6.2: Diluições em série e plaqueamento: enumeração microbiana

1. Configuração

1. Um fluxograma listando todos os materiais, protocolo experimental stepwise e método para descartar suprimentos deve ser escrito em um caderno de laboratório e mantido perto do espaço de trabalho experimental.
2. Os espaços de trabalho devem ser esterilizados com um antisséptico apropriado (70% de etanol) e o experimentador deve mitigar o risco de contaminação usando roupas de laboratório limpas que também os protegem de anomalias de exposição. Roupas adequadas incluem, mas não se limitam a um jaleco, luvas de látex ou nitríis, googles, respiradores e sapatos fechados. É fundamental manter a técnica asséptica o tempo todo.
3. Prepare 90 mL de 0,45% salina. Utilizando um cilindro graduado limpo, meça 90 mL de água estéril e transfira para um frasco erlenmeyer limpo rotulado 0,45% salino. Pese 0,405 g de cloreto de sódio (Sigma-Aldrich NaCl S9888) e adicione-o ao frasco rotulado 0,45% salino. Redemoinho repetidamente até que nenhum soluto permaneça visível.
4. Após a conclusão, o experimentador deve reestrucionar todas as superfícies e descartar quaisquer organismos indesejados, estoques diluídos, placas de petri ou laços inoculantes descartáveis de acordo com as diretrizes da OSHA. As roupas de laboratório podem ser removidas antes de lavar as mãos.

2. Preparação de mídia

1. Selecione mídias apropriadas para o cultivo de um organismo desejado. Na maioria dos cenários, um caldo permitiria um crescimento bacteriano suficiente. Uma vez que organismos de um protocolo winogradsky são desejados aqui, uma coluna composta de carbonato de cálcio, enxofre, celulose e lama foi montada e deixada intacta por 7 dias. A coluna forenamed é separada em seções aeróbicas, microaerófilas e anaeróbicas.
2. Escolha um meio apropriado para emplacamento do organismo de interesse. A suplementação de mídia líquida com ágar de grau microbiológico é tipicamente empregada como agente solidificador. O meio/ágar LB é suficiente na coleta de amostras de regiões aeróbicas, microaerófilas e anaeróbicas da coluna forenamed. Nota: As amostras da região microaerófila não foram colhidas para este procedimento. No entanto, esses organismos devem ser cultivados em frascos de velas. Introduzir uma vela nesta câmara de cultivo antes de selar cria um ambiente de baixo oxigênio adequado para a proliferação microaerófila.
3. Já que desejamos preparar 250 mL, use frascos erlenmeyer de 500 mL (ou maiores) para evitar a fervura ao se autoclavar. Rotule um "Caldo" e o outro "Agar".
4. Determine a quantidade de mídia necessária para criar cada solução seguindo as recomendações de concentração do fabricante. LB Agar, usado aqui, é preparado combinando 25g/L com água ultrapura. Nosso volume de 250 mL requer uma solução de 6,25 LB Agar/250 mL de água. Da mesma forma, o caldo LB é preparado combinando a mesma proporção de caldo LB e água. Como não é complementado com um agente solidificador, não endurecerá quando resfriado.
5. Pese a mídia e misture-a com água em proporções consistentes com as recomendações do fabricante. Adicione 6,25g de LB Agar a um frasco rotulado de "Agar", e 6,25g de caldo LB a um frasco rotulado de "Caldo". Adicione 250 mL de água ultrapura a cada frasco.
6. Enrole a folha de alumínio sobre cada frasco e use uma autoclave para esterilizar a mídia por um mínimo de 15 minutos a 121°C, 15 psi.
7. Usando uma luva ou almofada resistente ao calor, remova os frascos da autoclave quando o ciclo estiver completo e coloque-os em um banho de água de 40-50°C.
8. Uma vez alcançada a temperatura apropriada, despeje o conteúdo do frasco rotulado "Caldo" em um Erlenmeyer de 250 mL, ou frasco de fundo redondo. Rotule o frasco de 250 mL "solução_0".
9. Obtenha placas de petri estéreis de 10, 100mm x 15 mm e rotulá-las com a data, nome, o tipo de mídia utilizada e a zona de coluna winogradsky da qual os organismos serão colhidos.
10. Retire o frasco rotulado de "Agar" do banho de água e comece a derramar em cada uma das 10 placas de petri. Não mais do que 15 mL deve ser adicionado a cada prato. Isso também pode ser realizado com um pipettor e uma pipeta sorológica de 25 mL para melhorar a precisão. Use uma ponta de pipeta estéril para remover as bolhas presentes e, em seguida, cubra com as tampas da placa e deixe solidificar durante a noite.

