Criando uma coluna de Winogradsky: um método para enriquecer as espécies microbianas em uma amostra de sedimento

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Creating a Winogradsky Column: A Method to Enrich the Microbial Species in a Sediment Sample

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08:08 min
April 30, 2023

Visão Geral

Fonte: Elizabeth Suter1, Christopher Corbo1, Jonathan Blaize1
1 Departamento de Ciências Biológicas, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301

A coluna Winogradsky é um ecossistema em miniatura e fechado usado para enriquecer comunidades microbianas de sedimentos, especialmente aquelas envolvidas no ciclismo de enxofre. A coluna foi usada pela primeira vez por Sergei Winogradsky na década de 1880 e desde então tem sido aplicada no estudo de muitos microrganismos diversos envolvidos na biogeoquímica, como fotossintingesizers, oxidantes de enxofre, redutores de sulfato, methanogens, oxidantes de ferro, ciclodificadores de nitrogênio e muito mais (1,2).

A maioria dos microrganismos na Terra são considerados inculturais,o que significa que eles não podem ser isolados em um tubo de ensaio ou em uma placa de petri (3). Isso se deve a muitos fatores, incluindo que os microrganismos dependem de outros para certos produtos metabólicos. As condições em uma coluna de Winogradsky imitam de perto o habitat natural de um microrganismo, incluindo suas interações com outros organismos, e permitem que eles sejam cultivados em laboratório. Por isso, essa técnica permite que os cientistas estudem esses organismos e entendam como eles são importantes para os ciclos biogeoquímicos da Terra sem ter que cultivá-los isoladamente.

Os ambientes da Terra estão cheios de microrganismos que prosperam em todos os tipos de habitats,como solos, água oceânica, nuvens e sedimentos em alto mar. Em todos os habitats, os microrganismos dependem uns dos outros. À medida que um microrganismo cresce, ele consome substratos particulares, incluindo combustíveis ricos em carbono, como açúcares, bem como nutrientes, vitaminas e gases respiratórios como oxigênio. Quando esses recursos importantes se esgotam, diferentes microrganismos com diferentes necessidades metabólicas podem então florescer e prosperar. Por exemplo, na coluna Winogradsky, os micróbios primeiro consomem o material orgânico adicionado enquanto esgotam o oxigênio nas camadas inferiores da coluna. Uma vez que o oxigênio é usado, organismos anaeróbicos podem então assumir e consumir diferentes materiais orgânicos. Esse desenvolvimento consecutivo de diferentes comunidades microbianas ao longo do tempo é chamado de sucessão (4). A sucessão microbiana é importante em uma coluna winogradsky, onde a atividade microbiana altera a química do sedimento, que então afeta a atividade de outros micróbios e assim por diante. Muitos microrganismos em solos e sedimentos também vivem ao longo de gradientes,que são zonas transitórias entre dois tipos diferentes de habitats baseados nas concentrações de substratos (5). No ponto correto no gradiente, um micróbio pode receber quantidades ideais de diferentes substratos. À medida que uma coluna winogradsky se desenvolve, ela começa a imitar esses gradientes naturais, particularmente em oxigênio e sulfeto (Fig. 1).

Figure 1
Figura 1: Uma representação dos gradientes de oxigênio (O2) e sulfeto (H2S) que se desenvolvem em uma coluna winogradsky.

Em uma coluna winogradsky, lama e água de um lago ou pântano são misturados em uma coluna transparente e permitidos a incubação, tipicamente à luz. Substratos adicionais são adicionados à coluna para dar à comunidade fontes de carbono, geralmente sob a forma de celulose, e enxofre. Fotossintificadores normalmente começam a crescer nas camadas superiores do sedimento. Esses microrganismos fotossintéticos são em grande parte compostos por cianobactérias,que produzem oxigênio e aparecem como uma camada verde ou marrom-vermelha (Fig. 2, Tabela 1). Enquanto a fotossíntese produz oxigênio, o oxigênio não é muito solúvel em água e diminui abaixo dessa camada (Fig. 1). Isso cria um gradiente de oxigênio, variando de altas concentrações de oxigênio nas camadas superiores a zero oxigênio nas camadas inferiores. A camada oxigenada é chamada de camada aeróbica e a camada sem oxigênio é chamada de camada anaeróbica.

