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Diluições em série e plaqueamento: enumeração microbiana

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Microbiology

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Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration

6.1: Creating a Winogradsky Column: A Method to Enrich the Microbial Species in a Sediment Sample

6.3: Enrichment Cultures: Culturing Aerobic and Anaerobic Microbes on Selective and Differential Medias

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Jonathan F. Blaize¹, Elizabeth Suter¹, e Christopher P. Corbo¹
¹ Departamento de Ciências Biológicas, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301

A avaliação quantitativa dos procariotes pode ser onerosa dada a sua abundância, propensão à proliferação exponencial, diversidade de espécies dentro de uma população e necessidades fisiológicas específicas. Compondo esse desafio, é a natureza de quatro fases em que as bactérias se replicam (lag, log, estacionário e morte). A capacidade de estimar com precisão a concentração de microrganismos é necessária para uma identificação, isolamento, cultivo e caracterização bem-sucedidas (6). Como tal, os microbiologistas têm utilizado diluição serial e várias técnicas de chapeamento por mais de um século para quantificar de forma confiável a carga bacteriana e viral em ambientes clínicos, industriais, farmacêuticos e acadêmicos (2,4,6). Descrições dessa metodologia apareceram pela primeira vez em 1883, quando o cientista e médico alemão Robert Koch publicou seu trabalho sobre agentes causadores de doenças infecciosas (2). Muitas vezes referida como o pai da bacteriologia moderna, as técnicas forenamed de Koch tornaram-se o padrão ouro para a enumeração de microrganismos, culturable ou não, em todo o mundo.

A diluição serial é uma redução sistemática de uma entidade conhecida ou desconhecida (um soluto, organismo, etc.) através da sucessiva re-suspensão de uma solução inicial (solução₀) em volumes fixos de um diluente líquido (em branco). Esses espaços em branco geralmente consistem em 0,45% salino, embora a composição possa ser variada (7). Embora um experimentador possa escolher qualquer volume para cada diluído, é na maioria das vezes um múltiplo de 10, facilitando a redução logarítmica da amostra. Por exemplo, a solução₀ contém um total de 100 células E. coli suspensas em 10 mL de caldo de nutrientes. Se 1 mL de solução₀ for removido e adicionado a 9 mL de soro fisiológico (diluente_1),a nova solução (solução₁) conteria 1/10 da concentração inicial de E. coli. Neste exemplo, a nova solução (solução₁) conteria 10 células E. coli. Repetir este processo removendo 1 mL da solução₁ e adicionando-o a outros 9 mL de soro fisiológico (diluente₂) renderia a solução 2 , contendo_apenasuma única célula E. coli. Uma vez que cada nova solução (9 mL de diluente + 1 mL de solução) contém um total de 10mL, podemos concluir que o fator de diluição para essa redução é de 10 ou que esta foi uma diluição serial de 10 vezes(Figura 1). Como só começamos com 100 células neste exemplo e estamos diluindo por um fator de 10, apenas dois passos são necessários para alcançar a concentração mínima absoluta de 1 célula.

Figura 1: Diluição em série de uma solução de estoque. Uma alíquota de 1 mL da solução de estoque (solução₀) é adicionada ao tubo 1 que contém 9 mL de 0,45% de soro fisiológico (dilent₁); o produto desta mistura é a solução₁. Repita aliquoting 1 mL da solução recém-criada₁ e adicioná-lo ao tubo 2. A aliquotação e a resuspensão continuam desta forma até que o tubo final seja atingido, diluindo a concentração de estoque por um fator de 10 cada um a cada etapa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A diluição serial é a técnica mais simples para obter concentrações gerenciáveis de um organismo desejado e é complementada por listras e espalhamento de placas de petri, apenas duas das muitas técnicas de chapeamento usadas por microbiologistas. Este benefício desta abordagem é que o experimentador pode colher cepas puras de uma única espécie ou separar cepas de uma população mista (7). O streaking é realizado introduzindo um organismo a um meio sólido (geralmente consistindo de agarose) que ele crescerá sobre se os nutrientes apropriados estiverem disponíveis. Varrer suavemente um laço inoculante estéril através do meio (de modo que uma raia sutil permanece) em um rígido padrão sinusoidal irá distribuir o organismo proporcionalmente à frequência da forma de onda do experimentador. Dividir a placa de Petri em terços (raia do quadrante) e diminuir a frequência de cada raia à medida que uma nova região da placa é inserida reduzirá gradualmente o número de microrganismos que podem ocupar aquela região, produzindo colônias únicas em vez de um gramado bacteriano inquantificável. O revestimento disseminador não dilui adicionalmente as amostras; um espalhador de vidro estéril é usado para distribuir uma alíquota de mídia de suspensão através de uma placa de petri inteira(Figura 2). As colônias que crescem na placa de propagação surgem de uma única célula e cada colônia no prato pode ser contada para estimar o número de unidades formadoras de colônias por mililitro (CFU) em uma determinada suspensão, representadas como CFU/mL (6)(Figura 3) Ágar macio e trinagem são variações das técnicas acima mencionadas e permitem o isolamento de bacteriófago e triagem mutante, respectivamente (1,7).

