Microscopia confocal de fluorescência: uma técnica para determinar a localização de proteínas em fibroblastos de camundongos

1. Materiais

Buffers

1. Tampão de lavagem: 1 X salina tamponada de fosfato estéril (PBS) sem cálcio ou magnésio
2. Tampão de fixação: 1% paraformaldeído na PBS
3. Tampão de permeabilização: 0,1% Triton X-100 na PBS
4. Tampão de bloqueio: 1% de albumina de soro bovino na PBS
5. Meio de crescimento celular: DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), penicilina/estreptomicina e L-glutamina

Equipamento

6. Capa de fluxo laminar
7. Incubadora umidificada (37°C, 5% CO₂)
8. Microscópio de varredura a laser confocal; aqui, Nikon Eclipse Ti laser

Materiais e Reagentes

9. Slides de cultura celular câmara
10. Mídia de montagem anti-fade com DAPI (para núcleos de coloração)
11. Vidro de tampa de microscópio
12. Limpezas de tarefas delicadas
13. Pipettors e dicas

Reagentes específicos de ensaio

14. Células aderentes (células primárias ou linhas celulares); aqui, foram utilizados fibroblastos de camundongos transfectados com CD1d (LCD1).
15. Anticorpos primários para detectar alvos celulares; aqui, foram utilizados CD107a anti-rato de rato (LAMP-1) e CD1d anti-rato do mouse.
16. Anticorpos secundários conjugados por fluorofora específicos para isótipos de anticorpos primários; aqui igG anti-rato conjugado ao Alexafluor 488 e anti-mouse IgG conjugado ao Alexafluor 647 foram usados.

2. Protocolo

Preparando-se para a coloração de anticorpos

Células semeadas

1. Resuspend as células de interesse em meios de crescimento.
2. Em seguida, semente 500 μL da suspensão da célula /por poço nos poços de um slide de câmara de 4 poços. (Aqui, as células LCD1 foram semeadas em 2,5x10⁵ células/câmara em 500 μL de mídia de crescimento. A densidade de semeadura pode variar entre as linhas celulares).
3. Incubar o deslizamento da câmara durante a noite em uma incubadora de CO₂ de 5%, a 37°C, para permitir que as células aderam ao vidro.
4. No dia seguinte, aspire a mídia de cada poço e depois lave as células 1X com 500 μL PBS.

Fixação

5. Para fixar as células, adicione 500 μL 1% de solução de paraformaldeído em cada poço e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.
6. Após a incubação, colete o paraformaldeído em um recipiente de resíduos líquidos perigosos apropriado.
7. Em seguida, lave as células 3 vezes com 500 μL PBS para remover quaisquer resquícios do fixador.

Permeabilização

8. Permeabilize as células incubando com 500 μL de permeabilização tampão/poço por 15 minutos à temperatura ambiente.
9. Em seguida, lave as células brevemente 3 vezes com 500 μL de PBS.

Bloqueio

10. Incubar as células em cada poço com tampão de bloqueio de 500 μL por 1 hora a 4°C, para bloquear a ligação de anticorpos não específicos.

Incubação primária de anticorpos

11. Aspire o buffer de bloqueio das câmaras de slides.
12. Em seguida, adicione 500 μL de solução de anticorpos primários diluídos às células. (Aqui, o anti-CD107a (LAMP-1) foi diluído 1:500 e o anti-CD1d foi usado sem diluição (anticorpo monoclonal 1H6 foi gentilmente fornecido pelo Dr. Randy Brutkiewicz)).
13. Incubar os slides durante a noite a 4°C.

Nota: Se sondar por mais de um alvo, certifique-se de que os anticorpos primários são isótipos diferentes. As concentrações recomendadas de anticorpos variam entre os fabricantes e devem ser tituladas antes do uso.

Incubação secundária de anticorpos

14. Aspire a solução primária de anticorpos dos poços.
15. Lave as câmaras de poço 4 vezes com 500 μL PBS.
16. Em seguida, adicione 500 μL da solução de anticorpos secundários diluídos a cada poço. (Aqui, ambos os anticorpos secundários- anti-mouse IgG Alexafluor 647 e anti-rato IgG Alexafluor 488 foram diluídos 1:2000 no buffer de bloqueio).
17. Incubar à temperatura ambiente por 1h no escuro.
18. Após a incubação, aspire a solução de anticorpos secundários.
19. Lave as câmaras 4 vezes com 500 μL PBS para remover qualquer anticorpo secundário não ligado.