Na camada anaeróbica, muitas comunidades microbianas diferentes podem proliferar dependendo do tipo e quantidade de substratos disponíveis, da fonte dos micróbios iniciais e da porosidade do sedimento. No fundo da coluna, organismos que aeróbios quebram matéria orgânica podem prosperar. A fermentação microbiana produz ácidos orgânicos a partir da quebra da celulose. Esses ácidos orgânicos podem então ser usados por redutores de sulfato,que oxidam esses orgânicos usando sulfato, e produzem sulfeto como subproduto. A atividade dos redutores de sulfato é indicada se o sedimento ficar preto, pois o ferro e o sulfeto reagem para formar minerais pretos de ferro-sulfeto (Fig. 2, Tabela 1). O sulfeto também difunde para cima, criando outro gradiente no qual as concentrações de sulfeto são altas na parte inferior da coluna e baixas na parte superior da coluna (Fig. 1).

Perto do meio da coluna, os oxidantes de enxofre aproveitam o fornecimento de oxigênio de cima e sulfeto de baixo. Com a quantidade certa de luz, oxidantes de enxofre fotossintéticos podem se desenvolver nessas camadas. Esses organismos são conhecidos como bactérias de enxofre verde e roxo , e muitas vezes aparecem como filamentos e manchas verde, roxo ou roxo-vermelho (Fig. 2, Tabela 1). As bactérias de enxofre verde têm maior tolerância ao sulfeto e geralmente se desenvolvem na camada diretamente abaixo das bactérias do enxofre roxo. Acima das bactérias de enxofre roxo, bactérias não-enxofre roxas também podem se desenvolver. Esses organismos fotossintestêm usando ácidos orgânicos como doadores de elétrons em vez de sulfeto e muitas vezes aparecem como uma camada vermelha, roxa, laranja ou marrom. Oxidantes de enxofre não fotosintéticos podem desenvolver-se acima das bactérias não-enxofre roxas, e estes geralmente aparecem como filamentos brancos (Fig. 2, Tabela 1). Além disso, bolhas também podem se formar na coluna Winogradsky. Bolhas nas camadas aeróbicas indicam a produção de oxigênio pelas cianobactérias. Bolhas nas camadas anaeróbicas são provavelmente devido à atividade de metanogens, organismos que aeróbicamente quebram matéria orgânica e formam metano como subproduto.

Posição na Coluna Grupo funcional Exemplos de organismos Indicador Visual
Início Fotossintificadores Cianobactérias Camada verde ou marrom-avermelhada. Às vezes bolhas de oxigênio.
Oxidantes de enxofre não fotosintéticos Beggiatoa Camada branca.
Bactérias não-enxofre roxas Rhodomicrobium, Rhodospirilum, Rhodopseuodmonas Camada vermelha, roxa, laranja ou marrom.
Bactérias de enxofre roxo Chromatium Camada roxa ou roxa-vermelha.
Bactérias de enxofre verde Clorobio Camada verde.
Bactérias redutoras de sulfato Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfobacter, Desulfuromonas Camada preta.
Fundo Methanogênios Metanoococcus Às vezes bolhas de metano.

Tabela 1: Os principais grupos de bactérias que podem aparecer em uma coluna clássica de Winogradsky, de cima a baixo. Exemplos de organismos de cada grupo são dados, e os indicadores visuais de cada camada de organismos são listados. Baseado em Perry et al. (2002) e Rogan et al. (2005).