Figura 2: Listramento de placa para enumeração bacteriana e isolamento da tensão. Rotule a parte inferior de uma placa de petri com informações de identificação (nome da bactéria, data, mídia) e divida em terços. Depois de selecionar uma diluição apropriada da amostra de estoque, pegue um laço inoculante estéril (descartável ou inflamado) e submerse-o no tubo de ensaio (aqui, T3). Levante ligeiramente a tampa da placa de petri de um lado para que apenas o laço inoculante possa acessar o ágar. Deslize o laço inoculante através do topo da mídia de uma forma em zig-zag tomando cuidado para não comprometer o ágar. Gire a placa por aproximadamente 1/3^rd (~118°) e reduza a frequência do movimento zig-zag. Gire um tempo final e reduza a frequência em zig-zag mais uma vez. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Espalhe o revestimento. 1 g da zona aeróbica foi resuspended em T1 e, em seguida, diluído em série. Um vidro estéril ou vara descartável de plástico é usado para distribuir inóculo em cada prato. Isso se repetiu com 1 g da zona anaeróbica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como acontece com as diluições seriais, uma escala logarítmica é empregada para expressar a concentração do organismo. O número de colônias cultivadas em placas de petri padrão medindo 100mm x15mm pode ser enumerado manualmente (ou automatizado com o auxílio do processamento computacional) identificando clusters isolados de crescimento. Contagem que totalizam menos de 30 ou mais de 300 devem ser definidas como muito poucos para contar (TFTC) ou muito numerosos para contar (TNTC), respectivamente. No caso deste último, uma diluição seriada deve ser realizada para reduzir a concentração antes de reestilar uma nova placa de petri. A média do número de colônias independentes identificadas a partir de três placas de petri separadas e multiplicando a média pelo fator de diluição produzirá UFC/mL; plotar o registro₁₀ de UFC/mL contra o tempo revelará o tempo médio de geração do organismo (7).

Procedure

1. Configuração

Um fluxograma listando todos os materiais, protocolo experimental stepwise e método para descartar suprimentos deve ser escrito em um caderno de laboratório e mantido perto do espaço de trabalho experimental.
Os espaços de trabalho devem ser esterilizados com um antisséptico apropriado (70% de etanol) e o experimentador deve mitigar o risco de contaminação usando roupas de laboratório limpas que também os protegem de anomalias de exposição. Roupas adequadas incluem, mas não se limitam a um jaleco, luvas de látex ou nitríis, googles, respiradores e sapatos fechados. É fundamental manter a técnica asséptica o tempo todo.
Prepare 90 mL de 0,45% salina. Utilizando um cilindro graduado limpo, meça 90 mL de água estéril e transfira para um frasco erlenmeyer limpo rotulado 0,45% salino. Pese 0,405 g de cloreto de sódio (Sigma-Aldrich NaCl S9888) e adicione-o ao frasco rotulado 0,45% salino. Redemoinho repetidamente até que nenhum soluto permaneça visível.
Após a conclusão, o experimentador deve reestrucionar todas as superfícies e descartar quaisquer organismos indesejados, estoques diluídos, placas de petri ou laços inoculantes descartáveis de acordo com as diretrizes da OSHA. As roupas de laboratório podem ser removidas antes de lavar as mãos.