Nota: As concentrações recomendadas de anticorpos variam entre os fabricantes e devem ser tituladas antes do uso. Se sondar por mais de um alvo, os anticorpos secundários devem ser conjugados a diferentes fluoroforos com espectros exclusivos de excitação/emissão. Tenha também em mente a excitação/emissão da contra-mancha nuclear (ou seja, DAPI) ao selecionar os fluoroforos. A seleção fluorófora pode ser impactada pela configuração a laser do microscópio confocal utilizado. A configuração a laser da máquina ditará quais fluoroforos são adequados para o experimento.

3. Deslizamentos de cobertura de montagem

1. Primeiro, remova cuidadosamente as câmaras do slide.
2. Em seguida, segure o slide no ângulo sobre uma delicada limpeza de tarefas e remova o fluido das bordas sem tocar nas células.
3. Adicione 1 gota de meio de montagem antifato, contendo a mancha nuclear DAPI, em cada seção das células.
4. Em seguida, coloque uma tampa de 20 mm x 60 mm sobre o slide, segurando-o sobre as bordas usando as pontas dos dedos. (Evite a formação de bolhas sobre as células, pois elas interferem com a imagem).
5. Limpe qualquer meio de montagem extra nas laterais com uma delicada limpeza de tarefas e armazene os slides no escuro à temperatura ambiente até uma semana.

4. Imagem confocal

Amostras de imagem em um microscópio de varredura a laser confocal. Para dados mostrados na Figura 2, o Nikon Eclipse Ti A1R foi usado com o software NIS Elements Advanced Research. A seção a seguir detalha o procedimento para capturar imagens usando o software acima mencionado.

1. Para começar a fotografar as células, abra o 'nis elements advanced research software' clicando no 'ícone de softwareNIS.'
2. Em seguida, na janela de controle clique na guia'TiPad' e escolha o objetivo desejado para a imagem. (Aqui, foi utilizado o primeiro objetivo de 40x).
3. Carregue o slide com células no palco e centralizar-o sob a lente.
4. Agora, na aba 'A1plus Compact GUI', configure os lasers apropriados para os fluoroforos usados. Clique no símbolo de engrenagem para abrir o menu de configurações de corante e espectral e selecione os canais necessários e ajuste o laser para cada canal.
5. Em seguida, selecione as emissões apropriadas no menu suspenso sob o primeiro espelhodicróico.
6. Em seguida, sob a janela 'A1plus Compact GUI', clique em 'Ch. Series' para configurar a série de canais de linha, que configura se os lasers usados dispararão sobre a amostra simultaneamente ou sequencialmente. (Aqui, foram escolhidos passes sequenciais, começando pelo canal 1, seguido pelo canal 2, depois 4).
7. Depois disso, comece a digitalizar clicando no ícone 'Ponta de seta' na parte superior. Neste ponto, enquanto a imagem estiver ao vivo, sob a janela' A1plus Compact GUI', clique na escala deslizante e modifique o tamanho do pinhole para garantir a limitação da luz de foco. (Aqui, foi utilizada a configuração mais baixa disponível (0,5).
8. Em seguida, ajuste as configurações de 'alta tensão' e 'deslocamento' sob cada laser para níveis apropriados, usando as escalas deslizantes para permitir a detecção da coloração específica, limitando qualquer potencial coloração de fundo. Se uma amostra de coloração positiva estiver disponível, comece por imagem desta amostra para cada canal para garantir que as configurações de laser produzam as razões ideais de sinal para ruído.
   Atenção: a alta intensidade do laser por longos períodos pode causar fotobleaching.
9. Depois de definir os valores ideais de HV e deslocamento para cada laser, clique na guia 'ND Acquisition' e, em seguida, selecione o ícone 'Z' para configurar os parâmetros para a série Z. Em seguida, ao adquirir uma imagem ao vivo da amostra, primeiro defina a parte inferior da imagem e clique no botão 'inferior' em seguida, encontrar a posição superior da amostra e clicar no botão 'superior'. Defina o tamanho da etapa digitando especificamente o tamanho da etapa preferencial em μm para cada etapa ou especificando quantas etapas totais são necessárias.
10. Uma vez definidos os parâmetros da série Z, selecione a resolução de tamanho/pixel desejada da imagem. Para isso, clique na janela 'A1plus Compact GUI' e sob o ícone 'tamanho' selecione a resolução desejada. Para diminuir o ruído da imagem, pode-se selecionar o menu suspenso ao lado do símbolo 'ø' para obter uma média do número selecionado de imagens.
11. Agora, clique na guia 'Executar agora' no menu 'ND Acquisition' para iniciar a imagem da amostra.
12. Após a conclusão da imagem, salve a imagem clicando em 'Arquivo', então 'Salve Como', que exportará o arquivo de imagem com a extensão '.nd2'. Por fim, repita o processo para cada uma das outras amostras.