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Microscopia confocal de fluorescência: uma técnica para determinar a localização de proteínas em fibroblastos de camundongos

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Confocal Fluorescence Microscopy: A Technique to Determine the Localization of Proteins in Mouse Fibroblasts

5.7: Immunofluorescence Microscopy: Immunofluorescence Staining of Paraffin-Embedded Tissue Sections

5.9: Immunoprecipitation-Based Techniques: Purification of Endogenous Proteins Using Agarose Beads

42,931 Views

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13:13 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Dominique R. Bollino¹, Eric A. Legenzov², Tonya J. Webb¹
¹ Departamento de Microbiologia e Imunologia, Faculdade de Medicina da Universidade de Maryland e o Centro de Câncer Integral Marlene e Stewart Greenebaum, Baltimore, Maryland 21201
² Center for Biomedical Engineering and Technology, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, Maryland 21201

A microscopia de fluorescência confocal é uma técnica de imagem que permite maior resolução óptica em comparação com a microscopia convencional de epifluorescência “campo largo”. Microscópios confocal são capazes de obter uma resolução óptica x-y melhorada através da “varredura a laser”, tipicamente um conjunto de espelhos controlados por tensão (espelhos galvanômetros ou “galvo”) que direcionam a iluminação a laser para cada pixel da amostra de cada vez. Mais importante, os microscópios confocal atingem uma resolução z-axial superior usando um pinhole para remover a luz de foco originária de locais que não estão no plano z que está sendo escaneado, permitindo assim que o detector colete dados de um z-plane especificado. Devido à alta resolução z alcançável na microscopia confocal, é possível coletar imagens de uma série de z-planes (também chamado de z-stack) e construir uma imagem 3D através de software.

Antes de discutir o mecanismo de um microscópio confocal, é importante considerar como uma amostra interage com a luz. A luz é composta de fótons, pacotes de energia eletromagnética. Um fóton que implica em uma amostra biológica pode interagir com as moléculas que compõem a amostra de uma das quatro maneiras: 1) o fóton não interage e passa pela amostra; 2) o fóton é refletido/espalhado; 3) o fóton é absorvido por uma molécula e a energia absorvida é liberada como calor através de processos coletivamente conhecidos como decadência nãoraditória; e 4) o fóton é absorvido e a energia é rapidamente reemitida como um fóton secundário através do processo conhecido como fluorescência. Uma molécula cuja estrutura permite a emissão de fluorescência é chamada de fluorófora. A maioria das amostras biológicas contém fluoroforos endógenos insignificantes; portanto, fluoroforos exógenos devem ser usados para destacar características de interesse na amostra. Durante a microscopia de fluorescência, a amostra é iluminada com luz do comprimento de onda apropriado para absorção pelo fluoróforo. Ao absorver um fóton, diz-se que um fluoróforo está “animado” e o processo de absorção é chamado de “excitação”. Quando um fluoróforo abre mão de energia na forma de um fóton, o processo é conhecido como “emissão”, e o fóton emitido é chamado de fluorescência.

O feixe de luz usado para excitar um fluoróforo é focado pela lente objetiva de um microscópio e converge em um “ponto focal” onde é extremamente focado. Além do ponto focal, a luz novamente diverge. Os feixes de entrada e saída podem ser visualizados como um par de cones tocando no ponto focal (ver Figura 1, painel esquerdo). O fenômeno da difração impõe um limite de quão firmemente um feixe de luz pode ser focado – o feixe realmente se concentra em um ponto de tamanho finito. Dois fatores determinam o tamanho da mancha focal: 1) o comprimento de onda da luz, e 2) a capacidade de captação de luz da lente objetiva, que é caracterizada por sua abertura numérica (NA). O “ponto” focal se estende não só no plano x-y, mas também na direção z, e é na realidade um volume focal. As dimensões deste volume focal definem a resolução máxima alcançável por imagem óptica. Embora o número de fótons seja maior dentro do volume focal, os caminhos de luz cônica acima e abaixo do foco também contêm uma menor densidade de fótons. Qualquer fluoróforo no caminho da luz pode, assim, ser animado. Na microscopia convencional (campo largo), a emissão de fluoroforos acima e abaixo do plano focal contribuem com fluorescência fora de foco (um “fundo nebuloso”), o que reduz a resolução e o contraste da imagem, como demonstrado na Figura 1, com o cubo vermelho representando a emissão de fluorhoreo acima do plano focal (estrela vermelha) que resulta em fluorescência fora de foco (superior à direita). Este problema é amenizado em microscopia confocal, devido à utilização de um orifício. (Figura 2, inferior direito). Como descrito na Figura 3, o orifício permite que as emissões originárias do local focal cheguem ao detector (esquerda), enquanto bloqueiam a fluorescência fora de foco (direita) de atingir o detector, melhorando assim tanto a resolução quanto o contraste.

Figura 1. Resolução óptica de epifluorescência versus microscopia confocal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O feixe de luz usado para excitar um fluoróforo é focado pela lente objetiva de um microscópio e converge em um volume focal e, em seguida, diverge (esquerda). A estrela vermelha representa o plano focal de uma amostra que está sendo imagen, enquanto o quadrado vermelho representa a emissão de fluoróforo acima do plano focal. Ao capturar uma imagem desta amostra usando um microscópio epifluorescente, a emissão do quadrado vermelho fora de foco será visível e contribuirá para um “fundo nebuloso” (canto superior direito). Os microscópios confocal têm um orifício que impede a detecção de luz emitida fora do plano focal, eliminando o “fundo nebuloso” (inferior direito).