2. Preparação de mídia

Selecione mídias apropriadas para o cultivo de um organismo desejado. Na maioria dos cenários, um caldo permitiria um crescimento bacteriano suficiente. Uma vez que organismos de um protocolo winogradsky são desejados aqui, uma coluna composta de carbonato de cálcio, enxofre, celulose e lama foi montada e deixada intacta por 7 dias. A coluna forenamed é separada em seções aeróbicas, microaerófilas e anaeróbicas.
Escolha um meio apropriado para emplacamento do organismo de interesse. A suplementação de mídia líquida com ágar de grau microbiológico é tipicamente empregada como agente solidificador. O meio/ágar LB é suficiente na coleta de amostras de regiões aeróbicas, microaerófilas e anaeróbicas da coluna forenamed. Nota: As amostras da região microaerófila não foram colhidas para este procedimento. No entanto, esses organismos devem ser cultivados em frascos de velas. Introduzir uma vela nesta câmara de cultivo antes de selar cria um ambiente de baixo oxigênio adequado para a proliferação microaerófila.
Já que desejamos preparar 250 mL, use frascos erlenmeyer de 500 mL (ou maiores) para evitar a fervura ao se autoclavar. Rotule um “Caldo” e o outro “Agar”.
Determine a quantidade de mídia necessária para criar cada solução seguindo as recomendações de concentração do fabricante. LB Agar, usado aqui, é preparado combinando 25g/L com água ultrapura. Nosso volume de 250 mL requer uma solução de 6,25 LB Agar/250 mL de água. Da mesma forma, o caldo LB é preparado combinando a mesma proporção de caldo LB e água. Como não é complementado com um agente solidificador, não endurecerá quando resfriado.
Pese a mídia e misture-a com água em proporções consistentes com as recomendações do fabricante. Adicione 6,25g de LB Agar a um frasco rotulado de “Agar”, e 6,25g de caldo LB a um frasco rotulado de “Caldo”. Adicione 250 mL de água ultrapura a cada frasco.
Enrole a folha de alumínio sobre cada frasco e use uma autoclave para esterilizar a mídia por um mínimo de 15 minutos a 121°C, 15 psi.
Usando uma luva ou almofada resistente ao calor, remova os frascos da autoclave quando o ciclo estiver completo e coloque-os em um banho de água de 40-50°C.
Uma vez alcançada a temperatura apropriada, despeje o conteúdo do frasco rotulado “Caldo” em um Erlenmeyer de 250 mL, ou frasco de fundo redondo. Rotule o frasco de 250 mL “solução_0″.
Obtenha placas de petri estéreis de 10, 100mm x 15 mm e rotulá-las com a data, nome, o tipo de mídia utilizada e a zona de coluna winogradsky da qual os organismos serão colhidos.
Retire o frasco rotulado de “Agar” do banho de água e comece a derramar em cada uma das 10 placas de petri. Não mais do que 15 mL deve ser adicionado a cada prato. Isso também pode ser realizado com um pipettor e uma pipeta sorológica de 25 mL para melhorar a precisão. Use uma ponta de pipeta estéril para remover as bolhas presentes e, em seguida, cubra com as tampas da placa e deixe solidificar durante a noite.

3. Preparação diluída

Prepare dez tubos de ensaio capazes de armazenar 20 mL ou mais em um rack e rotule-os de T1-T10. Cada número de tubo é consistente com o fator de diluição a que corresponde (ou seja, T4 = 1×10^-4 ou 0,0001 ou 1/10.000º da concentração de estoque).
Pipet 9 mL de 0,45% salina em cada um dos 10 tubos de ensaio.
Os espaços salinos estão prontos para serem esterilizados por autoclave. Use papel alumínio para cobrir cada um dos 10 tubos de ensaio e, em seguida, transfira-os para um rack de tubo de ensaio compatível com autoclave. Esterilize por um mínimo de 15 minutos a 121°C, 15 psi.
Remova os espaços em branco usando luvas resistentes ao calor e deixe esfriar. Cubra e armazene a 4°C até que seja necessário quando os tubos atingirem a temperatura ambiente, ou quando esfriar ao toque.

4. Cultivo de Organismo Alvo

Inocular “solução_0″com uma única colônia de uma placa anteriormente listrada ou 50 μL de um estoque congelado. Permita que o organismo alvo se replique colocando a “solução_0″inoculada em uma incubadora de 37°C durante a noite com agitação (se necessário). (Nota: O frasco deve ser coberto para evitar contaminação. Se o organismo alvo for aeróbico, use gaze estéril e tampões de algodão para evitar contaminação. Se avaliar regiões da coluna Winogradsky, basta remover 1 grama de cada zona desejada (aeróbica e anaeróbica para efeitos deste estudo) e resuspend em T1 antes de prosseguir para a etapa 5.3.