3. Preparação diluída

1. Prepare dez tubos de ensaio capazes de armazenar 20 mL ou mais em um rack e rotule-os de T1-T10. Cada número de tubo é consistente com o fator de diluição a que corresponde (ou seja, T4 = 1x10^-4 ou 0,0001 ou 1/10.000º da concentração de estoque).
2. Pipet 9 mL de 0,45% salina em cada um dos 10 tubos de ensaio.
3. Os espaços salinos estão prontos para serem esterilizados por autoclave. Use papel alumínio para cobrir cada um dos 10 tubos de ensaio e, em seguida, transfira-os para um rack de tubo de ensaio compatível com autoclave. Esterilize por um mínimo de 15 minutos a 121°C, 15 psi.
4. Remova os espaços em branco usando luvas resistentes ao calor e deixe esfriar. Cubra e armazene a 4°C até que seja necessário quando os tubos atingirem a temperatura ambiente, ou quando esfriar ao toque.

4. Cultivo de Organismo Alvo

1. Inocular "solução_0"com uma única colônia de uma placa anteriormente listrada ou 50 μL de um estoque congelado. Permita que o organismo alvo se replique colocando a "solução_0"inoculada em uma incubadora de 37°C durante a noite com agitação (se necessário). (Nota: O frasco deve ser coberto para evitar contaminação. Se o organismo alvo for aeróbico, use gaze estéril e tampões de algodão para evitar contaminação. Se avaliar regiões da coluna Winogradsky, basta remover 1 grama de cada zona desejada (aeróbica e anaeróbica para efeitos deste estudo) e resuspend em T1 antes de prosseguir para a etapa 5.3.

5. Diluição em série

1. Obtenha o frasco rotulado de "Caldo de nutrientes" da incubadora e agite vigorosamente.
2. Pipet 1 mL de "solução_0"no tubo de ensaio rotulado T1. Vórtice T1. Se avaliar as explantas winogradsky, pese 1 grama da zona desejada e adicione-a ao T1 antes do vórtice. (Nota: 1 mL é usado aqui para a simplicidade- volumes menores ou maiores de diluente também podem ser usados).
3. Remova 1 mL do tubo de ensaio T1 e adicione-o ao tubo de ensaio T2. Vórtice T2.
4. Remova 1 mL do tubo de ensaio T2 e adicione-o ao tubo de ensaio T3. Vórtice T3.
5. Remova 1 mL do tubo de ensaio T3 e adicione-o ao tubo de ensaio T4. Vórtice T4.
6. Remova 1 mL do tubo de ensaio T4 e adicione-o ao tubo de ensaio T5. Vórtice T5.
7. Remova 1 mL do tubo de ensaio T5 e adicione-o ao tubo de ensaio T6. Vórtice T6.
8. Remova 1 mL do tubo de ensaio T6 e adicione-o ao tubo de ensaio T7. Vórtice T7.
9. Remova 1 mL do tubo de ensaio T7 e adicione-o ao tubo de ensaio T8. Vórtice T8.
10. Remova 1 mL do tubo de ensaio T8 e adicione-o ao tubo de ensaio T9. Vórtice T9.
11. Remova 1 mL do tubo de ensaio T9 e adicione-o ao tubo de ensaio T10.

