Culturas puras e semeadura por esgotamento: isolamento de colônias bacterianas únicas de uma amostra mista

Em uma placa de Petri, se uma única bactéria sofrer múltiplas rodadas de reprodução assexuada, levará à formação de uma colônia clonal. No entanto, obter uma única bactéria de uma amostra mista, como uma suspensão do solo, pode ser difícil. Se um loopful desta cultura heterogênea é tomado, ele pode conter até um trilhão de bactérias individuais. Para espalhar tantas bactérias para a superfície de uma placa de ágar e obter uma única colônia, mesmo usando um padrão zig-zag, o laço precisaria ser arrastado continuamente sobre a superfície de placas suficientes definidas lado a lado para cercar toda a ilha da Liberdade. Obviamente, os cientistas não usam tantas placas. Em vez disso, eles usam uma técnica chamada chapeamento de raia.

A técnica da placa de raia é baseada na diluição progressiva de uma amostra bacteriana, e é realizada sobre a superfície de mídia sólida de uma única placa de Petri. Para começar, a superfície da mídia é visualmente dividida em cinco seções, atribuindo quatro fragmentos da circunferência como as quatro primeiras seções, e o centro da placa como o quinto. Isso efetivamente criará cinco placas de mídia a partir de uma única placa de Petri. Em seguida, usando um loopful de inóculo desejado, a primeira seção é listrada usando um padrão zig-zag. Em seguida, ou um novo laço descartável é usado, ou no caso de um laço de fio, ele é esterilizado com um queimador Bunsen, flamejando-o até que esteja vermelho quente ao longo do comprimento do fio. Este uso de um novo laço, ou laço esterilizador de chama, remove todas as células bacterianas restantes, auxiliando na diluição das bactérias. O laço quente é então resfriado no ar por alguns segundos antes de ser arrastado pela primeira seção para criar três a quatro linhas separadas, cada uma carregando apenas uma fração de bactérias para a segunda seção. As seções restantes são listradas da mesma maneira, usando um laço estéril cada vez, e uma única passagem através da raia anterior.

Usando este ciclo de listras e esterilização, a concentração bacteriana em cada seção subsequente deve ser diluída de modo que a seção final contenha apenas algumas bactérias discretamente localizadas. Após a incubação, essas bactérias discretas se multiplicam para produzir colônias clonais isoladas de células filhas, que são chamadas de Unidades formadoras de colônias, ou UFC. Estes podem ser colhidos e re-listrados para garantir que o trabalho subsequente envolva apenas um único tipo bacteriano, referido como uma cultura pura. Além de isolar colônias únicas de uma cultura mestideira, a técnica de chapeamento de raias também é usada para selecionar cepas específicas da mídia, determinar morfologia de colônias bacterianas ou identificar diferentes espécies bacterianas. Neste vídeo, demonstraremos como isolar colônias unibacterianas de uma suspensão de amostra de amostra de amostra de bactérias mistas através da técnica de chapeamento de listras.

Para começar, coloque luvas de laboratório e um jaleco. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho usando 70% de etanol. Em seguida, selecione um meio adequado que sustente as espécies bacterianas ou cepas utilizadas e comece a preparar a mídia. Aqui, o ágar LB comum é preparado pesando dez gramas de mídia pré-formulada, em pó e 7,5 gramas de ágar. Adicione os componentes pesados e secos a uma garrafa de vidro que é capaz de segurar o dobro do volume final para evitar o transbordamento. Em seguida, adicione 500 mililitros de água à garrafa, e tampe-a semi-firmemente. Esterilize a mídia colocando a garrafa em uma autoclave fixada a 121 graus Celsius por vinte minutos. Após a conclusão, use luvas à prova de calor ou uma almofada quente para remover a mídia da máquina e, em seguida, imediatamente torça a tampa da garrafa para fechá-la firmemente.