5. Diluição em série

Obtenha o frasco rotulado de “Caldo de nutrientes” da incubadora e agite vigorosamente.
Pipet 1 mL de “solução_0″no tubo de ensaio rotulado T1. Vórtice T1. Se avaliar as explantas winogradsky, pese 1 grama da zona desejada e adicione-a ao T1 antes do vórtice. (Nota: 1 mL é usado aqui para a simplicidade- volumes menores ou maiores de diluente também podem ser usados).
Remova 1 mL do tubo de ensaio T1 e adicione-o ao tubo de ensaio T2. Vórtice T2.
Remova 1 mL do tubo de ensaio T2 e adicione-o ao tubo de ensaio T3. Vórtice T3.
Remova 1 mL do tubo de ensaio T3 e adicione-o ao tubo de ensaio T4. Vórtice T4.
Remova 1 mL do tubo de ensaio T4 e adicione-o ao tubo de ensaio T5. Vórtice T5.
Remova 1 mL do tubo de ensaio T5 e adicione-o ao tubo de ensaio T6. Vórtice T6.
Remova 1 mL do tubo de ensaio T6 e adicione-o ao tubo de ensaio T7. Vórtice T7.
Remova 1 mL do tubo de ensaio T7 e adicione-o ao tubo de ensaio T8. Vórtice T8.
Remova 1 mL do tubo de ensaio T8 e adicione-o ao tubo de ensaio T9. Vórtice T9.
Remova 1 mL do tubo de ensaio T9 e adicione-o ao tubo de ensaio T10.

6. Espalhar revestimento

Pipet 100 μL de uma amostra diluída de T1 diretamente em uma placa de petri. Este passo pode ser, mas não precisa ser repetido para cada tubo.
Obtenha uma haste estéril e descartável ou uma chama esterilize uma haste de vidro. Em um movimento no sentido horário/anti-horário, deslize a porção horizontal da haste de propagação para distribuir igualmente a amostra dentro da placa de petri.
Repita para cada região da coluna Winogradsky que deve ser avaliada.
Incubar placas em uma incubadora de 37°C por 24 horas. Para organismos anaeróbicos, use uma câmara anaeróbica.

7. Streaking

Selecione uma diluição apropriada do seu organismo alvo. Por exemplo, a solução₄ produzirá uma diluição de 1/10.000 da sua concentração inicial. Normalmente, diluições de 1/1.000^th (T3/Solution), 1/1.000.000^th (T6/Solution₆) e 1/1.000.000.000^th (T9/Solution₉) são avaliadas para micróbios enumerados.
Usando um laço de inoculação descartável plástico ou um laço de inoculação de metal reutilizável que está sob fogo há pelo menos 10 segundos, mergulhe na solução desejada a partir do passo 5. Os loops de inoculação calibrados devem transferir 0,01 mL. (Cuidado: Não permita que o laço flamede entrar em contato com bactérias imediatamente após a remoção do calor)
Levante ligeiramente a tampa da placa de petri de um lado para que apenas o laço inoculante possa acessar o ágar. Deslize o laço inoculante através do topo da mídia de uma forma em zig-zag tomando cuidado para não comprometer o ágar. Abaixe a tampa da placa de petri.
Use um novo laço de inoculação descartável ou reesterirei seu loop reutilizável.
Gire a placa por aproximadamente 1/3^rd (~118°) e reduza a frequência do movimento zig-zag.
Novamente, use um novo laço descartável ou reesterirei uma alça metálica antes de girar um tempo final e reduzir a frequência em zig-zag mais uma vez. Abaixe a tampa da placa de petri.
Repetição de passos 7.2 – 7.6 até que pelo menos três placas de petri tenham sido listradas para três diluições diferentes, usando um novo laço descartável ou re-flamejando um loop reutilizável(Figura 2).
Coloque pratos de petri listrados em uma incubadora de 37°C durante a noite. Para organismos anaeróbicos, use uma câmara aeróbica.

8. Análise e Resultados de Dados

As culturas foram colhidas das zonas oxica e anoxica de uma coluna winogradsky de 7 dias. Estas zonas são adequadas para anaeróbios heterotróficos e oxidantes de ferro, respectivamente.
As explantas da coluna foram diluídas em série antes de listrar ou se espalhar em placas LB Agar.
Streaking revelou uma população mista de cada uma das zonas de Winogradsky avaliadas. As placas de difusão produziram resultados semelhantes.
Para calcular CFU/mL ou UFC/g, é média o número de colônias contadas a partir de três placas. Multiplique o número médio de colônias pelo fator de diluição e divida pela quantidade alitada. Por exemplo, se uma média de 65 colônias fosse contada em placas inoculadas com 0,1 mL de solução₆ (T6) a fórmula descrita anteriormente seria igual a 650.000.000 UFC/mL.
Colônias isoladas agora podem ser escolhidas de cada placa para uso em ensaios de enriquecimento para determinar a identidade das espécies.

