar o anticorpo pelleted do restante do sulfato de amônio contendo supernanato. Após a última aspiração, suspenda cada pelota de anticorpo em aproximadamente um mililitro da PBS.

Para remover o sulfato de amônio da solução de anticorpos, primeiro corte aproximadamente uma polegada de tubo de diálise para cada mililitro de solução de anticorpos. Em seguida, limpe a tubulação com água destilada e amarre um nó em uma extremidade da tubulação. Encha a tubulação com água destilada para verificar se há vazamento do nó. Se não houver vazamento depois de alguns minutos, esvazie a água da tubulação.

Em seguida, pipeta a solução de anticorpos para a tubulação. Para recuperar o máximo de anticorpos possível, enxágue os tubos com um adicional de 0,25 mililitros de PBS e transfira isso para a tubulação também. Fixar a parte superior da tubulação o mais perto possível da solução com um clipe de diálise. Em seguida, tape a parte superior da tubulação na parte superior externa de um béquer de quatro litros com a porção cheia da tubulação pendurada no béquer. Agora, leve o béquer para a sala fria de quatro graus Celsius e coloque-o em uma placa de agitação. Encha o béquer até a parte superior com PBS e adicione uma barra de mexida. Deixe o tubo e a solução mexerem durante a noite por aproximadamente oito horas. Na manhã seguinte, substitua o PBS no béquer por PBS fresco e deixe o béquer para mexer novamente por aproximadamente oito horas. Mais tarde naquela noite, repita o processo uma última vez. Pela manhã, abra o tubo de diálise e transfira a solução de anticorpos da tubulação para tubos cônicos de 15 mililitros. Para remover qualquer precipitante que possa ter se formado durante a diálise, centrifugar os tubos por cinco minutos a 1200 RPM. Finalmente, transfira o supernatante para tubos frescos.

Para quantificar a concentração de anticorpos, primeiro faça uma diluição de 20 vezes adicionando cinco microliters de uma alíquota de anticorpos a 95 microliters de PBS. Em seguida, pipete o anticorpo diluído em uma cuvette e use um espectotúmetro para registrar a concentração em 280 nanômetros. Em seguida, calcule a concentração de anticorpos usando a fórmula mostrada. Por fim, rotule os frascos da tampa do parafuso com o nome do anticorpo, concentração, data de preparação e, se aplicável, número do lote e nome do experimentador, e, em seguida, aliquotar o anticorpo nos frascos de tampa de parafuso rotulado. Estes podem ser armazenados a menos 80 graus Celsius até que seja necessário.

Os rendimentos de exemplo usando a linha de híbridos anti-mouse 120G8 CD317 ou PDCA-1 variaram entre 44 e 99,6 miligramas, o que normalmente rende, em média, 67,3 miligramas. É importante notar que cada produção executada com a mesma linha híbridama pode ser ligeiramente diferente na quantidade de anticorpo monoclonal disponível no final.

Results

Utilizando este protocolo, obtivemos os seguintes resultados com vários híbridos diferentes:

Hybridoma: RB6-BC5 (rato anti-mouse Ly6C/Ly6G (Gr1) IgG2b, κ mAb)
OD₂₈₀ – 1.103
(1.103/1.43) (20) = 15,42 mg/mL

Hybridoma: GK1.5 (rato anti-mouse CD4 IgG2b, κ mAb)
OD₂₈₀ – 0.485
(0.485/1.43) (20) = 6,78 mg/mL

Hybridoma: 2.43 (rato anti-mouse CD8 IgG2b, κ mAb)
OD₂₈₀ – 0.209
(0.209/1.43) (20) = 2,92 mg/mL

Estes são todos resultados de exemplo, e é importante notar que cada produção executada com o mesmo hybridoma pode ser ligeiramente diferente na quantidade de mAb disponível no final.

Applications and Summary

O procedimento descrito acima é uma maneira simples e direta de purificar anticorpos monoclonais da supernata da cultura hibrida. É importante lembrar, porém, que o sulfato de amônio precipitará outras proteínas que podem estar na cultura supernascida. Consequentemente, as concentrações de anticorpos determinadas a partir das medidas de absorção são estimativas. O usuário pode querer avaliar a pureza da amostra dialisada executando uma pequena quantidade em um gel de poliacrilamida SDS. O mAb produzido por um híbrido, uma vez purificado usando essa metodologia, pode ser usado de várias maneiras. Os mais descritos RB6-BC5, GK1.5 e 2,43 mAb são comumente usados para esgotamento in vivo de células Nêufilas, CÉLULAS CD4 T e CD8 T, respectivamente, em camundongos. Outros mAb produzidos e purificados usando este protocolo podem ser usados para citometria de fluxo (quando conjugado a um fluorohore ou em conjunto com um Ab secundário), ELISA ou mancha ocidental.

