6.4: Culturas puras e semeadura por esgotamento: isolamento de colônias bacterianas únicas de uma amostra mista

1. Configurar

1. Todos os micróbios devem ser tratados como se fossem perigosos. Use sempre um jaleco e luvas, amarre os cabelos longos e certifique-se de que todas as feridas estejam particularmente bem protegidas.
2. Prepare o espaço de trabalho esterilizando-o usando 70% de etanol.
3. Certifique-se de que as placas de ágar, a solução de amostra(s) e uma caixa de laços de inoculação de plástico pré-esterilizados ou uma alça metálica mais uma chama bunsen, estão próximas. Alças de plástico descartáveis são tipicamente pré-esterilizadas. As alças metálicas devem ser mergulhadas em 70% de etanol, e depois mantidas perto da área azul de uma chama bunsen e aquecidas até que aqueçam fogo. Deixe o fio esfriar levantando a tampa da placa (apenas ligeiramente para evitar contaminação) e batendo-o contra o meio solidificado.
4. Finalize cada procedimento com uma esterilização repetida do espaço de trabalho e uma lavagem/esterilização completa das mãos e pulsos.

2. Protocolo

1. Preparação de mídia
   1. Identifique e prepare um meio sólido (tipicamente contendo 1,5% (p/v) ágar) que sustentará as espécies/cepas bacterianas utilizadas. Misture o meio em uma garrafa capaz de segurar o dobro do volume final para evitar o estouro ao autoclavar.
   2. Esterilize a mídia colocando a garrafa, com uma tampa semi-apertada, em uma autoclave fixada em 121°C por 20 min.
   3. Feche a tampa corretamente assim que a garrafa for removida da autoclave. Se a mídia for usada em breve, coloque a garrafa em um banho de água definido para 45°C para preservá-la em um estado líquido. O ágar se solidificará a nada menos que 32-40°C, e mais tarde pode ser reaquecido (normalmente usando um micro-ondas) a um ponto de fusão a 85°C.
2. Preparação de placas de cultura
   1. Marque a base de placas estéreis de Petri (tipicamente 100 x 15 mm) na lateral ou na parte inferior com o nome do experimentador, a data e o tipo de mídia.
   2. Despeje 20-25 mL de 45°C de cultura de ágar (previamente preparado) em cada uma das placas rotuladas. Caso a espuma apareça ao longo das bordas, esta deve ser rapidamente removida usando uma pipeta regular e uma ponta estéril.
   3. Coloque imediatamente todas as tampas de volta nos pratos para evitar contaminação.
   4. Deixe o ágar solidificar por aproximadamente 2h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. Uma vez definidas, as placas de cultura bacteriana devem ser armazenadas de cabeça para baixo a 4°C para minimizar a condensação na superfície média.
3. Chapeamento de raias
   1. Submerque um laço estéril no inóculo desejado e disperse imediatamente a amostra coletada no primeiro quadrante da placa usando um movimento zig-zag(Figura 1, I).
   2. Feche a tampa e reestericione o laço de inoculação ou colete um novo laço descartável estéril.
   3. Faça 3-4 traçados irradiando do primeiro quadrante (contendo uma população bacteriana relativamente densa) em direção ao segundo quadrante da placa(Figura 1, II).
   4. Feche a tampa e reestericione o laço de inoculação ou descarte o laço descartável e colete um novo estéril.
   5. Repita esta raia de 3-4 tacadas do segundo para o terceiro quadrante, e depois do terceiro ao quarto quadrante, usando um laço estéril cada vez(Figura 1, III - IV).
   6. Usando um laço estéril, faça um último golpe em um padrão zig-zag do quarto quadrante em direção ao meio da placa(Figura 1, V). A prevalência bacteriana será menor nesta área, permitindo idealmente que colônias individuais sejam estabelecidas a partir de uma única célula-mãe viável.
   7. Feche a tampa e (se necessário pelas espécies bacterianas) sela com parafilme para evitar o fluxo de ar.
   8. Dependendo da espécie/cepa bacteriana, coloque a placa de cultura de lado para baixo em um ambiente adequado e incubar até que colônias bacterianas sejam visíveis (colônias segregadas podem aparecer em qualquer área da placa, pois a concentração inicial pode variar).
   9. Para gerar uma população bacteriana clonal, escroto outra placa, trocando o inóculo banhado na placa original por células isoladas de uma única colônia da placa original.