Às vezes, para identificar e estudar bactérias, primeiro precisamos isolar e enriquecê-las de uma amostra. Por exemplo, amostras obtidas de uma Coluna winogradsky são misturadas, o que significa que contêm várias espécies ou cepas de bactérias, então estudar uma bactéria individual ou enumerar os diferentes tipos presentes pode ser um desafio. Para isso, as técnicas de diluição e revestimento em série são tipicamente empregadas para quantificar de forma confiável a carga bacteriana e isolar colônias individuais.

A diluição serial é um processo através do qual a concentração de um organismo, bactéria neste exemplo, é sistematicamente reduzida através de resuspensão sucessiva em volumes fixos de diluente líquido. Normalmente, o volume do diluído é um múltiplo de 10 para facilitar a redução logarítmica do organismo amostral. Por exemplo, um grama de sedimento é primeiro removido da zona de interesse winogradsky e adicionado a 10 mililitros de um meio líquido apropriado. Em seguida, um mililitro desta primeira diluição é adicionado a outro tubo contendo nove mililitros de médio. O processo pode ser repetido até que várias concentrações diferentes de bactérias tenham sido preparadas. A diluição serial é a chave para a enumeração de bactérias neste exemplo, uma vez que amostras mistas de uma Coluna winogradsky contêm um número desconhecido, muitas vezes grande, de bactérias.

Em seguida, o revestimento e o revestimento de raia permitem o isolamento e enumeração de bactérias dentro de uma amostra, respectivamente. O streaking é realizado introduzindo uma amostra diluída em uma seção do meio sólido suplementado com nutriente, que é dividido em terços. Este inóculo é então espalhado por cada terço da placa em um padrão zig-zag. À medida que diferentes seções da placa são listradas, cruzando da amostra anterior apenas uma vez, a amostra é mais fina. Isso significa que você só precisa de uma diluição para alcançar colônias individuais nas seções posteriores. Após a incubação, as placas listradas permitem observações da morfologia da colônia, informações que podem ajudar a diferenciar entre diferentes espécies bacterianas.

Alternativamente, se o objetivo principal é a enumeração das bactérias no revestimento de propagação da amostra pode ser usado. Em revestimento espalhado, uma alíquota de uma única amostra é espalhada uniformemente por toda a superfície do meio sólido. Normalmente, como não sabemos os números bacterianos na amostra mista, uma placa de propagação é feita para cada uma das diluições ou uma amostra representativa delas. Após a incubação, a enumeração pode ser realizada utilizando-se essas placas de difusão. Quaisquer placas com colônia contam menos de 30 devem ser descartadas, uma vez que pequenas contagens estão sujeitas a maior erro. Da mesma forma, qualquer contagem superior a 300 deve ser descartada porque a aglomeração e a sobreposição das colônias podem levar à subestimação da contagem de colônias. Se a colônia conta de cada um desses pratos remanescentes é registrada e multiplicada pelo fator de diluição, e depois dividida pelo volume banhado, isso rende a colônia formando unidades, ou UFC, por mililitro de suspensão. Neste vídeo, você aprenderá como avaliar qualitativa e quantitativamente uma amostra contendo uma bactéria conhecida, e as comunidades microbianas contidas em várias regiões de uma Coluna Winogradsky através de diluição serial, revestimento de propagação e revestimento de raia.

Primeiro, coloque qualquer equipamento de proteção pessoal apropriado, incluindo um jaleco, luvas e óculos. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho com 70% de etanol e limpe a superfície. Em seguida, reúna dois frascos erlenmeyer de 500 mililitros e rotule um caldo e o outro ágar. Para preparar a solução de ágar LB, misture aproximadamente 6,25 gramas de ágar LB, três gramas de ágar técnico e 250 mililitros de água destilada no ágar rotulado de frasco.