Procedimento

1. Configuração Para configurar uma coluna Winogradsky, você precisará de alguns suprimentos básicos: Uma pá, balde e garrafa para coletar as amostras no campo Um vaso vertical e transparente, como um cilindro graduado ou garrafa de água plástica de cerca de 1L Plástico e elásticos grandes tigelas de mistura e colher grande para mexer Uma fonte de enxofre (gema de ovo ou sulfato de cálcio) Uma fonte de carbono orgânico (celulose, na forma de jornal desfiado) Uma fonte de luz (janela ensolarada ou lâmpada de mesa) Solo ou lama coletados de um pântano, pântano, lagoa ou córrego Água do mesmo habitat OPCIONAL O seguinte será necessário para alguns dos experimentos opcionais descritos neste protocolo: Sal de mesa Celofane de cores diferentes Uma fonte de ferro (como uma unha ou lã de aço) Uma geladeira com uma fonte de luz Um radiador perto de uma fonte de luz Se usar uma garrafa de água de plástico, corte a área do pescoço para que a coluna seja cilídricamente em forma. Remova os invólucros para que a luz possa penetrar através do plástico. Os ovos crus podem conter Salmonella e devem ser manuseados com cuidado. Devem ser seguidas técnicas adequadas de lavagem das mãos. Alternativamente, o ovo cozido pode ser usado. Além disso, não há como saber ao certo se lama ou sedimento está contaminado com esgoto ou outra substância nociva. As luvas devem ser usadas ao misturar a lama e configurar a coluna. 2. Montagem de uma Coluna Winogradsky Usando a pá, desenterre e colete lama no balde. Os sedimentos devem estar perto da borda da água e completamente saturados com água. Você precisará de lama suficiente para encher cada coluna winogradsky. Coletar um pouco de água da mesma fonte na garrafa de amostra (aproximadamente 3000 mL por coluna é necessário). No laboratório, transfira lama suficiente para a primeira tigela de mistura para encher ~75% da sua coluna de volume de 1 litro. Em seguida, peneirar para remover grandes pedras, galhos ou folhas enquanto usa a colher para quebrar aglomerados. Adicione um pouco da água que você coletou na tigela de mistura enquanto mexe. Adicione até que a consistência da mistura água-lama seja como um milkshake. Continue se certificando de que não há aglomerados. Transfira cerca de 1/3 do milkshake de lama d’água para a segunda tigela. Adicione a gema de ovo e um punhado de jornal desfiado e misture. Adicione a mistura de lama, gema de ovo e jornal à coluna até que a coluna esteja cerca de 1/4 cheia. Adicione a mistura regular de lama d’água na coluna até que a coluna esteja cerca de 3/4 cheia. Adicione a água adicional à coluna, deixando apenas um pequeno espaço (~1/2 polegada) de ar por cima. Cubra a coluna com plástico e fixe com um elástico. Incubar a coluna na luz à temperatura ambiente. Durante as próximas 4 a 8 semanas, monitore as mudanças na coluna Winogradsky para o desenvolvimento de diferentes camadas coloridas e a formação de bolhas, conforme descrito na Tabela 1. Além disso, você deve registrar o tempo que leva para diferentes camadas se desenvolverem. 3. Modificações opcionais na Coluna Winogradsky Clássica Adicione 25-50g de sal por coluna Winogradsky 1L à lama coletada antes de adicionar água e mexer (passo 2.3). A adição de sal seleciona para bactérias halófilas (amantes de sal). Substratos alternativos, como o ferro, na forma de uma unha ou lã de aço, podem ser adicionados à coluna juntamente com a gema de ovo e o jornal desfiado (passo 2.4). Isso enriquecerá bactérias oxidantes de ferro, como Gallionella,e aparecerá como uma camada cor de ferrugem. Em vez da temperatura ambiente (passo 2.9), a coluna pode ser incubada perto de um radiador para selecionar bactérias termofílicas (que amam o calor) ou em uma geladeira com uma fonte de luz para selecionar para bactérias psicofílicas (que amam o frio). A quantidade de luz que uma coluna recebe à medida que incuba (passo 2.9) também pode ser variada colocando diferentes colunas em alta luz, pouca luz ou escuridão. O comprimento de onda da luz de entrada pode ser limitado cobrindo a coluna com celofófanes diferentemente sombreados à medida que incuba (passo 2.9) para determinar quais cores selecionam para diferentes grupos bacterianos. 4. Análise de dados Após 1-3 semanas, alguma coloração verde no topo da camada de lama da coluna clássica winogradsky deve ser visível (Fig. 2A). Estes são os primeiros sinais de crescimento da camada cianobacteriana. Com o tempo, continue monitorando a aparência e evolução das diferentes camadas, cada uma indicando os diferentes tipos bacterianos. DICA: Consulte os Conceitos e a Tabela 1 para entender quais bactérias contribuem para as diferentes camadas. Figura 2A: Uma foto de uma coluna clássica de Winogradsky que incuba a temperatura ambiente por 21 dias. Note o sedimento verde, indicativo de cianobactérias, na porção superior da coluna. Se também foram preparadas modificações na coluna clássica de Winogradsky, compare os resultados de cada coluna. Observe as camadas em cada uma das colunas winogradsky modificadas. Anote o seguinte: As colunas exibem o mesmo número de camadas? As camadas são da mesma cor e espessura? As camadas ocorrem nas mesmas profundidades? Quanto tempo levou para cada coluna se desenvolver? Uma coluna se desenvolveu mais lentamente do que as outras? <!