Figura 2. Efeito pinhole na microscopia confocal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Embora a maior intensidade da luz de excitação esteja no ponto focal da lente (esquerda, oval vermelho), outras partes da amostra não no ponto focal (direita, estrela vermelha) receberão luz e fluoresce. Para evitar que a luz emitida dessas regiões fora de foco chegue ao detector, uma tela com um orifício está presente na frente do detector. Apenas a luz em foco (esquerda) emitindo do plano focal é capaz de viajar através do orifício e alcançar o detector. A luz fora de foco (à direita) é bloqueada com o orifício e não alcança o detector.

Figura 3. Principais componentes de um microscópio de varredura a laser confocal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Por uma questão de simplicidade, a descrição mecanicista de um microscópio confocal será limitada à do Nikon Eclipse Ti A1R. Embora possa haver pequenas diferenças técnicas entre diferentes microscópios confocal, o A1R serve bem como um bom modelo para descrever a função de microscópio confocal. O feixe de luz de excitação, produzido por uma matriz de lasers de diodo, é refletido pelo espelho dicroico primário no objetivo, que foca a luz no espécime que está sendo imageado. O espelho dicroico primário reflete seletivamente a luz de excitação, permitindo que a luz em outros comprimentos de onda passe. A luz então encontra os espelhos de varredura que varrem o feixe de luz através do espécime de uma maneira x-y, iluminando um único (x,y) pixel de cada vez. A fluorescência emitida por fluoroforos no pixel iluminado é coletada pela lente objetiva e passa pelo espelhodicrómico primário para alcançar uma matriz de tubos fotomultiplier (PMTs). Espelhos dicroicos secundários direcionam a luz de emissão para o PMT apropriado. A luz de excitação espalhada pela amostra de volta ao objetivo é refletida pelo espelho dirítmico primário de volta para o espécime, e assim impedido de entrar no caminho da luz de detecção e chegar aos PMTs (ver Figura 3). Isso permite que a fluorescência relativamente fraca seja quantificada sem contaminação pela luz espalhada do feixe de luz de excitação, que é tipicamente ordens de magnitude mais intensas do que a fluorescência. Como o orifício bloqueia a luz de fora do volume focal, a luz que chega ao detector vem de um plano Zestreito e selecionado. Portanto, as imagens podem ser coletadas a partir de uma série de z-planesadjacentes; esta série de imagens é frequentemente referida como uma “pilha de z”. Usando o software apropriado, uma pilha zpode ser processada para gerar uma imagem 3D do espécime. Uma vantagem particular da microscopia confocal é a capacidade de distinguir a localização subcelular da coloração. Por exemplo, a diferenciação entre a coloração da membrana a partir da coloração intracelular, que é muito desafiadora com a microscopia de epifluorescência convencional (1, 2, 3).

A preparação da amostra é uma faceta importante da imagem confocal. Uma força das técnicas ópticas de microscopia é a flexibilidade para imagem de células vivas ou fixas. Ao tentar produzir imagens 3D, devido ao número de imagens que devem ser adquiridas para uma pilha z, a dificuldade de manter a saúde celular, e o movimento de células vivas e suas organelas, o uso de células fixas é típico. O procedimento para fixação e coloração de células para fluorescência confocal é semelhante ao convencionalmente utilizado na imunofluorescência. Após a cultura em slides de câmara ou em deslizamentos de cobertura, as células são fixadas usando paraformaldeído para preservar a morfologia celular. A ligação de anticorpos não específicos é bloqueada usando albumina de soro bovino, leite ou soro normal. Para manter a especificidade dos anticorpos secundários, a solução utilizada não deve ser originária da mesma espécie em que os anticorpos primários foram gerados. As células são incubadas com anticorpos primários que ligam o antígeno de interesse. Ao rotular vários alvos celulares, os anticorpos primários devem ser derivados de uma espécie diferente. Anticorpos que marcam um antígeno são então ligados por anticorpos secundários conjugados por fluoróforo. Os anticorpos secundários conjugados por fluoróforo devem ser selecionados para que sejam compatíveis com os comprimentos de onda da excitação a laser disponíveis no microscópio confocal. Ao visualizar múltiplos antígenos, os espectros de excitação/emissão dos fluoroforos devem diferir o suficiente para que seus sinais possam ser discriminados pela análise microscópica. O espécime manchado é então montado em um slide para imagens. Um meio de montagem é usado para evitar fotobleaching e desidratação da amostra. Se desejar, um meio de montagem contendo uma contra-mancha nuclear (por exemplo, DAPI ou Hoechst) pode ser usado (4).

No protocolo a seguir, os fibroblastos de camundongos transfectados para expressar CD1d (LCD1) foram manchados com anticorpos que reconhecem CD1d e CD107a (LAMP-1). CD1d é um grande receptor do complexo de histocompatibilidade 1 (MHC 1) presente na superfície de células presentes de antígenos que apresentam antígenos lipídicos. LAMP-1 (proteína de membrana associada à linsósomal-1) é uma proteína transmembrana presente principalmente em membranas lysosômicas. Para apresentação adequada de antígeno, o CD1d é traficado através do compartimento lyososômico de pH baixo, por isso o LAMP-1 está sendo usado como um marcador do compartimento lysosomal para este protocolo. Ao sondar as células LCD1 com anti-CD1d e anti-LAMP-1 que foram produzidas em diferentes espécies, anticorpos secundários com fluoroforos únicos podem ser usados para determinar a localização de cada proteína na célula e se o CD1d está presente nos compartimentos lisesosmal positivos da LAMP-1.