Para o uso do mesmo dia, deixe a mídia esfriar colocando a garrafa em um banho de água aquecido a aproximadamente 45 graus Celsius, para preservar a mídia em um estado líquido. Alternativamente, a mídia pode ser deixada à temperatura ambiente para armazenar em estado sólido. Quando necessário, micro-ondas a garrafa com a tampa ligeiramente aberta para derreter a mídia, e permitir que a mídia esfrie usando um banho de água de 45 graus Celsius.

Em seguida, pegue uma manga de pratos petri estéreis, e com um marcador permanente, rotule-os com o investigador e nomes da mídia, bem como a data. Em seguida, transfira o volume necessário de mídia para um vaso estéril e adicione antibióticos ou outros componentes sensíveis, se necessário. Aqui, 50 mililitros de mídia são misturados com 100 microliters de Kanamycin para uma concentração final de 25 microgramas por mililitro. Gire o tubo para garantir a distribuição uniforme dos componentes adicionados em toda a mídia. Lentamente, de modo a evitar a formação de bolhas, despeje de 20 a 25 mililitros de aproximadamente 45 graus Celsius de cultura média em cada uma das placas. Se aparecerem bolhas ou espuma, remova rapidamente usando uma pipeta regular e uma ponta estéril. Em seguida, substitua imediatamente todas as tampas para evitar contaminação. Deixe o ágar solidificar à temperatura ambiente por pelo menos duas horas ou durante a noite. Uma vez solidificado, armazene as placas de cultura de cabeça para baixo a quatro graus Celsius para minimizar a condensação na superfície do meio.

Para ver a cultura da escolha, primeiro pegue uma placa de cultura limpa e remova a tampa. Trabalhando rapidamente, submergir um laço descartável e estéril no inóculo desejado e, em seguida, imediatamente esfregar o laço sobre o primeiro quadrante da placa usando um movimento zig-zag. Substitua a tampa do prato, descarte o laço de inoculação usado e selecione um novo laço estéril. Usando o novo loop, faça de três a quatro golpes cruzando a linha original do cotonete irradiando do primeiro quadrante, que deve conter uma população relativamente densa de bactérias no segundo quadrante. Feche a tampa mais uma vez e descarte o laço. Com um novo loop, repita esta ação novamente, mas desta vez se espalhando do segundo para o terceiro quadrante. Em seguida, com um novo loop novamente, faça outra raia do terceiro para a quarta seção da placa. Finalmente, com um loop fresco, faça um último golpe em um padrão zig-zag do quarto quadrante em direção ao centro da placa. A prevalência bacteriana será menor nesta área, permitindo idealmente que colônias individuais sejam estabelecidas a partir de uma única célula materna viável.

Substitua a tampa da placa e, se for o caso, para as espécies bacterianas, sele a placa com para película para evitar o fluxo de ar. Vire a placa de cultura de cabeça para baixo para evitar gotejamentos de condensação e, em seguida, coloque em uma temperatura adequada para o crescimento. Aqui, uma incubadora está programada para 37 graus Celsius. Deixe a placa incubar até que as colônias bacterianas sejam visíveis. Para gerar uma população bacteriana clonal, selecione uma colônia discreta desta placa. Agora, com o laço estéril, toque na colônia alvo, e como antes, faça uma raia no primeiro quadrante de uma nova placa. Continue esterilizando alternadamente o laço e listrar os quadrantes restantes da placa como demonstrado anteriormente, terminando com o zig-zague para o centro. Feche a placa e coloque-a para incubar até formar colônias discretas. Uma vez que essas colônias são cultivadas, elas normalmente representarão cepas clonais puras.

A placa de listras iniciais pode conter colônias originárias de células de diferentes espécies bacterianas ou células com diferentes maquiagens genéticas, dependendo da pureza da amostra. Através do isolamento subsequente de uma única colônia, onde todas as unidades são derivadas de uma célula-mãe comum, o segundo procedimento de listras gera uma população bacteriana relativamente clonal, adequada para caracterização ou inoculação em caldo.