Geração de anticorpos: produzindo anticorpos monoclonais usando hibridomas

Os anticorpos são uma ferramenta poderosa para pesquisa e diagnóstico, o que significa que produzi-los em grandes quantidades é frequentemente necessário.

O primeiro passo para gerar anticorpos é injetar o antígeno de interesse em um animal hospedeiro. O antígeno ativa as células B do hospedeiro, que então produzem e liberam anticorpos específicos para esse antígeno. Em seguida, é realizada uma triagem regular dos anti-soros do animal hospedeiro para a presença do anticorpo alvo, usando ELISA ou outro método de detecção. Uma vez detectado, o baço do animal hospedeiro, que contém as células B, é removido. Se todas as células B do baço estiverem agora isoladas, isso deve incluir uma população que está secretando anticorpos para o antígeno de interesse. Referimo-nos a essa população como policlonal, porque cada célula provavelmente se ligou a um epítopo diferente do antígeno e, portanto, gerou seu próprio anticorpo individual e único.

Para gerar anticorpos monoclonais, anticorpos criados para reconhecer um epítopo específico, a célula B individual que produz o anticorpo desejado deve primeiro ser isolada e cultivada. Infelizmente, as células B não sobrevivem bem em cultura. Então, para superar esse obstáculo, os cientistas fundem células B com células de mieloma imortais, resultando em hibridomas. Essas células são então cultivadas em um meio seletivo que permite que apenas os hibridomas cresçam e liberem anticorpos. Novamente, o meio é rastreado usando um método como ELISA para o anticorpo desejado. Uma vez detectados, os hibridomas são clonados por meio de um processo chamado diluição limitante, uma diluição em série da cultura original, que deve resultar em células únicas sendo semeadas nos poços de uma placa de triagem. Isso permite o crescimento de hibridomas a partir de uma única célula-mãe, produzindo uma linha celular monoclonal que libera apenas o anticorpo desejado. Essas linhagens monoclonais podem ser expandidas em frascos de cultura de tecidos para produzir grandes quantidades de anticorpos monoclonais. Depois disso, à medida que as células começam a morrer, os anticorpos podem ser precipitados do meio com sulfato de amônio. Normalmente, em solução, os anticorpos interagem com a água por meio de interações hidrofílicas. No entanto, o amônio e o sulfato são íons altamente carregados que separam as moléculas de água dos anticorpos, diminuindo a solubilidade dos anticorpos e fazendo com que precipitem.

Para começar, primeiro verifique a lista de materiais e prepare todas as mídias, suprimentos e superfícies de trabalho para o protocolo.

Em seguida, ligue um banho-maria e ajuste-o para 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 10 mililitros de RPMI completo a um tubo cônico de 15 mililitros e 15 mililitros de RPMI completo a um frasco de cultura de células T75 e reserve. Com cuidado e usando o equipamento de proteção individual apropriado, remova o frasco congelado contendo células de hibridoma do armazenamento de nitrogênio líquido. Para libertar a pressão no interior do frasco para injetáveis, desaperte ligeiramente a tampa. Agora, incube cuidadosamente o frasco em banho-maria, certificando-se de que a tampa permaneça acima da superfície da água para minimizar as chances de contaminação. Quando as células estiverem quase descongeladas, o que normalmente leva cerca de dois minutos, mova o frasco para a capa de cultura de tecidos.

Em seguida, limpe a parte externa do frasco com etanol a 70% antes de remover a tampa. Usando uma pipeta estéril, transfira as células para o tubo cônico que contém 10 mililitros de meio RPMI completo. Em seguida, centrifugue o tubo por cinco minutos a 1200 RPM. Após a centrifugação, mova o tubo de volta para a capa de tecido e limpe a parte externa do tubo com etanol. Sem perturbar o pellet, descarte o sobrenadante e, em seguida, adicione cinco mililitros de meio RPMI completo fresco e pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender. Em seguida, transfira as células para o frasco de cultura de células T75 e coloque o frasco dentro de uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius. Permita que as células atinjam aproximadamente 80% de confluência, o que geralmente leva cerca de três dias. Observe que as células do hibridoma não são aderentes e crescerão suspensas no meio. O tempo para atingir confluência suficiente pode variar de acordo com o número inicial de células vivas e o tipo de célula de hibridoma usada.

Quando as células estiverem suficientemente confluentes, use uma pipeta estéril de 25 mililitros para transferi-las do frasco de cultura para um tubo de centrífuga cônico. Pulverizar as células por centrifugação a 1200 RPM durante cinco minutos. Enquanto as células estão na centrífuga, adicione 18 mililitros de RPMI completo em cada um dos três novos frascos de cultura de células T75 e reserve. Após centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet celular em seis mililitros de RPMI completo. Em seguida, adicione dois mililitros da suspensão celular em cada um dos três novos frascos de cultura celular. Finalmente, coloque os frascos em uma incubadora ajustada para 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius e incube até que os frascos estejam cerca de 80% confluentes, aproximadamente três dias.

Neste ponto, as células estão prontas para continuar seu crescimento no meio sem soro projetado para linhagens celulares de hibridoma, como o meio HB Basal Liquid disponível comercialmente contendo o suplemento HB101. Transferir as células de cada balão de cultura celular para tubos de centrifugação cónicos e, em seguida, granular as células por centrifugação a 1200 RPM durante cinco minutos. Agora, adicione 230 mililitros de meio sem soro HB101 suplementado em cada um dos seis frascos de cultura de células de 225 centímetros quadrados e reserve. Quando a centrifugação estiver completa, remova o sobrenadante e ressuspenda cada pellet em 10 mililitros de meio HB101 suplementado. Em seguida, em cada frasco de cultura de células, adicione cinco mililitros da suspensão celular. Coloque os frascos na incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius e continue cultivando as células por cerca de três semanas. Durante esse tempo, as células produzirão e liberarão o anticorpo monoclonal de interesse no meio de cultura e o anticorpo estará pronto para purificação quando as células começarem a morrer.