Procedure

1. Materiais

Buffers

Tampão de lavagem: 1 X salina tamponada de fosfato estéril (PBS) sem cálcio ou magnésio
Tampão de fixação: 1% paraformaldeído na PBS
Tampão de permeabilização: 0,1% Triton X-100 na PBS
Tampão de bloqueio: 1% de albumina de soro bovino na PBS
Meio de crescimento celular: DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), penicilina/estreptomicina e L-glutamina

Equipamento

Capa de fluxo laminar
Incubadora umidificada (37°C, 5% CO₂)
Microscópio de varredura a laser confocal; aqui, Nikon Eclipse Ti laser

Materiais e Reagentes

Slides de cultura celular câmara
Mídia de montagem anti-fade com DAPI (para núcleos de coloração)
Vidro de tampa de microscópio
Limpezas de tarefas delicadas
Pipettors e dicas

Reagentes específicos de ensaio

Células aderentes (células primárias ou linhas celulares); aqui, foram utilizados fibroblastos de camundongos transfectados com CD1d (LCD1).
Anticorpos primários para detectar alvos celulares; aqui, foram utilizados CD107a anti-rato de rato (LAMP-1) e CD1d anti-rato do mouse.
Anticorpos secundários conjugados por fluorofora específicos para isótipos de anticorpos primários; aqui igG anti-rato conjugado ao Alexafluor 488 e anti-mouse IgG conjugado ao Alexafluor 647 foram usados.

2. Protocolo

Preparando-se para a coloração de anticorpos

Células semeadas

Resuspend as células de interesse em meios de crescimento.
Em seguida, semente 500 μL da suspensão da célula /por poço nos poços de um slide de câmara de 4 poços. (Aqui, as células LCD1 foram semeadas em 2,5×10⁵ células/câmara em 500 μL de mídia de crescimento. A densidade de semeadura pode variar entre as linhas celulares).
Incubar o deslizamento da câmara durante a noite em uma incubadora de CO₂ de 5%, a 37°C, para permitir que as células aderam ao vidro.
No dia seguinte, aspire a mídia de cada poço e depois lave as células 1X com 500 μL PBS.

Fixação

Para fixar as células, adicione 500 μL 1% de solução de paraformaldeído em cada poço e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.
Após a incubação, colete o paraformaldeído em um recipiente de resíduos líquidos perigosos apropriado.
Em seguida, lave as células 3 vezes com 500 μL PBS para remover quaisquer resquícios do fixador.

Permeabilização

Permeabilize as células incubando com 500 μL de permeabilização tampão/poço por 15 minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, lave as células brevemente 3 vezes com 500 μL de PBS.

Bloqueio

Incubar as células em cada poço com tampão de bloqueio de 500 μL por 1 hora a 4°C, para bloquear a ligação de anticorpos não específicos.

Incubação primária de anticorpos

Aspire o buffer de bloqueio das câmaras de slides.
Em seguida, adicione 500 μL de solução de anticorpos primários diluídos às células. (Aqui, o anti-CD107a (LAMP-1) foi diluído 1:500 e o anti-CD1d foi usado sem diluição (anticorpo monoclonal 1H6 foi gentilmente fornecido pelo Dr. Randy Brutkiewicz)).
Incubar os slides durante a noite a 4°C.

Nota: Se sondar por mais de um alvo, certifique-se de que os anticorpos primários são isótipos diferentes. As concentrações recomendadas de anticorpos variam entre os fabricantes e devem ser tituladas antes do uso.

Incubação secundária de anticorpos

Aspire a solução primária de anticorpos dos poços.
Lave as câmaras de poço 4 vezes com 500 μL PBS.
Em seguida, adicione 500 μL da solução de anticorpos secundários diluídos a cada poço. (Aqui, ambos os anticorpos secundários- anti-mouse IgG Alexafluor 647 e anti-rato IgG Alexafluor 488 foram diluídos 1:2000 no buffer de bloqueio).
Incubar à temperatura ambiente por 1h no escuro.
Após a incubação, aspire a solução de anticorpos secundários.
Lave as câmaras 4 vezes com 500 μL PBS para remover qualquer anticorpo secundário não ligado.

Nota: As concentrações recomendadas de anticorpos variam entre os fabricantes e devem ser tituladas antes do uso. Se sondar por mais de um alvo, os anticorpos secundários devem ser conjugados a diferentes fluoroforos com espectros exclusivos de excitação/emissão. Tenha também em mente a excitação/emissão da contra-mancha nuclear (ou seja, DAPI) ao selecionar os fluoroforos. A seleção fluorófora pode ser impactada pela configuração a laser do microscópio confocal utilizado. A configuração a laser da máquina ditará quais fluoroforos são adequados para o experimento.

3. Deslizamentos de cobertura de montagem

Primeiro, remova cuidadosamente as câmaras do slide.
Em seguida, segure o slide no ângulo sobre uma delicada limpeza de tarefas e remova o fluido das bordas sem tocar nas células.
Adicione 1 gota de meio de montagem antifato, contendo a mancha nuclear DAPI, em cada seção das células.
Em seguida, coloque uma tampa de 20 mm x 60 mm sobre o slide, segurando-o sobre as bordas usando as pontas dos dedos. (Evite a formação de bolhas sobre as células, pois elas interferem com a imagem).
Limpe qualquer meio de montagem extra nas laterais com uma delicada limpeza de tarefas e armazene os slides no escuro à temperatura ambiente até uma semana.