–5. Results In this experiment, water and sediment were collected from a freshwater habitat. Two Winogradsky columns were constructed and allowed to develop: a classical Winogradsky column incubated in the light at room temperature (Fig. 2A) and a Winogradsky column incubated in the dark at room temperature (Fig. 2B). Figure 2B: A photo of classical Winogradsky column (left), incubated at room temperature in light for 68 days and a Winogradsky column incubated at room temperature in the dark for 68 days (right). After allowing the columns to develop for 7-9 weeks, the layers in the classical column can be compared to the column incubated in the dark (Fig. 2B). In the classical Winogradsky column, a green cyanobacterial layer can be observed near the top of the tube. Near the center of the tube, a red-purple layer can be observed, indicative of purple nonsulfur bacteria. Under this layer, a purple-red layer is observed, indicative of purple sulfur bacteria. Directly under this layer, black sediment can be observed in the anaerobic region of the column, indicative of sulfate reducing bacteria. The column grown in the dark (Fig. 2B) developed differently than the classical Winogradsky column. Like the classical column, the dark column yielded black sediment near the bottom of the column, indicative of sulfate reducing bacteria. The dark column did not yield the green cyanobacterial layer, nor the red, purple, or green layers indicative of purple nonsulfur, purple sulfur, and green sulfur bacteria, respectively. These groups are dependent on light for growth, and therefore unable to grow in the dark. The precise results of each Winogradsky column will vary widely with their incubation conditions and their source habitats. Microbial communities originating from freshwater habitats will not be accustomed to high salt concentrations and the addition of salt may slow down or inhibit growth. Conversely, there may be sufficient halophilic bacteria in brackish and saltwater habitats so that the addition of salts makes no difference or even enhances the growth of particular layers when compared to a column without added salts. Sandy sediments are more porous than muddy sediments. If enough sulfide is produced in such porous sediments, sulfides can diffuse all the way to the top of the column and inhibit growth of aerobic organisms. In this case, the column may only contain layers indicative of anaerobes and may not contain any aerobes, such as the cyanobacteria. Freshwater generally contains less sulfate than saltwater. Sulfate is important for the growth of sulfate-reducing bacteria. Sulfate reducers create sulfide as a byproduct and are indicated by the development of a black layer in the bottom of the column. If sulfate is not supplemented to freshwater communities, sulfate reducers may not produce enough sulfide. The creation of the sulfide byproduct is important for the growth of green and purple sulfur bacteria and the nonphotosynthetic sulfur oxidizers. In these cases, sulfur oxidizers can still grow using the egg yolk as a source of sulfur, even if the sulfate reducers (black layer) never develop. Different wavelengths of light should select for organisms with different absorption pigments. A column kept in the dark will only allow for nonphotosynthetic organisms to grow, including sulfate reducers, iron oxidizers, and methanogens. Photosynthesizers have pigments that absorb light at different wavelengths within the visible range (~400-700nm). By covering a column with, for example, blue cellophane, blue light (~450-490nm) is blocked from entering the column. All of the photosynthesizers in the column have pigments which require the blue wavelengths (6) and their growth should be inhibited. On the other hand, red cellophane will block light of ~635-700nm. These wavelengths are important for the pigments used by cyanobacteria (6), while purple sulfur, green sulfur, and purple nonsulfur bacteria may still be able to grow. Different microbial communities may have vastly different adaptive abilities to cope with changes in temperatures. High temperatures can enhance rates of microbial activity when sufficient thermophiles are present. On the other hand, in the absence of thermophiles, high temperatures may decrease overall microbial activity. Similarly, low temperatures may decrease overall microbial activity unless the microbial community contains sufficient psychrophiles. –>