References

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Köhler G and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature. 256, 495-497 (1975).

Transcript

Antibodies are a powerful tool for research and diagnosis, which means producing them in large quantities is often necessary.

The first step to generating antibodies is to inject the antigen of interest into a host animal. The antigen activates the host’s B-cells which then produce and release antibodies specific to that antigen. Then, regular screening of the host animal’s antisera for the presence of the target antibody is carried out, using ELISA or another detection method. Once it’s detected, the host animal’s spleen, which contains the B-cells, is removed. If all of the B-cells from the spleen are now isolated, this should include a population which are secreting antibodies to the antigen of interest. We refer to this population as polyclonal, because each cell likely bound to a different epitope of the antigen, and therefore, generated its own individual and unique antibody.

To generate monoclonal antibodies, antibodies raised to recognize one specific epitope, the individual B-cell that produces the desired antibody must first be isolated and cultured. Unfortunately, B-cells do not survive well in culture. So to overcome this hurdle, scientists fuse B-cells with immortal myeloma cells, resulting in hybridomas. These cells are then grown in a selective medium that only allows the hybridomas to grow and release antibodies. Again, the medium is screened using a method such as ELISA for the desired antibody. Once it is detected, the hybridomas are cloned via a process called limiting dilution, a serial dilution of the parent culture, which should result in single cells being seeded into the wells of a screening plate. This allows growth of hybridomas from a single parent cell, yielding a monoclonal cell line that only releases the desired antibody. These monoclonal lines can be expanded in tissue culture flasks to produce large quantities of monoclonal antibody. After this, as the cells begin to die off, the antibodies can be precipitated from the medium with ammonium sulfate. Normally, in solution, antibodies interact with water through hydrophilic interactions. However, ammonium and sulfate are highly-charged ions that separate the water molecules from the antibodies, decreasing the solubility of the antibodies and causing them to precipitate.

To begin, first check the list of materials and prepare all the media, supplies, and work surfaces for the protocol.

Then, turn on a water bath and set it to 37 degrees Celsius. Next, add 10 milliliters of complete RPMI to a 15-milliliter conical tube and 15 milliliters of complete RPMI to a T75 cell culture flask and set them aside. Using caution and wearing the appropriate personal protective equipment, remove the frozen vial containing hybridoma cells from the liquid nitrogen storage. To release the pressure inside the vial, loosen the cap slightly. Now, carefully incubate the vial in the water bath, making sure that the cap remains above the water surface to minimize the chances of contamination. When the cells are almost thawed, which typically takes around two minutes, move the vial to the tissue culture hood.

Then, wipe the outside of the vial with 70% ethanol before removing the cap. Using a sterile pipette, transfer the cells into the conical tube that contains 10 milliliters of complete RPMI medium. Then, centrifuge the tube for five minutes at 1200 RPM. After centrifugation, move the tube back to the tissue hood and wipe the outside of the tube with ethanol. Without disturbing the pellet, discard the supernatant and then add five milliliters of fresh complete RPMI medium and gently pipette up and down to resuspend. Next, transfer the cells to the T75 cell culture flask and place the flask inside a 5% carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius. Allow the cells to reach approximately 80% confluency, which usually takes about three days. Notice that hybridoma cells are nonadherent and will grow suspended in the medium. The time to reach sufficient confluency may vary based on the starting number of live cells and the type of hybridoma cell used.

Once the cells are sufficiently confluent, use a sterile 25-milliliter pipette to transfer them from the culture flask into a conical centrifuge tube. Pellet the cells by centrifugation at 1200 RPM for five minutes. While the cells are in the centrifuge, add 18 milliliters of complete RPMI into each of three new T75 cell culture flasks and set these aside. After centrifugation, remove the supernatant and gently resuspend the cell pellet in six milliliters of complete RPMI. Next, add two milliliters of the cell suspension into each of the three new cell culture flasks. Finally, place the flasks into an incubator set to 5% carbon dioxide and 37 degrees Celsius and incubate until the flasks are around 80% confluent, approximately three days.