4. Imagem confocal

Amostras de imagem em um microscópio de varredura a laser confocal. Para dados mostrados na Figura 2, o Nikon Eclipse Ti A1R foi usado com o software NIS Elements Advanced Research. A seção a seguir detalha o procedimento para capturar imagens usando o software acima mencionado.

Para começar a fotografar as células, abra o ‘nis elements advanced research software‘ clicando no ‘ícone de softwareNIS.’
Em seguida, na janela de controle clique na guia‘TiPad‘ e escolha o objetivo desejado para a imagem. (Aqui, foi utilizado o primeiro objetivo de 40x).
Carregue o slide com células no palco e centralizar-o sob a lente.
Agora, na aba ‘A1plus Compact GUI‘, configure os lasers apropriados para os fluoroforos usados. Clique no símbolo de engrenagem para abrir o menu de configurações de corante e espectral e selecione os canais necessários e ajuste o laser para cada canal.
Em seguida, selecione as emissões apropriadas no menu suspenso sob o primeiro espelhodicróico.
Em seguida, sob a janela ‘A1plus Compact GUI‘, clique em ‘Ch. Series‘ para configurar a série de canais de linha, que configura se os lasers usados dispararão sobre a amostra simultaneamente ou sequencialmente. (Aqui, foram escolhidos passes sequenciais, começando pelo canal 1, seguido pelo canal 2, depois 4).
Depois disso, comece a digitalizar clicando no ícone ‘Ponta de seta‘ na parte superior. Neste ponto, enquanto a imagem estiver ao vivo, sob a janela‘ A1plus Compact GUI‘, clique na escala deslizante e modifique o tamanho do pinhole para garantir a limitação da luz de foco. (Aqui, foi utilizada a configuração mais baixa disponível (0,5).
Em seguida, ajuste as configurações de ‘alta tensão‘ e ‘deslocamento‘ sob cada laser para níveis apropriados, usando as escalas deslizantes para permitir a detecção da coloração específica, limitando qualquer potencial coloração de fundo. Se uma amostra de coloração positiva estiver disponível, comece por imagem desta amostra para cada canal para garantir que as configurações de laser produzam as razões ideais de sinal para ruído.
Atenção: a alta intensidade do laser por longos períodos pode causar fotobleaching.
Depois de definir os valores ideais de HV e deslocamento para cada laser, clique na guia ‘ND Acquisition‘ e, em seguida, selecione o ícone ‘Z‘ para configurar os parâmetros para a série Z. Em seguida, ao adquirir uma imagem ao vivo da amostra, primeiro defina a parte inferior da imagem e clique no botão ‘inferior‘ em seguida, encontrar a posição superior da amostra e clicar no botão ‘superior‘. Defina o tamanho da etapa digitando especificamente o tamanho da etapa preferencial em μm para cada etapa ou especificando quantas etapas totais são necessárias.
Uma vez definidos os parâmetros da série Z, selecione a resolução de tamanho/pixel desejada da imagem. Para isso, clique na janela ‘A1plus Compact GUI‘ e sob o ícone ‘tamanho‘ selecione a resolução desejada. Para diminuir o ruído da imagem, pode-se selecionar o menu suspenso ao lado do símbolo ‘ø‘ para obter uma média do número selecionado de imagens.
Agora, clique na guia ‘Executar agora‘ no menu ‘ND Acquisition‘ para iniciar a imagem da amostra.
Após a conclusão da imagem, salve a imagem clicando em ‘Arquivo‘, então ‘Salve Como‘, que exportará o arquivo de imagem com a extensão ‘.nd2‘. Por fim, repita o processo para cada uma das outras amostras.

A microscopia de fluorescência confocal é uma técnica especializada de imagem para localização de uma proteína ou antígeno de interesse em uma amostra de célula ou tecido, rotulando o antígeno com um corante fluorescente conjugado por anticorpos e detectando o sinal fluorescente. Oferece maior resolução espacial do que microscopia de fluorescência de campo largo, com a ajuda de dois pinholes colocados nos planos focais da lente objetiva, dando-lhe o nome confocal. Permite que os usuários visualizem a mancha em um nível subcelular, como a diferenciação entre a coloração da membrana superficial a partir de manchas intracelulares.

Um microscópio confocal segue um princípio básico semelhante ao um microscópio clássico de fluorescência. O feixe de uma fonte de luz, geralmente um laser para confocal, é refletido por um espelhodicróico e focado por uma lente objetiva na amostra. Esta luz excita os fluoroforos a emitir um comprimento de onda diferente, que viaja de volta através da lente objetiva e espelho dicroico para uma câmera ou ocular.

