Microscopia confocal de fluorescência: uma técnica para determinar a localização de proteínas em fibroblastos de camundongos

A microscopia de fluorescência confocal é uma técnica de imagem especializada para localização de uma proteína ou antígeno de interesse em uma amostra de célula ou tecido, marcando o antígeno com um corante fluorescente conjugado com anticorpos e detectando o sinal fluorescente. Oferece maior resolução espacial do que a microscopia de fluorescência de campo amplo, com a ajuda de dois orifícios colocados nos planos focais da lente objetiva, dando-lhe o nome de confocal. Ele permite que os usuários visualizem a coloração em um nível subcelular, como a diferenciação entre a coloração da membrana superficial da coloração intracelular.

Um microscópio confocal segue um princípio básico semelhante ao de um microscópio de fluorescência clássico. O feixe de uma fonte de luz, geralmente um laser para confocal, é refletido por um espelho dicróico e focalizado por uma lente objetiva na amostra. Essa luz excita os fluoróforos para emitir um comprimento de onda diferente, que viaja de volta através da lente objetiva e do espelho dicróico para uma câmera ou ocular.

A resolução aprimorada de um microscópio confocal se deve principalmente à presença de dois orifícios, que são orifícios muito pequenos para a passagem da luz nos caminhos da luz de excitação e emissão. Os orifícios são estrategicamente colocados no plano focal da lente objetiva. Agora, vamos mudar para um esquema de vista lateral do arranjo do microscópio para revisar o caminho da luz. Depois de passar pelo orifício de excitação, o feixe de luz de excitação tem o efeito de se originar de um ponto focal, o que permite que a lente objetiva também focalize a luz em um ponto da amostra. O feixe de emissão deste ponto focal converge para o orifício de emissão, o que permite a sua passagem. Agora, durante a excitação, os fluoróforos dentro do caminho da luz, acima e abaixo do ponto focal, também são ligeiramente excitados. Enquanto a luz de emissão originada do ponto focal passa pelo orifício, as emissões dos pontos fora de foco convergem antes ou depois do orifício de emissão e, portanto, são bloqueadas, resultando em fluorescência de fundo reduzida.

O ciclo de excitação-emissão-detecção precisa ser repetido para cada ponto de imagem na região de interesse, o que pode ser feito de algumas maneiras diferentes. Por exemplo, o confocal de varredura a laser usa espelhos de varredura galvanômetro, que desviam a luz de excitação em diferentes ângulos. Assim, varrendo o feixe de luz através da amostra no plano XY. O disco giratório confocal usa um disco com uma matriz de orifícios, que gira para mudar o arranjo dos orifícios. Isso permite que os usuários iluminem vários pequenos pontos de imagem na amostra a cada vez, cobrindo gradualmente toda a área à medida que o disco gira. Como resultado dos orifícios, a imagem XY no detector representa um plano Z estreito. Portanto, as imagens podem ser coletadas de uma série de planos Z consecutivos, geralmente chamados de pilha Z. A partir dessas imagens, um software apropriado pode gerar uma representação 3D do padrão de sinal de fluorescência na amostra.

Neste protocolo, você observará a imunocoloração de fibroblastos de camundongos, seguida de imagens em um microscópio confocal para visualizar diferencialmente uma proteína de superfície celular e uma proteína lisossômica.

Para começar, usando técnicas estéreis, ressuspenda as células de interesse em 500 microlitros de meio de crescimento por poço e, em seguida, semeie-as nos poços de uma lâmina de câmara de quatro poços. Aqui, estamos usando fibroblastos de camundongos que foram transfectados para expressar a molécula apresentadora de antígeno, CD1d. Para permitir que as células adiram ao vidro, coloque a lâmina da câmara em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius e incube durante a noite. De manhã, aspire o meio de cada poço e, em seguida, lave as células uma vez com 500 microlitros de PBS por alguns segundos.

Para fixar as células, adicione 500 microlitros de solução de paraformaldeído a 1% em cada poço e incube por 15 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, colete o paraformaldeído em um recipiente apropriado de resíduos líquidos perigosos e, em seguida, remova quaisquer restos do fixador lavando as células três vezes com PBS por alguns segundos.

Para permitir a penetração de anticorpos nas células, adicione 500 microlitros de tampão de permeabilização a cada poço e incube na bancada por 15 minutos em temperatura ambiente. Após a permeabilização, lave as células brevemente três vezes com 500 microlitros de PBS. Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão de bloqueio a cada poço e incube por uma hora a quatro graus Celsius para evitar a ligação inespecífica de anticorpos.

Preparar os anticorpos primários, anti-CD1d e anti-LAMP-1, em concentrações de trabalho adequadas. Em seguida, aspire o tampão dos poços e cubra as células em cada poço com 500 microlitros de solução diluída de anticorpo primário e, em seguida, incube a lâmina em uma superfície plana durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, diluir os anticorpos secundários, neste caso um anticorpo anti-ratinho e anti-rato com marcas fluorescentes distintas, em tampão de bloqueio para concentrações de trabalho apropriadas. Em seguida, aspire a solução de anticorpos primários dos poços e lave as células quatro vezes com 500 microlitros de PBS. Em seguida, adicione 500 microlitros da solução de anticorpo secundário diluído a cada poço e incube em temperatura ambiente por uma hora no escuro. Após a incubação, aspire a solução de anticorpo secundário e lave os poços quatro vezes com 500 microlitros de PBS para remover qualquer anticorpo secundário não ligado.