6. Espalhar revestimento

1. Pipet 100 μL de uma amostra diluída de T1 diretamente em uma placa de petri. Este passo pode ser, mas não precisa ser repetido para cada tubo.
2. Obtenha uma haste estéril e descartável ou uma chama esterilize uma haste de vidro. Em um movimento no sentido horário/anti-horário, deslize a porção horizontal da haste de propagação para distribuir igualmente a amostra dentro da placa de petri.
3. Repita para cada região da coluna Winogradsky que deve ser avaliada.
4. Incubar placas em uma incubadora de 37°C por 24 horas. Para organismos anaeróbicos, use uma câmara anaeróbica.

7. Streaking

1. Selecione uma diluição apropriada do seu organismo alvo. Por exemplo, a solução₄ produzirá uma diluição de 1/10.000 da sua concentração inicial. Normalmente, diluições de 1/1.000^th (T3/Solution), 1/1.000.000^th (T6/Solution₆) e 1/1.000.000.000^th (T9/Solution₉) são avaliadas para micróbios enumerados.
2. Usando um laço de inoculação descartável plástico ou um laço de inoculação de metal reutilizável que está sob fogo há pelo menos 10 segundos, mergulhe na solução desejada a partir do passo 5. Os loops de inoculação calibrados devem transferir 0,01 mL. (Cuidado: Não permita que o laço flamede entrar em contato com bactérias imediatamente após a remoção do calor)
3. Levante ligeiramente a tampa da placa de petri de um lado para que apenas o laço inoculante possa acessar o ágar. Deslize o laço inoculante através do topo da mídia de uma forma em zig-zag tomando cuidado para não comprometer o ágar. Abaixe a tampa da placa de petri.
4. Use um novo laço de inoculação descartável ou reesterirei seu loop reutilizável.
5. Gire a placa por aproximadamente 1/3^rd (~118°) e reduza a frequência do movimento zig-zag.
6. Novamente, use um novo laço descartável ou reesterirei uma alça metálica antes de girar um tempo final e reduzir a frequência em zig-zag mais uma vez. Abaixe a tampa da placa de petri.
7. Repetição de passos 7.2 - 7.6 até que pelo menos três placas de petri tenham sido listradas para três diluições diferentes, usando um novo laço descartável ou re-flamejando um loop reutilizável(Figura 2).
8. Coloque pratos de petri listrados em uma incubadora de 37°C durante a noite. Para organismos anaeróbicos, use uma câmara aeróbica.

8. Análise e Resultados de Dados

1. As culturas foram colhidas das zonas oxica e anoxica de uma coluna winogradsky de 7 dias. Estas zonas são adequadas para anaeróbios heterotróficos e oxidantes de ferro, respectivamente.
2. As explantas da coluna foram diluídas em série antes de listrar ou se espalhar em placas LB Agar.
3. Streaking revelou uma população mista de cada uma das zonas de Winogradsky avaliadas. As placas de difusão produziram resultados semelhantes.
4. Para calcular CFU/mL ou UFC/g, é média o número de colônias contadas a partir de três placas. Multiplique o número médio de colônias pelo fator de diluição e divida pela quantidade alitada. Por exemplo, se uma média de 65 colônias fosse contada em placas inoculadas com 0,1 mL de solução₆ (T6) a fórmula descrita anteriormente seria igual a 650.000.000 UFC/mL.
5. Colônias isoladas agora podem ser escolhidas de cada placa para uso em ensaios de enriquecimento para determinar a identidade das espécies.

Às vezes, para identificar e estudar bactérias, primeiro precisamos isolá-las e enriquecê-las de uma amostra. Por exemplo, amostras obtidas de uma Coluna de Winogradsky são mistas, o que significa que contêm várias espécies ou cepas de bactérias, portanto, estudar uma bactéria individual ou enumerar os diferentes tipos presentes pode ser um desafio. Para este fim, técnicas de diluição e plaqueamento em série são normalmente empregadas para quantificar de forma confiável a carga bacteriana e isolar colônias individuais.