At this point, the cells are ready to continue their growth in the serum-free medium designed for hybridoma cell lines, such as commercially-available HB Basal Liquid medium containing the HB101 supplement. Transfer the cells from each cell culture flask into conical centrifuge tubes and then pellet the cells by centrifugation at 1200 RPM for five minutes. Now, add 230 milliliters of supplemented HB101 serum-free medium into each of six 225-centimeter-squared cell culture flasks and set them aside. When centrifugation is complete, remove the supernatant and resuspend each pellet in 10 milliliters of supplemented HB101 medium. Then, into each cell culture flask, add five milliliters of the cell suspension. Place the flasks in the 5% carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius and continue growing the cells for about three weeks. During this time, the cells will produce and release the monoclonal antibody of interest into the culture medium and the antibody will be ready for purification when the cells start to die.

To remove the cellular debris from the antibody-containing culture media, pour the contents of the culture flasks into tubes for a fixed angle rotor. Place the tubes in the rotor and make sure it is properly balanced prior to centrifugation. Spin the tubes at 10,000 RPM for eight minutes. While the samples are centrifuging, place a two-liter plastic beaker with a stir bar into an ice bucket and then put the ice bucket on a stir plate.

Next, attach a 500-milliliter filter top to a one-liter bottle. Attach this bottle top filter unit to a house vacuum using the appropriate tubing. Then, pour the supernatant that contains the antibody into the filter top. Centrifuge the remaining media to separate the cell debris from the antibody-containing supernatant. When the filter top is full of supernatant, start the vacuum. Then, when the one-liter collection bottle is close to full, remove the filter top and pour the filtered supernatant into the two-liter beaker on ice. Repeat the filtration steps until all of the supernatant is processed.

When all of the sample has been processed, weigh 295 grams of ammonium sulfate per one liter of filtered supernatant. Start the stir plate and slowly add the ammonium sulfate to the supernatant over the next couple of hours. This prevents a localized high concentration of ammonium sulfate salt that may cause unwanted proteins to precipitate. Once all of the ammonium sulfate has been added, cover the beaker with foil and move it, along with the stir plate, to a cold room at four degrees Celsius and set it to stir the antibody solution overnight.

The next morning, pour the ammonium sulfate-containing antibody solution from the two-liter beaker into clean tubes for the fixed angle rotor. Centrifuge the tubes at 6500 RPM for 20 minutes without break to pellet the antibody at the bottom of the tubes. Next, vacuum aspirate the supernatant, using caution not to suck up the soft pellet. Continue using the same set of tubes to collect the pelleted antibody from the remainder of the ammonium sulfate-containing supernatant. After the last aspiration, re suspend each antibody pellet in approximately one milliliter of PBS.

To remove the ammonium sulfate from the antibody solution, first cut approximately one inch of dialysis tubing for each milliliter of antibody solution. Next, wipe the tubing with distilled water and tie a knot on one end of the tubing. Fill the tubing with distilled water to check for leakage from the knot. If there is no leakage after a few minutes, empty the water out of the tubing.

Next, pipette the antibody solution into the tubing. To recover as much antibody as possible, rinse the tubes with an additional 0.25 milliliters of PBS and transfer this to the tubing also. Secure the top of the tubing as close to the solution as possible with a dialysis clip. Then, tape the top of the tubing to the outside top of a four-liter beaker with the filled portion of the tubing hanging into the beaker. Now, take the beaker to the four degree Celsius cold room and place it onto a stir plate. Fill the beaker to the top with PBS and add a stir bar. Allow the tube and solution to stir overnight for approximately eight hours. The next morning, replace the PBS in the beaker with fresh PBS and then leave the beaker to stir again for approximately eight hours. Later that evening, repeat the process one final time. In the morning, open up the dialysis tube and then transfer the antibody solution from the tubing to 15-milliliter conical tubes. To remove any precipitant that may have formed during dialysis, centrifuge the tubes for five minutes at 1200 RPM. Finally, transfer the supernatant to fresh tubes.

To quantify the antibody concentration, first make a 20-fold dilution by adding five microliters from an antibody aliquot to 95 microliters of PBS. Then, pipette the diluted antibody into a cuvette and use a spectrophotometer to record the concentration at 280 nanometers. Next, calculate the antibody concentration using the formula shown. Finally, label screw cap vials with the antibody name, concentration, date of preparation, and, if applicable, batch number and experimenter name, and then aliquot the antibody into the labeled screw cap vials. These can be stored at minus 80 degrees Celsius until needed.

Example yields using the 120G8 anti-mouse CD317 or PDCA-1 hybridoma line ranged between 44 and 99.6 milligrams, which typically yields, on average, 67.3 milligrams amount. It is important to note that each production run with the same hybridoma cell line can be slightly different in the amount of monoclonal antibody available at the end.

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