A resolução aprimorada de um microscópio confocal deve-se principalmente à presença de dois orifícios, que são buracos muito pequenos para a luz passar pelos caminhos de excitação e luz de emissão. Os orifícios são estrategicamente colocados no plano focal da lente objetiva. Agora, vamos mudar para um esquema de visão lateral do arranjo do microscópio para rever o caminho da luz. Depois de passar pelo orifício de excitação, o feixe de luz de excitação tem o efeito de se originar de um ponto focal, o que permite que a lente objetiva também concentre a luz até um ponto da amostra. O feixe de emissão deste ponto focal converge para o orifício de emissão, que permite que ele passe. Agora, durante a excitação, fluoroforos dentro do caminho de luz, acima e abaixo do ponto focal, também estão ligeiramente animados. Enquanto a luz de emissão originária do ponto focal passa pelo orifício, as emissões dos pontos fora de foco convergem antes ou depois do orifício de emissão, e são, portanto, bloqueadas, resultando em redução da fluorescência de fundo.

O ciclo de detecção de emissões de excitação precisa ser repetido para cada ponto de imagem na região de interesse, o que pode ser feito de algumas maneiras diferentes. Por exemplo, a varredura a laser confocal usa espelhos de varredura galvanômetro, que desviam a luz de excitação em diferentes ângulos. Por isso, varrendo o feixe de luz através do espécime no plano XY. O disco giratório confocal usa um disco com uma matriz de pinholes, que gira para mudar o arranjo dos orifícios. Isso permite que os usuários iluminem vários pequenos pontos de imagem na amostra cada vez, cobrindo gradualmente toda a área à medida que o disco gira. Como resultado dos orifícios, a imagem XY no detector representa um plano Z estreito. Portanto, as imagens podem ser coletadas de uma série de planos Z consecutivos, muitas vezes referidos como uma pilha Z. A partir dessas imagens, um software apropriado pode gerar uma representação 3D do padrão de sinal de fluorescência na amostra.

Neste protocolo, você observará a imunostenção de fibroblastos de camundongos, seguido de imagem em um microscópio confocal para visualizar diferencialmente uma proteína da superfície celular e uma proteína lysosômica.

Para começar, usando técnicas estéreis, resuspenque as células de interesse em 500 microliters de mídia de crescimento por poço, e depois semeá-las nos poços de um escorregador de câmara de quatro poços. Aqui, estamos usando fibroblastos de camundongos que foram transfectados para expressar a molécula que apresenta antígeno, CD1d. Para permitir que as células aderam ao vidro, coloque o deslizamento da câmara em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius e incubar durante a noite. Pela manhã, aspire a mídia de cada poço, e depois lave as células uma vez com 500 microliters de PBS por alguns segundos.

Para fixar as células, adicione 500 microlitres de 1% de solução de paraformaldeído em cada poço e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, colete o paraformaldeído em um recipiente de resíduos líquidos perigosos apropriado e, em seguida, remova quaisquer restos do fixador lavando as células três vezes com PBS por alguns segundos.

Para permitir a penetração de anticorpos nas células, adicione 500 microliters de tampão de permeabilização a cada poço e incuba no banco por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a permeabilização, lave as células brevemente três vezes com 500 microliters de PBS. Em seguida, adicione 500 microliters de tampão de bloqueio a cada poço, e incubar por uma hora a quatro graus Celsius para evitar a ligação de anticorpos não específicos.

Prepare os anticorpos primários, anti-CD1d e anti-LAMP-1, em concentrações de trabalho apropriadas. Em seguida, aspire o buffer dos poços e cubra as células em cada poço com 500 microliters de solução de anticorpos primários diluídos e, em seguida, incubar o slide em uma superfície plana durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, diluir os anticorpos secundários, neste caso um anticorpo anti-rato e anti-rato com marcas fluorescentes distintas, bloqueando o buffer para concentrações de trabalho apropriadas. Em seguida, aspire a solução de anticorpos primários dos poços e depois lave as células quatro vezes com 500 microliters de PBS. Em seguida, adicione 500 microliters da solução de anticorpos secundários diluídos a cada poço, e incubar à temperatura ambiente por uma hora no escuro. Após a incubação, aspire a solução de anticorpos secundários e lave os poços quatro vezes com 500 microliters de PBS para remover qualquer anticorpo secundário desvinculado.

Para montar as amostras após a lavagem final, desprende cuidadosamente e remova as câmaras do slide. Para remover o PBS residual, segure o slide em um ângulo sobre uma delicada limpeza de tarefas e remova o fluido das bordas sem tocar nas células. Uma vez que o excesso de PBS seja removido, adicione uma gota de meio de montagem antifado, contendo a mancha nuclear DAPI, em cada seção das células. Em seguida, tome um deslizamento de cobertura de 20 por 60 milímetros, e usando apenas as pontas dos dedos começar a baixar o deslizamento lentamente em qualquer borda, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas sobre as células. Limpe qualquer meio de montagem extra nos slides com uma delicada limpeza de tarefas e armazene os slides no escuro à temperatura ambiente por até uma semana.

Para começar a fotografar as células, clique primeiro no ícone do software NIS na área de trabalho. Uma vez na janela de controle, clique na guia TiPad na parte superior e escolha o objetivo desejado para a imagem. Em seguida, carregue o slide com células no palco e centralizar-o sob a lente. Em seguida, na aba GUI compacta A1plus ao lado da aba TiPad, configure os lasers apropriados para os fluoroforos utilizados. Clique no símbolo de engrenagem para abrir o menu de configurações de corante e espectral. Uma vez aberto o menu de ajustes de corante e espectral, selecione os canais necessários e ajuste o laser para cada canal. Em seguida, selecione as emissões apropriadas no menu suspenso sob o primeiro espelhodicróico. Em seguida, sob a janela GUI compacta A1plus, clique em Ch.Series para configurar a série de canais de linha, que define se os lasers usados dispararão na amostra simultaneamente ou sequencialmente.

