Culturas puras e semeadura por esgotamento: isolamento de colônias bacterianas únicas de uma amostra mista

1. Configurar

1. Todos os micróbios devem ser tratados como se fossem perigosos. Use sempre um jaleco e luvas, amarre os cabelos longos e certifique-se de que todas as feridas estejam particularmente bem protegidas.
2. Prepare o espaço de trabalho esterilizando-o usando 70% de etanol.
3. Certifique-se de que as placas de ágar, a solução de amostra(s) e uma caixa de laços de inoculação de plástico pré-esterilizados ou uma alça metálica mais uma chama bunsen, estão próximas. Alças de plástico descartáveis são tipicamente pré-esterilizadas. As alças metálicas devem ser mergulhadas em 70% de etanol, e depois mantidas perto da área azul de uma chama bunsen e aquecidas até que aqueçam fogo. Deixe o fio esfriar levantando a tampa da placa (apenas ligeiramente para evitar contaminação) e batendo-o contra o meio solidificado.
4. Finalize cada procedimento com uma esterilização repetida do espaço de trabalho e uma lavagem/esterilização completa das mãos e pulsos.

2. Protocolo

1. Preparação de mídia
   1. Identifique e prepare um meio sólido (tipicamente contendo 1,5% (p/v) ágar) que sustentará as espécies/cepas bacterianas utilizadas. Misture o meio em uma garrafa capaz de segurar o dobro do volume final para evitar o estouro ao autoclavar.
   2. Esterilize a mídia colocando a garrafa, com uma tampa semi-apertada, em uma autoclave fixada em 121°C por 20 min.
   3. Feche a tampa corretamente assim que a garrafa for removida da autoclave. Se a mídia for usada em breve, coloque a garrafa em um banho de água definido para 45°C para preservá-la em um estado líquido. O ágar se solidificará a nada menos que 32-40°C, e mais tarde pode ser reaquecido (normalmente usando um micro-ondas) a um ponto de fusão a 85°C.
2. Preparação de placas de cultura
   1. Marque a base de placas estéreis de Petri (tipicamente 100 x 15 mm) na lateral ou na parte inferior com o nome do experimentador, a data e o tipo de mídia.
   2. Despeje 20-25 mL de 45°C de cultura de ágar (previamente preparado) em cada uma das placas rotuladas. Caso a espuma apareça ao longo das bordas, esta deve ser rapidamente removida usando uma pipeta regular e uma ponta estéril.
   3. Coloque imediatamente todas as tampas de volta nos pratos para evitar contaminação.
   4. Deixe o ágar solidificar por aproximadamente 2h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. Uma vez definidas, as placas de cultura bacteriana devem ser armazenadas de cabeça para baixo a 4°C para minimizar a condensação na superfície média.
3. Chapeamento de raias
   1. Submerque um laço estéril no inóculo desejado e disperse imediatamente a amostra coletada no primeiro quadrante da placa usando um movimento zig-zag(Figura 1, I).
   2. Feche a tampa e reestericione o laço de inoculação ou colete um novo laço descartável estéril.
   3. Faça 3-4 traçados irradiando do primeiro quadrante (contendo uma população bacteriana relativamente densa) em direção ao segundo quadrante da placa(Figura 1, II).
   4. Feche a tampa e reestericione o laço de inoculação ou descarte o laço descartável e colete um novo estéril.
   5. Repita esta raia de 3-4 tacadas do segundo para o terceiro quadrante, e depois do terceiro ao quarto quadrante, usando um laço estéril cada vez(Figura 1, III - IV).
   6. Usando um laço estéril, faça um último golpe em um padrão zig-zag do quarto quadrante em direção ao meio da placa(Figura 1, V). A prevalência bacteriana será menor nesta área, permitindo idealmente que colônias individuais sejam estabelecidas a partir de uma única célula-mãe viável.
   7. Feche a tampa e (se necessário pelas espécies bacterianas) sela com parafilme para evitar o fluxo de ar.
   8. Dependendo da espécie/cepa bacteriana, coloque a placa de cultura de lado para baixo em um ambiente adequado e incubar até que colônias bacterianas sejam visíveis (colônias segregadas podem aparecer em qualquer área da placa, pois a concentração inicial pode variar).
   9. Para gerar uma população bacteriana clonal, escroto outra placa, trocando o inóculo banhado na placa original por células isoladas de uma única colônia da placa original.