A diluição em série é um processo pelo qual a concentração de um organismo, bactéria neste exemplo, é sistematicamente reduzida por meio de ressuspensão sucessiva em volumes fixos de diluente líquido. Normalmente, o volume do diluente é um múltiplo de 10 para facilitar a redução logarítmica do organismo da amostra. Por exemplo, um grama de sedimento é primeiro removido da zona de interesse de Winogradsky e adicionado a 10 mililitros de um meio líquido apropriado. Em seguida, um mililitro desta primeira diluição é adicionado a outro tubo contendo nove mililitros de meio. O processo pode ser repetido até que várias concentrações diferentes de bactérias tenham sido preparadas. A diluição em série é a chave para a enumeração de bactérias neste exemplo, uma vez que amostras mistas de uma coluna de Winogradsky contêm um número desconhecido, geralmente grande, de bactérias.

Em seguida, o revestimento estriado e o revestimento espalhado permitem o isolamento e a enumeração de bactérias dentro de uma amostra, respectivamente. A estria é realizada introduzindo uma amostra diluída em uma seção do meio sólido suplementado com nutriente, que é dividido em terços. Este inóculo é então espalhado por cada terço da placa em zigue-zague. À medida que diferentes seções da placa são listradas, cruzando a amostra anterior apenas uma vez, a amostra é espalhada mais finamente. Isso significa que você só pode precisar passar de uma diluição para obter colônias individuais nas seções posteriores. Após a incubação, as placas listradas permitem observações da morfologia da colônia, informações que podem ajudar a diferenciar entre diferentes espécies bacterianas.

Alternativamente, se o objetivo principal for a enumeração das bactérias na amostra, o plaqueamento pode ser usado. No chapeamento espalhado, uma alíquota de uma única amostra é espalhada uniformemente por toda a superfície do meio sólido. Normalmente, como não sabemos o número de bactérias na amostra mista, uma placa de propagação é feita para cada uma das diluições ou uma amostra representativa delas. Após a incubação, a enumeração pode ser realizada usando essas placas espalhadas. Quaisquer placas com contagens de colônias inferiores a 30 devem ser descartadas, pois contagens pequenas estão sujeitas a erros maiores. Da mesma forma, qualquer contagem acima de 300 deve ser descartada porque a aglomeração e sobreposição de colônias podem levar à subestimação da contagem de colônias. Se a contagem de colônias de cada um desses pratos restantes for registrada e multiplicada pelo fator de diluição e, em seguida, dividida pelo volume banhado, isso produz as unidades formadoras de colônias, ou UFCs, por mililitro de suspensão. Neste vídeo, você aprenderá como avaliar qualitativa e quantitativamente uma amostra contendo uma bactéria conhecida e as comunidades microbianas contidas em várias regiões de uma coluna de Winogradsky por meio de diluição em série, espalhamento e estrias.

Primeiro, coloque qualquer equipamento de proteção individual apropriado, incluindo jaleco, luvas e óculos de proteção. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho com etanol 70% e limpe a superfície. Em seguida, reúna dois frascos de Erlenmeyer de 500 mililitros e rotule um caldo e o outro ágar. Para preparar a solução de ágar LB, misture aproximadamente 6,25 gramas de ágar LB, três gramas de ágar técnico e 250 mililitros de água destilada no frasco rotulado como ágar.

Em seguida, prepare o caldo LB combinando 2. 5 gramas de meio LB e 100 mililitros de água destilada no caldo rotulado com frasco. Após a autoclavagem dos frascos, use uma luva resistente ao calor para remover os frascos da autoclave e coloque-os em banho-maria de 40 a 50 graus Celsius. Quando os frascos estiverem a 50 graus Celsius, prepare cuidadosamente três alíquotas de 100 mililitros da solução de caldo e rotule cada solução de alíquota como zero. Em seguida, reúna 10 placas de Petri estéreis e rotule-as com a data, nome, tipo de meio usado e a zona da Coluna Winogradsky da qual os organismos serão colhidos. Pipetar 15 mililitros de ágar-ágar do balão de ágar para cada placa de Petri. Em seguida, use a ponta da pipeta para remover quaisquer bolhas, recoloque as tampas das placas e deixe-as solidificar na bancada durante a noite.