Depois disso, comece a digitalizar clicando no ícone de ponta de seta na parte superior. Neste ponto, enquanto a imagem estiver ao vivo, sob a janela GUI compacta A1plus, clique na escala deslizante e modifique o tamanho do pinhole para garantir a limitação da luz fora de foco. Em seguida, ajuste as configurações de alta tensão e deslocamento sob cada laser para níveis apropriados usando as escalas deslizantes para permitir a detecção da coloração específica, limitando qualquer possível coloração de fundo. Se uma amostra de coloração positiva estiver disponível, comece por imagem desta amostra para cada canal para garantir que as configurações de laser produzam ótimas relações sinal-ruído. Depois de definir os valores ideais de HV e deslocamento para cada laser, clique na guia ND Acquisition e selecione o ícone Z para configurar os parâmetros para a série z.

Em seguida, ao adquirir uma imagem ao vivo da amostra, primeiro defina a parte inferior, encontrando a parte inferior da imagem e clicando no botão inferior. Em seguida, encontre a posição superior da amostra e clique no botão superior. Defina o tamanho da etapa digitando especificamente o tamanho do passo preferido em mícrons para cada etapa ou especificando quantas etapas totais são necessárias. Para selecionar a resolução de tamanho/pixel desejada da imagem, clique na janela GUI compacta Aiplus e, sob o ícone de tamanho, selecione a resolução desejada.

Para diminuir o ruído da imagem, você pode selecionar o menu suspenso ao lado do símbolo theta para obter uma média do número de imagens selecionadas. Depois disso, clique na guia Executar Agora no menu ND Acquisition para iniciar a imagem da amostra. Depois que a imagem estiver concluída, salve a imagem clicando no arquivo e salve como, que exportará o arquivo de imagem com o ponto de extensão-nd2. Por fim, repita o processo para cada uma das outras amostras.

Neste experimento, os fibroblastos de camundongos que expressavam o gene glicoproteína superficial CD1d foram corrigidos, imunossuídos e imagedos em um microscópio confocal. Esta imagem mostra uma única seção de uma pilha Z na ampliação de 40X, onde o CD1d está manchado em vermelho. A amostra foi costernífera com LAMP-1, um marcador lyosomal, em verde. A mancha nuclear DAPI foi usada para mostrar os núcleos das células.

Em uma imagem composta onde os três canais diferentes são mesclados, o aparecimento do amarelo resulta da sobreposição dos canais vermelho e verde, e indica uma área onde CD1d e LAMP-1 são co-localizados nos lysosomos. Áreas onde apenas uma cor está presente indicam a presença de CD1d ou LAMP-1 sem co-localização. Esta imagem mostra uma renderização 3D das células construídas a partir de imagens capturadas na pilha z e este método permitiu a construção de uma visão lateral desse grupo de células. Esta imagem a seguir mostra uma fatia da pilha z na ampliação de 100X, demonstrando os padrões de expressão dessas duas proteínas em maior detalhe. A caixa delineada rosa no lado direito da imagem exibe a seção transversal da coordenada x designada pela linha rosa na imagem, que representa a vista lateral na linha rosa. Da mesma forma, a caixa de delineado azul na parte inferior da imagem mostra a seção transversal da coordenada y designada pela linha azul na imagem, que representa a vista frontal na linha azul. A renderização 3D da imagem z-stack permite que os usuários visualizem a imagem em 3D, visualizando todos os planos x, y e z. Isso pode ser usado para estudar a co-localização das diferentes manchas em diferentes regiões dentro da célula.

Results

Neste experimento, os fibroblastos de camundongos que expressavam o gene glicoproteína superficial CD1d foram corrigidos, imunossuídos e imagedos em um microscópio confocal. Uma imagem representativa obtida usando o protocolo acima é mostrada na Figura 4. No painel superior de A, imagens de um único canal mostrando o padrão de coloração de cada alvo individual são apresentadas. Essas imagens compreendem uma única seção (fatia) da pilha z capturada. O painel direito mostra a coloração da DAPI dos núcleos das células. Os painéis centrais mostram CD1d manchado em vermelho e LAMP-1, um marcador líssômico, manchado de verde. O painel esquerdo é uma imagem composta onde os três canais diferentes são mesclados. O aparecimento do amarelo resulta da sobreposição dos canais vermelho e verde, e indica uma área onde CD1d e LAMP-1 são co-localizados. Os resultados da coloração confirmam que o CD1d está localizado nos compartimentos endosomais LAMP-1+. Há também áreas onde apenas uma cor está presente, o que indica a presença de CD1d ou LAMP-1 sem co-localização. O painel inferior de A mostra uma renderização 3D das células construídas a partir de imagens capturadas na pilha z.

O painel B mostra uma fatia da pilha z na ampliação de 100x demonstrando os padrões de expressão dessas duas proteínas em maior detalhe. A caixa de delineado rosa no lado direito da imagem exibe a seção transversal da coordenada x designada pela linha rosa na imagem, que representa a vista lateral na linha rosa. Da mesma forma, a caixa de delineado azul na parte inferior da imagem mostra a seção transversal da coordenada y designada pela linha azul na imagem, que representa a vista frontal na linha azul. A renderização 3D da imagem z-stack permite que os usuários visualizem a imagem em 3D, visualizando todos os planos x, y e z.