Em seguida, prepare o caldo LB combinando 2. 5 gramas de mídia LB e 100 mililitros de água destilada no caldo rotulado de frasco. Depois de autoclavar os frascos, use uma luva resistente ao calor para remover os frascos da autoclave e colocá-los em um banho de água de 40 a 50 graus Celsius. Uma vez que os frascos são 50 graus Celsius, prepare cuidadosamente três alíquotas de 100 mililitros da solução de caldo e rotule cada solução aliquot zero. Em seguida, reúna 10 placas de petri estéreis e rotulá-las com a data, nome, tipo de mídia usada e a coluna winogradsky da qual os organismos serão colhidos. Pipeta 15 mililitros de ágar do frasco de ágar em cada placa de petri. Em seguida, use a ponta da pipeta para remover quaisquer bolhas, substitua as tampas da placa e deixe-as solidificar no topo do banco durante a noite.

No dia seguinte, limpe a bancada com 70% de etanol. Em seguida, rotule 10 tubos de teste de 20 mililitros T1 a T10 e coloque-os em um rack. Pipeta nove mililitros de 0,45% salino em cada tubo. Agora, cubra cada um dos 10 tubos de ensaio com suas tampas e transfira-os para um rack de tubo de ensaio compatível com autoclave. Após o ciclo ser concluído, remova os espaços salinos usando luvas resistentes ao calor e deixe esfriar. Armazene os tubos à temperatura ambiente até atingirem aproximadamente 22 graus Celsius.

Para cultivar um organismo alvo conhecido, E. coli neste exemplo, inocular 100 mililitros de solução zero com uma única colônia de uma placa anteriormente listrada. Em seguida, cubra o tubo e incuba-o durante a noite a 37 graus Celsius. Para avaliar as regiões de uma Coluna Winogradsky, adicione aproximadamente um grama de material da zona aeróbica ao T1 e resuspend por vórtice. Então, repita esse processo com um grama de material da zona anaeróbica.

Remova o tubo contendo a solução zero inoculada com E. coli da incubadora e agite-o. Em seguida, pipeta um mililitro da solução em um tubo de ensaio T1 e vórtice para misturar. Remova um mililitro de solução do T1 e transfira-o para t2, vórtice para misturar. Repita este processo através do tubo T10. Para avaliar as zonas aeróbicas e anaeróbicas da Coluna Winogradsky, remova um mililitro de solução de cada um dos tubos T1 previamente preparados e transfira-o para os tubos T2 apropriados. Em seguida, continue as diluições seriais através dos tubos T10 como demonstrado anteriormente.

Para espalhar a placa, pipeta 100 microliters da amostra diluída de cada tubo T3 na placa de petri correspondente. Em seguida, use uma haste de espalhamento estéril para distribuir suavemente a amostra na placa de petri e substituir a tampa da placa. Repita este processo para as diluições T6 e T9, como demonstrado anteriormente. Incubar as placas contendo organismos aeróbicos em uma incubadora Celsius de 37 graus por 24 horas. Incubar as placas contendo organismos anaeróbicos em uma câmara anaeróbica fixada em 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, remova as placas de diluição T3, T6 e T9 da incubadora e da câmara anaeróbica e transfira-as para a parte superior do banco. Trabalhando com uma placa de cada vez, deslize um laço inoculante estéril através da parte superior da mídia em um padrão zig-zag. Em seguida, substitua a tampa da placa de petri. Em seguida, gire a placa em 1/3 e esterilize a alça para reduzir a frequência do padrão zig-zag feito anteriormente. Novamente, depois de esterilizar o laço, gire a placa em 1/3, reduza a frequência do padrão zig-zag uma última vez e substitua a tampa. Repita este método de listramento para as placas restantes, como mostrado anteriormente. Em seguida, coloque as placas listradas contendo organismos aeróbicos em uma incubadora Celsius de 37 graus durante a noite e as placas listradas contendo organismos anaeróbicos em uma câmara anaeróbica fixada a 37 graus Celsius durante a noite.

As culturas foram colhidas das zonas aeróbicas e anaeróbicas de uma Coluna Winogradsky de sete dias. Em seguida, as culturas foram diluídas em série antes de streaking e espalhamento em placas de ágar LB. Streaking revelou uma população mista de cada uma das zonas winogradsky avaliadas, e as placas de propagação produziram resultados semelhantes. Uma placa listrada de uma população mista resultará em colônias bacterianas de diferentes formas, tamanhos, texturas e cores. Em contraste, as placas listradas e espalhadas contendo o organismo conhecido, E. coli,demonstraram uma população homóloga. Geralmente, é melhor calcular CFUs por mililitro usando a contagem média de colônias de três placas espalhadas com o mesmo fator de amostra e diluição. Multiplique o número médio de colônias pelo fator de diluição e divida pela quantidade alitada. Finalmente, colônias isoladas escolhidas de cada placa podem ser usadas em ensaios de enriquecimento para determinar a identidade das espécies.