Para remover os detritos celulares dos meios de cultura contendo anticorpos, despeje o conteúdo dos frascos de cultura em tubos para um rotor de ângulo fixo. Coloque os tubos no rotor e certifique-se de que esteja devidamente balanceado antes da centrifugação. Gire os tubos a 10.000 RPM por oito minutos. Enquanto as amostras estão centrifugando, coloque um copo de plástico de dois litros com uma barra de agitação em um balde de gelo e, em seguida, coloque o balde de gelo em uma placa de agitação.

Em seguida, conecte uma tampa de filtro de 500 mililitros a uma garrafa de um litro. Conecte esta unidade de filtro superior de garrafa a um aspirador doméstico usando a tubulação apropriada. Em seguida, despeje o sobrenadante que contém o anticorpo na parte superior do filtro. Centrifugue o meio restante para separar os detritos celulares do sobrenadante contendo anticorpos. Quando a parte superior do filtro estiver cheia de sobrenadante, inicie o aspirador. Em seguida, quando o frasco de coleta de um litro estiver quase cheio, remova a tampa do filtro e despeje o sobrenadante filtrado no copo de dois litros no gelo. Repita as etapas de filtração até que todo o sobrenadante seja processado.

Quando toda a amostra tiver sido processada, pesar 295 gramas de sulfato de amônio por litro de sobrenadante filtrado. Ligue a placa de agitação e adicione lentamente o sulfato de amônio ao sobrenadante nas próximas horas. Isso evita uma alta concentração localizada de sal de sulfato de amônio que pode causar a precipitação de proteínas indesejadas. Depois de adicionar todo o sulfato de amônio, cubra o béquer com papel alumínio e mova-o, junto com a placa de agitação, para uma câmara fria a quatro graus Celsius e coloque-o para agitar a solução de anticorpos durante a noite.

Na manhã seguinte, despeje a solução de anticorpos contendo sulfato de amônio do béquer de dois litros em tubos limpos para o rotor de ângulo fixo. Centrifugue os tubos a 6500 RPM por 20 minutos sem interrupção para granular o anticorpo no fundo dos tubos. Em seguida, aspire o sobrenadante a vácuo, tomando cuidado para não sugar o pellet macio. Continue usando o mesmo conjunto de tubos para coletar o anticorpo peletizado do restante do sobrenadante contendo sulfato de amônio. Após a última aspiração, ressuspenda cada pastilha de anticorpos em aproximadamente um mililitro de PBS.

Para remover o sulfato de amônio da solução de anticorpos, primeiro corte aproximadamente uma polegada de tubo de diálise para cada mililitro de solução de anticorpos. Em seguida, limpe o tubo com água destilada e dê um nó em uma extremidade do tubo. Encha o tubo com água destilada para verificar se há vazamento do nó. Se não houver vazamento após alguns minutos, esvazie a água da tubulação.

Em seguida, pipete a solução de anticorpos para a tubulação. Para recuperar o máximo de anticorpos possível, enxágue os tubos com mais 0,25 mililitros de PBS e transfira-os também para o tubo. Prenda a parte superior do tubo o mais próximo possível da solução com um clipe de diálise. Em seguida, prenda a parte superior do tubo na parte superior externa de um copo de quatro litros com a parte cheia do tubo pendurada no copo. Agora, leve o béquer para a câmara fria de quatro graus Celsius e coloque-o em uma placa de agitação. Encha o copo até o topo com PBS e adicione uma barra de agitação. Deixe o tubo e a solução mexerem durante a noite durante cerca de oito horas. Na manhã seguinte, substitua o PBS no copo por PBS novo e deixe o copo mexer novamente por cerca de oito horas. Mais tarde naquela noite, repita o processo uma última vez. De manhã, abra o tubo de diálise e, em seguida, transfira a solução de anticorpos do tubo para tubos cônicos de 15 mililitros. Para remover qualquer precipitante que possa ter se formado durante a diálise, centrifugue os tubos por cinco minutos a 1200 RPM. Por fim, transferir o sobrenadante para tubos novos.

Para quantificar a concentração de anticorpos, primeiro faça uma diluição de 20 vezes adicionando cinco microlitros de uma alíquota de anticorpos a 95 microlitros de PBS. Em seguida, pipetar o anticorpo diluído para uma cubeta e utilizar um espectrofotómetro para registar a concentração a 280 nanómetros. Em seguida, calcule a concentração de anticorpos usando a fórmula mostrada. Por fim, rotule os frascos com tampa de rosca com o nome do anticorpo, concentração, data de preparação e, se aplicável, número do lote e nome do experimentador e, em seguida, alíquota do anticorpo nos frascos com tampa de rosca rotulados. Estes podem ser armazenados a menos 80 graus Celsius até que sejam necessários.

Os rendimentos de exemplo usando a linha de hibridoma 120G8 anti-camundongo CD317 ou PDCA-1 variaram entre 44 e 99,6 miligramas, o que normalmente rende, em média, 67,3 miligramas. É importante notar que cada execução de produção com a mesma linha celular de hibridoma pode ser ligeiramente diferente na quantidade de anticorpo monoclonal disponível no final.