Em uma placa de Petri, se uma única bactéria passar por várias rodadas de reprodução assexuada, isso levará à formação de uma colônia clonal. No entanto, obter uma única bactéria de uma amostra mista, como uma suspensão de solo, pode ser difícil. Se um loop dessa cultura heterogênea for obtido, ele pode conter até um trilhão de bactérias individuais. Para espalhar tantas bactérias na superfície de uma placa de ágar e obter uma única colônia, mesmo usando um padrão em zigue-zague, o loop precisaria ser arrastado continuamente sobre a superfície de placas suficientes colocadas lado a lado para circundar toda a Ilha da Liberdade. Obviamente, os cientistas não usam tantas placas. Em vez disso, eles usam uma técnica chamada chapeamento de raias.

A técnica da placa de listras é baseada na diluição progressiva de uma amostra bacteriana e é realizada sobre a superfície do meio sólido de uma única placa de Petri. Para começar, a superfície da mídia é visualmente dividida em cinco seções, atribuindo quatro fragmentos da circunferência como as primeiras quatro seções e o centro da placa como a quinta. Isso criará efetivamente cinco placas de mídia a partir de uma única placa de Petri. Em seguida, usando um loop cheio de inóculo desejado, a primeira seção é listrada usando um padrão em zigue-zague. Em seguida, um novo laço descartável é usado ou, no caso de um laço de arame, ele é esterilizado com um bico de Bunsen, queimando-o até que esteja em brasa ao longo do comprimento do fio. Esse uso de um novo loop, ou loop de esterilização por chama, remove todas as células bacterianas restantes, auxiliando na diluição das bactérias. O circuito quente é então resfriado no ar por alguns segundos antes de ser arrastado pela primeira seção para criar três a quatro linhas separadas, cada uma carregando apenas uma fração de bactérias para a segunda seção. As seções restantes são listradas da mesma maneira, usando um laço estéril a cada vez e uma única passagem pela faixa anterior.

Usando este ciclo de estrias e esterilização, a concentração bacteriana em cada seção subsequente deve ser diluída para que a seção final contenha apenas algumas bactérias discretamente localizadas. Após a incubação, essas bactérias discretas se multiplicam para produzir colônias clonais isoladas de células-filhas, que são chamadas de Unidades Formadoras de Colônias, ou UFCs. Estes podem ser colhidos e re-listrados para garantir que o trabalho subsequente envolva apenas um único tipo bacteriano, conhecido como cultura pura. Além de isolar colônias únicas de uma cultura bacteriana mista, a técnica de plaqueamento de estrias também é usada para selecionar cepas específicas do meio, determinar a morfologia da colônia bacteriana ou identificar diferentes espécies bacterianas. Neste vídeo, demonstraremos como isolar colônias de bactérias únicas de uma suspensão de amostra de bactérias mistas por meio da técnica de plaqueamento de estrias.

Para começar, coloque luvas de laboratório e um jaleco. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho usando etanol 70%. Em seguida, selecione um meio adequado que sustente a espécie ou cepa bacteriana utilizada e comece a preparar o meio. Aqui, o ágar LB comum é preparado pesando dez gramas de meio em pó pré-formulado e 7,5 gramas de ágar. Adicione os componentes pesados e secos a uma garrafa de vidro que seja capaz de conter o dobro do volume final para evitar transbordamento. Em seguida, adicione 500 mililitros de água à garrafa e tampe-a semi-firmemente. Esterilize a mídia colocando o frasco em uma autoclave ajustada para 121 graus Celsius por vinte minutos. Após a conclusão, use luvas à prova de calor ou uma almofada quente para remover a mídia da máquina e, em seguida, gire imediatamente a tampa da garrafa para fechá-la bem.