Resultados

Neste experimento, água e sedimentos foram coletados de um habitat de água doce. Duas colunas winogradsky foram construídas e permitidas a desenvolver: uma coluna clássica de Winogradsky incubada na luz à temperatura ambiente (Fig. 2A) e uma coluna winogradsky incubada no escuro à temperatura ambiente (Fig. 2B). Figura 2B: Uma foto da coluna clássica winogradsky (à esquerda), incubada…

Applications and Summary

A coluna Winogradsky é um exemplo de um ecossistema microbiano interdependente. Depois de misturar lama, água e substratos adicionais de carbono e enxofre em uma coluna vertical, o ecossistema estratificado deve estabilizar-se em zonas separadas e estáveis ao longo de várias semanas. Essas zonas são ocupadas por diferentes microrganismos que florescem em um determinado ponto ao longo do gradiente entre o sedimento rico em sulfeto no fundo e o sedimento rico em oxigênio no topo. Manipulando as condições e substrat…

Referências

  1. Zavarzin G. (2006). Winogradsky and modern microbiology. Microbiology 75(6): 501-511. doi: 10.1134/s0026261706050018
  2. Esteban DJ, Hysa B, and Bartow-McKenney C (2015). Temporal and Spatial Distribution of the Microbial Community of Winogradsky Columns. PLoS ONE 10(8): e0134588. doi:10.1371/journal.pone.0134588
  3. Lloyd KG, Steen AD, Ladau J, Yin J, and Crosby L. (2018). Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate Earth microbiomes. mSystems 3(5): e00055-18. doi:10.1128/mSystems.00055-18
  4. Anderson DC, and Hairston RV (1999). The Winogradsky Column & Biofilms: Models for Teaching Nutrient Cycling & Succession in an Ecosystem. The American Biology Teacher, 61(6): 453-459. doi: 10.2307/4450728
  5. Dang H, Klotz MG, Lovell CR and Sievert SM (2019) Editorial: The Responses of Marine Microorganisms, Communities and Ecofunctions to Environmental Gradients. Frontiers in Microbiology 10(115). doi: 10.3389/fmicb.2019.00115
  6. Stomp M, Huisman J, Stal LJ, and Matthijs HCP. (2007) Colorful niches of phototrophic microorganisms shaped by vibrations of the water molecule. ISME Journal. 1(4): 271-282. doi:10.1038/ismej.2007.59
  7. Perry JJ, Staley JT, and Lory S. (2002) Microbial Life, First Edition, published by Sinauer Associates
  8. Rogan B, Lemke M, Levandowsky M, and Gorrel T. (2005) Exploring the Sulfur Nutrient Cycle Using the Winogradsky Column. The American Biology Teacher, 67(6): 348-356. doi: 10.2307/4451860