Figura 4: Mancha de CD1d e LAMP1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A, painel superior: As células LCD1 foram fixadas, permeabilizadas e manchadas com anticorpos para CD1d (vermelho) e LAMP-1 (verde, um marcador do compartimento lysosomal). DAPI (azul, foi usado para visualizar o núcleo). A mesclagem (painel esquerdo) mostra que o CD1d está localizado no compartimento endosomal/lyossommal positivo LAMP-1 (amarelo).
A, painel inferior: renderização 3D das mesmas células no painel superior. As imagens foram adquiridas usando um objetivo de imersão em óleo de 40x no Nikon Eclipse Ti, usando o software NIS Elements Advanced Research.
B: imagem de 100x de células LCD1d manchadas como em A, com informações de pilha para uma determinada coordenada y (denotada pela linha azul) na parte inferior da imagem (caixa azul). As informações da pilha para uma determinada coordenada x (denotada pela linha rosa) são mostradas no lado direito da imagem (caixa rosa).

Applications and Summary

A coloração fluorescente confocal é um procedimento relativamente simples que resulta em imagens de altíssima qualidade de espécimes que são preparados de forma semelhante à microscopia de fluorescência convencional. Resumindo, as amostras são fixas, permeabilizadas e bloqueadas. Anticorpos primários contra uma proteína ou proteínas de interesse são permitidos a ligar, então anticorpos secundários conjugados fluoróforos são usados para visualizar a coloração. A microscopia de fluorescência confocal tem aplicações em muitas áreas de pesquisa. Por exemplo, ao colorar marcadores de organelas subcelulares, juntamente com uma proteína de interesse, a microscopia confocal pode ser usada para determinar os locais subcelulares de diversas proteínas. Em comparação com a microscopia de fluorescência convencional, a imagem confocal pode distinguir mais efetivamente entre a superfície celular e a localização intracelular de uma proteína. Além disso, a imagem confocal também pode ser usada para determinar se duas proteínas co-localizam dentro da célula. Embora não esteja descrita neste protocolo, a microscopia de fluorescência confocal também pode ser realizada em células vivas para detectar alterações dinâmicas.

Vídeo 1: Vídeo criado no software NIS Elements Advanced Research, destacando a capacidade de mover-se através da renderização 3D das imagens. Clique aqui para ver este vídeo (Clique com o botão direito do mouse para baixar).

References

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Hoff. F. How to prepare your specimen for immunofluorescence microscopy. Philipps University Marburg, Institute of Cytobiology and Cytopathology, Germany. (2015) Available at- http://www.leica-microsystems.com.

Transcript

Confocal fluorescence microscopy is a specialized imaging technique for localization of a protein or antigen of interest in a cell or tissue sample by labeling the antigen with an antibody-conjugated fluorescent dye and detecting the fluorescent signal. It offers higher spatial resolution than wide-field fluorescence microscopy, with the help of two pinholes placed at the focal planes of the objective lens, giving it the name confocal. It enables users to visualize the staining at a subcellular level, such as the differentiation between surface membrane staining from intracellular staining.

A confocal microscope follows a similar basic principle as a classic fluorescence microscope. The beam from a light source, usually a laser for confocal, is reflected by a dichroic mirror and focused by an objective lens on the sample. This light excites the fluorophores to emit a different wavelength, which travels back through the objective lens and dichroic mirror to a camera or eyepiece.

The enhanced resolution of a confocal microscope is mainly due to the presence of two pinholes, which are very small holes for light to pass through on the excitation and emission light paths. The pinholes are strategically placed at the focal plane of the objective lens. Now, let’s switch to a side view schematic of the microscope arrangement to review the light path. After passing through the excitation pinhole, the excitation light beam has the effect of originating from a focal point, which enables the objective lens to then focus the light to a point on the sample as well. The emission beam from this focal point converges at the emission pinhole, which allows it to pass through. Now during excitation, fluorophores within the light path, above and below the focal point, are also slightly excited. While the emission light originating from the focal point passes through the pinhole, the emissions from the out-of-focus points converge before or after the emission pinhole, and are hence blocked, resulting in reduced background fluorescence.

The excitation-emission-detection cycle needs to be repeated for each imaging point in the region of interest, which can be done in a few different ways. For example, laser scanning confocal uses galvanometer scanning mirrors, which deflect the excitation light at different angles. Hence, sweeping the light beam across the specimen in the XY plane. Spinning disc confocal uses a disc with an array of pinholes, which rotates to shift the arrangement of the pinholes. This enables users to illuminate multiple small imaging points in the sample each time, gradually covering the whole area as the disc rotates. As a result of the pinholes, the XY image at the detector represents a narrow Z plane. Therefore, images can be collected from a series of consecutive Z planes, often referred to as a Z stack. From these images, an appropriate software can generate a 3D depiction of the fluorescence signal pattern in the sample.

In this protocol, you will observe immunostaining of mouse fibroblasts, followed by imaging on a confocal microscope to differentially visualize a cell surface protein and a lysosomal protein.

To begin, using sterile techniques, resuspend the cells of interest in 500 microliters of growth media per well, and then seed them into the wells of a four-well chamber slide. Here, we are using mouse fibroblasts that were transfected to express the antigen-presenting molecule, CD1d. To allow cells to adhere to the glass, place the chamber slide in a 5% carbon dioxide incubator at 37 degrees Celsius, and incubate overnight. In the morning, aspirate the media from each well, and then wash the cells once with 500 microliters of PBS for a few seconds.