Para uso no mesmo dia, deixe a mídia esfriar colocando a garrafa em banho-maria aquecido a aproximadamente 45 graus Celsius, para preservar a mídia em estado líquido. Alternativamente, a mídia pode ser deixada em temperatura ambiente para armazenar no estado sólido. Quando necessário, coloque a garrafa no micro-ondas com a tampa ligeiramente aberta para derreter a mídia e deixe a mídia esfriar usando um banho-maria a 45 graus Celsius.

Em seguida, pegue uma manga de placas de Petri estéreis e, com um marcador permanente, rotule-as com os nomes do investigador e da mídia, bem como a data. Em seguida, transfira o volume necessário de meio para um recipiente estéril e adicione antibióticos ou outros componentes sensíveis, se necessário. Aqui, 50 mililitros de meio são misturados com 100 microlitros de canamicina para uma concentração final de 25 microgramas por mililitro. Gire o tubo para garantir uma distribuição uniforme dos componentes adicionados em toda a mídia. Lentamente, para evitar a formação de bolhas, despeje 20 a 25 mililitros de meio de cultura de aproximadamente 45 graus Celsius em cada uma das placas. Se aparecerem bolhas ou espuma, remova rapidamente usando uma pipeta comum e uma ponta estéril. Em seguida, recoloque imediatamente todas as tampas para evitar contaminação. Deixe o ágar-ágar solidificar em temperatura ambiente por pelo menos duas horas ou durante a noite. Depois de solidificadas, armazene as placas de cultura de cabeça para baixo a quatro graus Celsius para minimizar a condensação na superfície do meio.

Para riscar a cultura de escolha, primeiro pegue uma placa de cultura limpa e remova a tampa. Trabalhando rapidamente, mergulhe uma alça descartável e estéril no inóculo desejado e, em seguida, esfregue imediatamente a alça sobre o primeiro quadrante da placa usando um movimento em zigue-zague. Recoloque a tampa do prato, descarte a alça de inoculação usada e selecione uma nova alça estéril. Usando o novo loop, faça três a quatro movimentos cruzando a linha original do swab que irradia do primeiro quadrante, que deve conter uma população de bactérias relativamente densa no segundo quadrante. Feche a tampa mais uma vez e descarte o laço. Com um novo loop, repita essa ação novamente, mas desta vez passando do segundo para o terceiro quadrante. Em seguida, com um novo laço novamente, faça outra faixa da terceira para a quarta seção da placa. Finalmente, com um novo loop, faça um último traço em zigue-zague do quarto quadrante em direção ao centro da placa. A prevalência bacteriana será menor nesta área, idealmente permitindo que colônias individuais sejam estabelecidas a partir de uma única célula-mãe viável.

Recoloque a tampa da placa e, se apropriado para as espécies bacterianas, sele a placa com filme para evitar o fluxo de ar. Vire a placa de cultura de cabeça para baixo para evitar gotejamentos de condensação e, em seguida, coloque em uma temperatura adequada para o crescimento. Aqui, uma incubadora é ajustada para 37 graus Celsius. Deixe a placa incubar até que as colônias bacterianas sejam visíveis. Para gerar uma população bacteriana clonal, selecione uma colônia discreta desta placa. Agora, com a alça estéril, toque na colônia alvo e, como antes, faça uma faixa no primeiro quadrante de uma nova placa. Continue a esterilizar alternadamente o laço e risque os quadrantes restantes da placa conforme demonstrado anteriormente, terminando com o zigue-zague para o centro. Feche a placa e coloque-a para incubar até que se formem colônias discretas. Uma vez que essas colônias são cultivadas, elas normalmente representam cepas clonais puras.

A placa de estrias inicial pode conter colônias originárias de células de diferentes espécies bacterianas ou células com composição genética diferente, dependendo da pureza da amostra. Por meio do isolamento subsequente de uma única colônia, onde todas as unidades são derivadas de uma célula-mãe comum, o segundo procedimento de estrias gera uma população bacteriana relativamente clonal, adequada para posterior caracterização ou inoculação em caldo.