Transcrição

1. Configuração Para configurar uma coluna Winogradsky, você precisará de alguns suprimentos básicos: Uma pá, balde e garrafa para coletar as amostras no campo Um vaso vertical e transparente, como um cilindro graduado ou garrafa de água plástica de cerca de 1L Plástico e elásticos grandes tigelas de mistura e colher grande para mexer Uma fonte de enxofre (gema de ovo ou sulfato de cálcio) Uma fonte de carbono orgânico (celulose, na forma de jornal desfiado) Uma fonte de luz (janela ensolarada ou lâmpada de mesa) Solo ou lama coletados de um pântano, pântano, lagoa ou córrego Água do mesmo habitat OPCIONAL O seguinte será necessário para alguns dos experimentos opcionais descritos neste protocolo: Sal de mesa Celofane de cores diferentes Uma fonte de ferro (como uma unha ou lã de aço) Uma geladeira com uma fonte de luz Um radiador perto de uma fonte de luz Se usar uma garrafa de água de plástico, corte a área do pescoço para que a coluna seja cilídricamente em forma. Remova os invólucros para que a luz possa penetrar através do plástico. Os ovos crus podem conter Salmonella e devem ser manuseados com cuidado. Devem ser seguidas técnicas adequadas de lavagem das mãos. Alternativamente, o ovo cozido pode ser usado. Além disso, não há como saber ao certo se lama ou sedimento está contaminado com esgoto ou outra substância nociva. As luvas devem ser usadas ao misturar a lama e configurar a coluna. 2. Montagem de uma Coluna Winogradsky Usando a pá, desenterre e colete lama no balde. Os sedimentos devem estar perto da borda da água e completamente saturados com água. Você precisará de lama suficiente para encher cada coluna winogradsky. Coletar um pouco de água da mesma fonte na garrafa de amostra (aproximadamente 3000 mL por coluna é necessário). No laboratório, transfira lama suficiente para a primeira tigela de mistura para encher ~75% da sua coluna de volume de 1 litro. Em seguida, peneirar para remover grandes pedras, galhos ou folhas enquanto usa a colher para quebrar aglomerados. Adicione um pouco da água que você coletou na tigela de mistura enquanto mexe. Adicione até que a consistência da mistura água-lama seja como um milkshake. Continue se certificando de que não há aglomerados. Transfira cerca de 1/3 do milkshake de lama d’água para a segunda tigela. Adicione a gema de ovo e um punhado de jornal desfiado e misture. Adicione a mistura de lama, gema de ovo e jornal à coluna até que a coluna esteja cerca de 1/4 cheia. Adicione a mistura regular de lama d’água na coluna até que a coluna esteja cerca de 3/4 cheia. Adicione a água adicional à coluna, deixando apenas um pequeno espaço (~1/2 polegada) de ar por cima. Cubra a coluna com plástico e fixe com um elástico. Incubar a coluna na luz à temperatura ambiente. Durante as próximas 4 a 8 semanas, monitore as mudanças na coluna Winogradsky para o desenvolvimento de diferentes camadas coloridas e a formação de bolhas, conforme descrito na Tabela 1. Além disso, você deve registrar o tempo que leva para diferentes camadas se desenvolverem. 3. Modificações opcionais na Coluna Winogradsky Clássica Adicione 25-50g de sal por coluna Winogradsky 1L à lama coletada antes de adicionar água e mexer (passo 2.3). A adição de sal seleciona para bactérias halófilas (amantes de sal). Substratos alternativos, como o ferro, na forma de uma unha ou lã de aço, podem ser adicionados à coluna juntamente com a gema de ovo e o jornal desfiado (passo 2.4). Isso enriquecerá bactérias oxidantes de ferro, como Gallionella,e aparecerá como uma camada cor de ferrugem. Em vez da temperatura ambiente (passo 2.9), a coluna pode ser incubada perto de um radiador para selecionar bactérias termofílicas (que amam o calor) ou em uma geladeira com uma fonte de luz para selecionar para bactérias psicofílicas (que amam o frio). A quantidade de luz que uma coluna recebe à medida que incuba (passo 2.9) também pode ser variada colocando diferentes colunas em alta luz, pouca luz ou escuridão. O comprimento de onda da luz de entrada pode ser limitado cobrindo a coluna com celofófanes diferentemente sombreados à medida que incuba (passo 2.9) para determinar quais cores selecionam para diferentes grupos bacterianos. 4. Análise de dados Após 1-3 semanas, alguma coloração verde no topo da camada de lama da coluna clássica winogradsky deve ser visível (Fig. 2A). Estes são os primeiros sinais de crescimento da camada cianobacteriana. Com o tempo, continue monitorando a aparência e evolução das diferentes camadas, cada uma indicando os diferentes tipos bacterianos. DICA: Consulte os Conceitos e a Tabela 1 para entender quais bactérias contribuem para as diferentes camadas. Figura 2A: Uma foto de uma coluna clássica de Winogradsky que incuba a temperatura ambiente por 21 dias. Note o sedimento verde, indicativo de cianobactérias, na porção superior da coluna. Se também foram preparadas modificações na coluna clássica de Winogradsky, compare os resultados de cada coluna. Observe as camadas em cada uma das colunas winogradsky modificadas. Anote o seguinte: As colunas exibem o mesmo número de camadas? As camadas são da mesma cor e espessura? As camadas ocorrem nas mesmas profundidades? Quanto tempo levou para cada coluna se desenvolver? Uma coluna se desenvolveu mais lentamente do que as outras? <!