To fix the cells, add 500 microliters of 1% paraformaldehyde solution into each well, and incubate for 15 minutes at room temperature. After the incubation, collect the paraformaldehyde into an appropriate hazardous liquid waste container, and then remove any remnants of the fixative by washing the cells three times with PBS for a few seconds.

To allow antibody penetration into the cells, add 500 microliters of permeabilization buffer to each well, and incubate on the bench for 15 minutes at room temperature. After permeabilization, wash the cells briefly three times with 500 microliters of PBS. Next, add 500 microliters of blocking buffer to each well, and incubate for one hour at four degrees Celsius to prevent nonspecific antibody binding.

Prepare the primary antibodies, anti-CD1d and anti-LAMP-1, at appropriate working concentrations. Then, aspirate the buffer from the wells and cover the cells in each well with 500 microliters of diluted primary antibody solution and then incubate the slide on a flat surface overnight at four degrees Celsius. The next morning, dilute the secondary antibodies, in this case an anti-mouse and anti-rat antibody with distinct fluorescent tags, in blocking buffer to appropriate working concentrations. Next, aspirate the primary antibody solution from the wells and then wash the cells four times with 500 microliters of PBS. Then, add 500 microliters of the diluted secondary antibody solution to each well, and incubate at room temperature for one hour in the dark. After the incubation, aspirate the secondary antibody solution and wash the wells four times with 500 microliters of PBS to remove any unbound secondary antibody.

To mount the samples after the final wash, carefully detach and remove the chambers from the slide. To remove the residual PBS, hold the slide at an angle over a delicate task wipe, and remove the fluid from the edges without touching the cells. Once the excess PBS is removed, add one drop of antifade mounting medium, containing the nuclear stain DAPI, onto each section of cells. Next, take a 20-by-60-millimeter coverslip, and using just fingertips start lowering the coverslip slowly on either edge, taking care to avoid bubble formation over the cells. Wipe off any extra mounting medium on the slides with a delicate task wipe and store the slides in the dark at room temperature for up to a week.

To begin imaging the cells, first click on the NIS software icon on the desktop. Once in the control window, click on the TiPad tab at the top, and choose the desired objective for imaging. Then, load the slide with cells onto the stage, and center it beneath the lens. Next, on the A1plus Compact GUI tab next to the TiPad tab, set up the lasers appropriate for the fluorophores used. Click on the gear symbol to open the dye and spectral settings menu. Once the dye and spectral settings menu is open, select the channels needed and set the laser for each channel. Then, select the appropriate emissions in the drop down menu under the first dichroic mirror. Next, under A1plus Compact GUI window, click on Ch.Series to set up the line channel series, which sets up whether the lasers used will fire on the sample simultaneously or sequentially.

After that, start scanning by clicking the arrow-tip icon on the top. At this point, while the imaging is live, under A1plus Compact GUI window, click on the sliding scale, and modify the pinhole size to assure limiting out-of-focus light. Next, adjust the high voltage and offset settings under each laser to appropriate levels by using the sliding scales to enable detection of the specific staining while limiting any potential background staining. If a positive staining sample is available, start by imaging this sample for each channel to make sure the laser settings yield optimal signal-to-noise ratios. After setting the optimal HV and offset values for each laser, click on the ND Acquisition tab, and then select the Z icon to set up the parameters for the z series.

Next, while acquiring a live image of the sample, first set the bottom by finding the bottom of the image and clicking the bottom button. Then, find the top position of the sample and click the top button. Set the step size either by specifically typing the preferred step size in microns for each step or by specifying how many total steps are needed. To select the desired size/ pixel resolution of the image, click the Aiplus Compact GUI window, and under the size icon, select the desired resolution.

To decrease the noise of the image, you can select the drop-down menu next to the theta symbol to average the selected number of images. After this, click the Run Now tab on the ND Acquisition menu in order to start imaging the sample. After imaging is complete, save the image by clicking file, then save as, which will export the image file with the extension dot-nd2. Finally, repeat the process for each of the other samples.

In this experiment, mouse fibroblasts expressing the surface glycoprotein gene CD1d were fixed, immunostained, and imaged on a confocal microscope. This image shows a single section of a Z stack at 40X magnification, where CD1d is stained in red. The sample was costained with LAMP-1, a lysosomal marker, in green. Nuclear stain DAPI was used to show the nuclei of the cells.

In a composite image where the three different channels are merged, the appearance of yellow results from overlap of the red and green channels, and indicates an area where CD1d and LAMP-1 are co-localized in the lysosomes. Areas where only one color is present indicate the presence of CD1d or LAMP-1 without co-localization. This image shows a 3D rendering of the cells constructed from images captured in the z-stack and this method enabled the construction of a side view of this group of cells. This following image shows a slice out of the z-stack at 100X magnification, demonstrating the expression patterns of these two proteins in greater detail. The pink outlined box on the right side of the image displays the cross-section of the x-coordinate designated by the pink line in the image, which represents the side view at the pink line. Similarly, the blue outlined box on the bottom of the image shows the cross-section of the y-coordinate designated by the blue line in the image, which represents the front view at the blue line. The 3D rendering of the z-stack image enables users to view the image in 3D, visualizing all of the x, y, and z planes. This can be used to study co-localization of the different stains at different regions within the cell.

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