No dia seguinte, limpe a bancada com etanol 70%. Em seguida, rotule 10 tubos de ensaio de 20 mililitros T1 a T10 e coloque-os em um rack. Pipete nove mililitros de solução salina de 0,45% em cada tubo. Agora, cubra cada um dos 10 tubos de ensaio frouxamente com suas tampas e transfira-os para um suporte de tubo de ensaio compatível com autoclave. Após a conclusão do ciclo, remova os espaços em branco com luvas resistentes ao calor e deixe-os esfriar. Armazene os tubos em temperatura ambiente até que atinjam aproximadamente 22 graus Celsius.

Para cultivar um organismo-alvo conhecido, E. coli neste exemplo, inocule 100 mililitros de solução zero com uma única colônia de uma placa previamente listrada. Em seguida, cubra o tubo e incube-o durante a noite a 37 graus Celsius. Para avaliar as regiões de uma coluna de Winogradsky, adicione aproximadamente um grama de material da zona aeróbica a T1 e ressuspenda por vórtice. Em seguida, repita esse processo com um grama de material da zona anaeróbica.

Remova o tubo contendo a solução zero inoculada com E. coli da incubadora e agite-o. Em seguida, pipete um mililitro da solução em um tubo de ensaio T1 e vórtice para misturar. Remova um mililitro de solução de T1 e transfira-o para T2, vórtice para misturar. Repita este processo através do tubo T10. Para avaliar as zonas aeróbicas e anaeróbicas da coluna de Winogradsky, remova um mililitro de solução de cada um dos tubos T1 previamente preparados e transfira-o para os tubos T2 apropriados. Em seguida, continue as diluições seriadas através dos tubos T10 conforme demonstrado anteriormente.

Para espalhar a placa, pipetar 100 microlitros da amostra diluída de cada tubo T3 para a placa de Petri correspondente. Em seguida, use uma haste de espalhamento estéril para distribuir suavemente a amostra na placa de Petri e recoloque a tampa da placa. Repita este processo para as diluições T6 e T9, conforme demonstrado anteriormente. Incube as placas contendo organismos aeróbicos em uma incubadora de 37 graus Celsius por 24 horas. Incubar as placas contendo organismos anaeróbicos em uma câmara anaeróbica ajustada para 37 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, remova as placas de diluição T3, T6 e T9 da incubadora e da câmara anaeróbica e transfira-as para a bancada. Trabalhando com uma placa de cada vez, deslize uma alça de inoculação estéril pela parte superior da mídia em zigue-zague. Em seguida, recoloque a tampa da placa de Petri. Em seguida, gire a placa em 1/3 e esterilize o laço para reduzir a frequência do padrão em zigue-zague feito anteriormente. Novamente, depois de esterilizar o laço, gire a placa em 1/3, reduza a frequência do padrão em zigue-zague uma última vez e recoloque a tampa. Repita este método de listras para as placas restantes, conforme mostrado anteriormente. Em seguida, coloque as placas listradas contendo organismos aeróbicos em uma incubadora de 37 graus Celsius durante a noite e as placas listradas contendo organismos anaeróbicos em uma câmara anaeróbica ajustada para 37 graus Celsius durante a noite.

As culturas foram colhidas nas zonas aeróbicas e anaeróbicas de uma coluna de Winogradsky de sete dias. Em seguida, as culturas foram diluídas em série antes de estriar e espalhar em placas de ágar LB. As listras revelaram uma população mista de cada uma das zonas de Winogradsky avaliadas, e as placas espalhadas produziram resultados semelhantes. Um prato listrado de uma população mista resultará em colônias bacterianas de diferentes formas, tamanhos, texturas e cores. Em contraste, as placas listradas e espalhadas contendo o organismo conhecido, E. coli, demonstraram uma população homóloga. Geralmente, é melhor calcular as UFC por mililitro usando a contagem média de colônias de três placas espalhadas com a mesma amostra e fator de diluição. Multiplique o número médio de colônias pelo fator de diluição e divida pela quantidade alíquota. Finalmente, colônias isoladas escolhidas de cada placa podem ser usadas em ensaios de enriquecimento adicionais para determinar a identidade da espécie.