Applications and Summary

Enumeração bacteriana e isolamento da tensão por chapeamento requer concentrações gerenciáveis de organismos alvo. O revestimento bem sucedido depende, portanto, da diluição serial. Como tal, as técnicas supracitadas continuam a ser a pedra angular do exame microbiológico e da experimentação. Embora simples pelo design, fatores de diluição e técnica de chapeamento podem ser modificados pelo experimentador para reforçar os resultados sem comprometer a integridade de cada método. Traçar as quatro fases do crescimento bacteriano pode ser útil ao caracterizar micróbios desejados. Essas fases, lag, log, estacionárias e morte, são marcadas por mudanças na replicação bacteriana. A fase de defasagem apresenta crescimento lento devido à adaptação fisiológica, a fase de registro é o período de proliferação máxima com um aumento exponencial de células viáveis, a fase estacionária é então alcançada devido a limitações ambientais e acúmulos de toxinas, antes da fase de morte onde as contagens de células começam a cair. Isso pode ser feito diluindo em série (ou diluindo 1 passo para evitar confusão) Solução₀ a cada hora por um total de 8 horas, começando no Time₀ (a Solução₀ deve ser devolvida a uma incubadora de agitação após cada diluição). Calcule o registro₁₀ de CFU/ml para um único diluente do Tempo₀ e plote no eixo Y. Repita este cálculo para a amostra Tempo₁ (certifique-se de calcular CFU/mL usando o mesmo fator de diluição que o Tempo₀). Repita até que cada vez (Hora₁-Tempo₈) sejam plotados no eixo X.

References

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Transcript

Sometimes, in order to identify and study bacteria we first need to isolate and enrich them from a sample. For example, samples obtained from a Winogradsky Column are mixed, meaning they contain multiple species or strains of bacteria, so studying an individual bacterium or enumerating the different kinds present can be challenging. To this end, serial dilution and plating techniques are typically employed to reliably quantify bacterial load and isolate individual colonies.

Serial dilution is a process through which the concentration of an organism, bacteria in this example, is systematically reduced through successive resuspension in fixed volumes of liquid diluent. Usually the volume of the diluent is a multiple of 10 to facilitate logarithmic reduction of the sample organism. For example, one gram of sediment is first removed from the Winogradsky zone of interest and added to 10 milliliters of an appropriate liquid medium. Then, one milliliter of this first dilution is added to another tube containing nine milliliters of medium. The process can be repeated until several different concentrations of bacteria have been prepared. Serial dilution is the key to enumeration of bacteria in this example, since mixed samples from a Winogradsky Column contain an unknown, often large, number of bacteria.

Next, streak plating and spread plating enable the isolation and enumeration of bacteria within a sample, respectively. Streaking is accomplished by introducing a diluted sample to one section of the solid medium supplemented with nutrient, which is divided into thirds. This inoculum is then spread over each third of the plate in a zig-zag pattern. As different sections of the plate are streaked, crossing from the previous sample only once, the sample is spread more thinly. This means that you may only need to streak from one dilution to achieve individual colonies in the later sections. After incubation, the streaked plates allow for observations of colony morphology, information that can help differentiate between different bacterial species.

Alternatively, if the main goal is the enumeration of the bacteria in the sample spread plating may be used. In spread plating, an aliquot of a single sample is spread evenly over the entire surface of solid medium. Typically, because we don’t know the bacterial numbers in the mixed sample, a spread plate is made for each of the dilutions or a representative sample of them. After incubation, enumeration can be performed using these spread plates. Any plates with colony counts fewer than 30 should be discarded, since small counts are subject to greater error. Similarly, any counts over 300 should be discarded because colony crowding and overlapping can lead to underestimation of colony count. If the colony counts of each of these remaining dishes is recorded and multiplied by the dilution factor, and then divided by the volume plated, this yields the colony forming units, or CFUs, per milliliter of suspension. In this video, you will learn how to qualitatively and quantitatively evaluate a sample containing a known bacterium, and the microbial communities contained in various regions of a Winogradsky Column via serial dilution, spread plating, and streak plating.

