Question 1

Por que as células B não podem ser cultivadas diretamente para produzir anticorpos monoclonais?

Accepted Answer

As células B não sobrevivem bem em cultura a longo prazo, tornando impossível mantê-las indefinidamente para a produção de anticorpos. Para superar essa limitação, os cientistas fundem células B com células de mieloma imortal para criar hibridomas, que combinam as propriedades de produção de anticorpos das células B com a capacidade de crescimento indefinido das células de mieloma.

Question 2

Qual é a diferença entre anticorpos policlonais e monoclonais?

Accepted Answer

Anticorpos policlonais são uma mistura de anticorpos, cada um reconhecendo diferentes epítopos em um antígeno, produzidos por múltiplos clones de células B. Anticorpos monoclonais são anticorpos idênticos produzidos por uma única linhagem de células hibridomas, reconhecendo apenas um epítopo específico. Isso torna os anticorpos monoclonais mais específicos e úteis para distinguir entre antígenos similares.

Question 3

Como a diluição limitante garante a produção de anticorpos monoclonais?

Accepted Answer

A diluição limite é um processo de diluição em série que assegura estatisticamente que células únicas são semeadas nos poços da placa de triagem. Os poços contendo uma célula crescem em populações monoclonais produzindo anticorpos idênticos. Este método de clonagem garante que a linha de hibridoma resultante liberte apenas o anticorpo desejado de especificidade conhecida.

Question 4

Qual o papel do sulfato de amônio na purificação de anticorpos?

Accepted Answer

A precipitação do sulfato de amônio remove os anticorpos do meio de cultura competindo com as proteínas pelas moléculas de água através de interações hidrofílicas. Os íons de amônio e sulfato altamente carregados diminuem a solubilidade dos anticorpos, causando sua precipitação fora da solução. Este método de "salting-out" é uma técnica padrão para purificação de proteínas a partir de sobrenadantes de cultura.

Question 5

Por que o tubo de diálise é usado após a precipitação de sulfato de amônio?

Accepted Answer

Tubulação de diálise remove o sulfato de amônio residual da solução de anticorpos através de troca osmótica. A solução de anticorpos é colocada na tubulação de diálise e imersa no tampão PBS durante a noite. Água e pequenos íons de sal passam através da membrana da tubulação enquanto os anticorpos permanecem no interior, resultando em anticorpos purificados livres de sulfato de amônio.

Question 6

Como é determinada a concentração de anticorpos após a purificação?

Accepted Answer

A concentração do anticorpo é medida usando um espectrofotômetro a 280 nanômetros, que detecta a absorvância da proteína. Uma diluição 20 vezes da amostra do anticorpo é preparada em PBS, então analisada usando o espectrofotômetro. A concentração é calculada usando uma fórmula padrão e registrada para documentação e armazenamento do anticorpo monoclonal purificado.

Question 7

Qual método de triagem é usado para identificar hibridomas que produzem o anticorpo desejado?

Accepted Answer

Elisa Ensaios indiretos de sanduíche e competitivos métodos são usados para examinar o meio de cultura de hibridoma quanto à presença do anticorpo alvo. Após a fusão do hibridoma e clonagem de diluição limitante, o ELISA detecta quais poços contêm células produzindo o anticorpo monoclonal desejado. Esta etapa de triagem garante que apenas hibridomas com a especificidade correta do anticorpo sejam selecionados para expansão e produção de anticorpos.

Geração de anticorpos: produzindo anticorpos monoclonais usando hibridomas - Questionário de avaliação