Para montar as amostras após a lavagem final, retire e remova cuidadosamente as câmaras da lâmina. Para remover o PBS residual, segure a lâmina em um ângulo sobre um lenço delicado e remova o fluido das bordas sem tocar nas células. Uma vez removido o excesso de PBS, adicione uma gota de meio de montagem antidesbotamento, contendo a coloração nuclear DAPI, em cada seção das células. Em seguida, pegue uma lamínula de 20 por 60 milímetros e, usando apenas as pontas dos dedos, comece a abaixar a lamínula lentamente em cada borda, tomando cuidado para evitar a formação de bolhas sobre as células. Limpe qualquer meio de montagem extra nos slides com uma limpeza de tarefa delicada e guarde os slides no escuro em temperatura ambiente por até uma semana.

Para começar a criar imagens das células, primeiro clique no ícone do software NIS na área de trabalho. Uma vez na janela de controle, clique na guia TiPad na parte superior e escolha a objetiva desejada para a imagem. Em seguida, carregue o slide com células no palco e centralize-o sob a lente. Em seguida, na guia A1plus Compact GUI ao lado da guia TiPad, configure os lasers apropriados para os fluoróforos usados. Clique no símbolo de engrenagem para abrir o menu de configurações de corante e espectral. Quando o menu de configurações de corante e espectral estiver aberto, selecione os canais necessários e defina o laser para cada canal. Em seguida, selecione as emissões apropriadas no menu suspenso sob o primeiro espelho dicróico. Em seguida, na janela A1plus Compact GUI, clique em Ch.Series para configurar a série de canais de linha, que configura se os lasers usados serão disparados na amostra simultaneamente ou sequencialmente.

Depois disso, comece a digitalizar clicando no ícone de ponta de seta na parte superior. Neste ponto, enquanto a imagem estiver ao vivo, na janela A1plus Compact GUI, clique na escala deslizante e modifique o tamanho do orifício para garantir a limitação da luz fora de foco. Em seguida, ajuste as configurações de alta tensão e deslocamento em cada laser para os níveis apropriados usando as escalas deslizantes para permitir a detecção da coloração específica, limitando qualquer possível coloração de fundo. Se uma amostra de coloração positiva estiver disponível, comece gerando imagens dessa amostra para cada canal para garantir que as configurações do laser produzam relações sinal-ruído ideais. Depois de definir os valores ideais de HV e deslocamento para cada laser, clique na guia ND Acquisition e selecione o ícone Z para configurar os parâmetros para a série z.

Em seguida, ao adquirir uma imagem ao vivo da amostra, primeiro defina a parte inferior localizando a parte inferior da imagem e clicando no botão inferior. Em seguida, encontre a posição superior da amostra e clique no botão superior. Defina o tamanho do passo digitando especificamente o tamanho de passo preferido em mícrons para cada passo ou especificando quantos passos totais são necessários. Para selecionar o tamanho/resolução de pixels desejado da imagem, clique na janela Aiplus Compact GUI e, no ícone de tamanho, selecione a resolução desejada.

Para diminuir o ruído da imagem, você pode selecionar o menu suspenso ao lado do símbolo teta para calcular a média do número selecionado de imagens. Depois disso, clique na guia Executar agora no menu Aquisição ND para iniciar a geração de imagens da amostra. Após a conclusão da imagem, salve a imagem clicando em arquivo e, em seguida, em salvar como, o que exportará o arquivo de imagem com a extensão dot-nd2. Por fim, repita o processo para cada uma das outras amostras.

Neste experimento, fibroblastos de camundongos que expressam o gene da glicoproteína de superfície CD1d foram fixados, imunomarcados e fotografados em um microscópio confocal. Esta imagem mostra uma única seção de uma pilha Z com ampliação de 40X, onde CD1d é corado em vermelho. A amostra foi corada com LAMP-1, um marcador lisossômico, em verde. A coloração nuclear DAPI foi usada para mostrar os núcleos das células.

Em uma imagem composta onde os três canais diferentes são mesclados, o aparecimento de amarelo resulta da sobreposição dos canais vermelho e verde e indica uma área onde CD1d e LAMP-1 estão co-localizados nos lisossomos. Áreas onde apenas uma cor está presente indicam a presença de CD1d ou LAMP-1 sem co-localização. Esta imagem mostra uma renderização 3D das células construídas a partir de imagens capturadas na pilha z e este método permitiu a construção de uma vista lateral deste grupo de células. A imagem a seguir mostra uma fatia da pilha z com ampliação de 100X, demonstrando os padrões de expressão dessas duas proteínas com mais detalhes. A caixa contornada rosa no lado direito da imagem exibe a seção transversal da coordenada x designada pela linha rosa na imagem, que representa a vista lateral na linha rosa. Da mesma forma, a caixa contornada azul na parte inferior da imagem mostra a seção transversal da coordenada y designada pela linha azul na imagem, que representa a vista frontal na linha azul. A renderização 3D da imagem z-stack permite que os usuários visualizem a imagem em 3D, visualizando todos os planos x, y e z. Isso pode ser usado para estudar a co-localização das diferentes colorações em diferentes regiões dentro da célula.