First, put on any appropriate personal protective equipment including a lab coat, gloves, and goggles. Next, sterilize the workspace with 70% ethanol and wipe down the surface. Next, gather two 500 milliliter Erlenmeyer flasks and label one broth and the other agar. To prepare LB agar solution, mix approximately 6.25 grams of LB agar, three grams of technical agar, and 250 milliliters of distilled water in the flask labeled agar.

Then, prepare LB broth by combining 2. 5 grams of LB media and 100 milliliters of distilled water in the flask labeled broth. After autoclaving the flasks, use a heat resistant glove to remove the flasks from the autoclave and place them in a 40 to 50 degree Celsius water bath. Once the flasks are 50 degrees Celsius, carefully prepare three 100 milliliter aliquots of the broth solution and label each aliquot solution zero. Next, gather 10 sterile petri dishes and label them with the date, name, type of media used, and the Winogradsky Column zone that the organisms will be harvested from. Pipette 15 milliliters of agar from the agar flask into each petri dish. Then, use the pipette tip to remove any bubbles, replace the plate lids, and allow them to solidify on the bench top overnight.

The next day, wipe down the bench top with 70% ethanol. Next, label 10 20 milliliter test tubes T1 through T10 and place them in a rack. Pipette nine milliliters of .45% saline into each tube. Now, cover each of the 10 test tubes loosely with their caps and transfer them to an autoclave-compatible test tube rack. After the cycle is complete, remove the saline blanks using heat resistant gloves and allow them to cool. Store the tubes at room temperature until they have reached approximately 22 degrees Celsius.

To cultivate a known target organism, E. coli in this example, inoculate 100 milliliters of solution zero with a single colony from a previously streaked plate. Then, cover the tube and incubate it over night at 37 degrees Celsius. To evaluate the regions of a Winogradsky Column, add approximately one gram of material from the aerobic zone to T1 and resuspend by vortexing. Then, repeat this process with one gram of material from the anaerobic zone.

Remove the tube containing solution zero inoculated with E. coli from the incubator and shake it. Then, pipette one milliliter of the solution into a T1 test tube and vortex to mix. Remove one milliliter of solution from T1 and transfer it to T2, vortexing to mix. Repeat this process through tube T10. To evaluate the aerobic and anaerobic zones of the Winogradsky Column, remove one milliliter of solution from each of the previously prepared T1 tubes and transfer it to the appropriate T2 tubes. Then, continue the serial dilutions through the T10 tubes as previously demonstrated.

To spread plate, pipette 100 microliters of the diluted sample from each T3 tube on to the corresponding petri dish. Then, use a sterile spreading rod to gently distribute the sample on to the petri dish and replace the plate lid. Repeat this process for the T6 and T9 dilutions, as previously demonstrated. Incubate the plates containing aerobic organisms in a 37 degree Celsius incubator for 24 hours. Incubate the plates containing anaerobic organisms in an anaerobic chamber set to 37 degrees Celsius for 24 hours. The next day remove the T3, T6, and T9 dilution plates from the incubator and the anaerobic chamber and transfer them to the bench top. Working with one plate at a time, glide a sterile inoculating loop across the top of the media in a zig-zag pattern. Then, replace the petri dish lid. Next, rotate the plate by 1/3 and sterilize the loop to reduce the frequency of the previously made zig-zag pattern. Again, after sterilizing the loop, rotate the plate by 1/3, reduce the frequency of the zig-zag pattern one last time, and replace the lid. Repeat this streaking method for the remaining plates, as previously shown. Then, place the streaked plates containing aerobic organisms in a 37 degree Celsius incubator overnight and the streaked plates containing anaerobic organisms in an anaerobic chamber set to 37 degrees Celsius overnight.

Cultures were harvested from the aerobic and anaerobic zones of a seven day Winogradsky Column. Then, the cultures were serially diluted prior to streaking and spreading on LB agar plates. Streaking revealed a mixed population from each of the evaluated Winogradsky zones, and the spread plates produced similar results. A plate streaked from a mixed population will result in bacterial colonies of different shapes, sizes, textures, and colors. In contrast, the streaked and spread plates containing the known organism, E. coli, demonstrated a homologous population. Generally, it is best to calculate CFUs per milliliter using the average colony count of three plates spread with the same sample and dilution factor. Multiply the average number of colonies by the dilution factor and divide by the amount aliquoted. Finally, isolated colonies chosen from each plate can be used in further enrichment assays to determine species identity.

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