–5. Results In this experiment, water and sediment were collected from a freshwater habitat. Two Winogradsky columns were constructed and allowed to develop: a classical Winogradsky column incubated in the light at room temperature (Fig. 2A) and a Winogradsky column incubated in the dark at room temperature (Fig. 2B). Figure 2B: A photo of classical Winogradsky column (left), incubated at room temperature in light for 68 days and a Winogradsky column incubated at room temperature in the dark for 68 days (right). After allowing the columns to develop for 7-9 weeks, the layers in the classical column can be compared to the column incubated in the dark (Fig. 2B). In the classical Winogradsky column, a green cyanobacterial layer can be observed near the top of the tube. Near the center of the tube, a red-purple layer can be observed, indicative of purple nonsulfur bacteria. Under this layer, a purple-red layer is observed, indicative of purple sulfur bacteria. Directly under this layer, black sediment can be observed in the anaerobic region of the column, indicative of sulfate reducing bacteria. The column grown in the dark (Fig. 2B) developed differently than the classical Winogradsky column. Like the classical column, the dark column yielded black sediment near the bottom of the column, indicative of sulfate reducing bacteria. The dark column did not yield the green cyanobacterial layer, nor the red, purple, or green layers indicative of purple nonsulfur, purple sulfur, and green sulfur bacteria, respectively. These groups are dependent on light for growth, and therefore unable to grow in the dark. The precise results of each Winogradsky column will vary widely with their incubation conditions and their source habitats. Microbial communities originating from freshwater habitats will not be accustomed to high salt concentrations and the addition of salt may slow down or inhibit growth. Conversely, there may be sufficient halophilic bacteria in brackish and saltwater habitats so that the addition of salts makes no difference or even enhances the growth of particular layers when compared to a column without added salts. Sandy sediments are more porous than muddy sediments. If enough sulfide is produced in such porous sediments, sulfides can diffuse all the way to the top of the column and inhibit growth of aerobic organisms. In this case, the column may only contain layers indicative of anaerobes and may not contain any aerobes, such as the cyanobacteria. Freshwater generally contains less sulfate than saltwater. Sulfate is important for the growth of sulfate-reducing bacteria. Sulfate reducers create sulfide as a byproduct and are indicated by the development of a black layer in the bottom of the column. If sulfate is not supplemented to freshwater communities, sulfate reducers may not produce enough sulfide. The creation of the sulfide byproduct is important for the growth of green and purple sulfur bacteria and the nonphotosynthetic sulfur oxidizers. In these cases, sulfur oxidizers can still grow using the egg yolk as a source of sulfur, even if the sulfate reducers (black layer) never develop. Different wavelengths of light should select for organisms with different absorption pigments. A column kept in the dark will only allow for nonphotosynthetic organisms to grow, including sulfate reducers, iron oxidizers, and methanogens. Photosynthesizers have pigments that absorb light at different wavelengths within the visible range (~400-700nm). By covering a column with, for example, blue cellophane, blue light (~450-490nm) is blocked from entering the column. All of the photosynthesizers in the column have pigments which require the blue wavelengths (6) and their growth should be inhibited. On the other hand, red cellophane will block light of ~635-700nm. These wavelengths are important for the pigments used by cyanobacteria (6), while purple sulfur, green sulfur, and purple nonsulfur bacteria may still be able to grow. Different microbial communities may have vastly different adaptive abilities to cope with changes in temperatures. High temperatures can enhance rates of microbial activity when sufficient thermophiles are present. On the other hand, in the absence of thermophiles, high temperatures may decrease overall microbial activity. Similarly, low temperatures may decrease overall microbial activity unless the microbial community contains sufficient psychrophiles. –>