Curvas de crescimento: gerando curvas de crescimento usando unidades formadoras de colônias e medições de densidade óptica

As bactérias se reproduzem por meio de um processo chamado divisão celular, que resulta em duas células-filhas idênticas. Se as condições de crescimento forem favoráveis, as populações bacterianas crescerão exponencialmente.

As curvas de crescimento bacteriano traçam a quantidade de bactérias em uma cultura em função do tempo. Uma curva de crescimento típica progride através de quatro estágios: fase de atraso, fase exponencial, fase estacionária e fase de morte. A fase de atraso é o tempo que leva para as bactérias atingirem um estado em que possam crescer e se dividir rapidamente. Depois disso, a bactéria faz a transição para a fase exponencial, caracterizada por rápido crescimento e divisão celular. A taxa de crescimento exponencial da cultura bacteriana durante esta fase pode ser expressa como o tempo de duplicação, a taxa mais rápida na qual as bactérias podem se reproduzir sob condições específicas. A fase estacionária vem a seguir, onde o crescimento das células bacterianas se estabiliza e as taxas de crescimento e mortalidade se equilibram devido ao esgotamento de nutrientes ambientais. Finalmente, a bactéria entra na fase de morte. É aqui que o crescimento bacteriano diminui drasticamente e a depleção severa de nutrientes leva à lise das células.

Duas técnicas podem ser usadas para quantificar a quantidade de bactérias presentes em uma cultura e traçar uma curva de crescimento. A primeira delas é por meio de unidades formadoras de colônias, ou UFCs. Para obter UFC, uma série de uma a dez de nove diluições é realizada em pontos de tempo regulares. A primeira dessas diluições, negativa neste exemplo, contém 9mL de PBS e 1mL da cultura bacteriana. Resultando em um fator de diluição de 1:10. Em seguida, 1mL dessa solução é transferido para o próximo tubo, menos dois, resultando em um fator de diluição de 1:100. Este processo continua até o último tubo, menos nove, resultando em um fator de diluição final de 1:1 bilhão. Depois disso, 100 microlitros de cada diluição são plaqueados. As placas são então incubadas e as colônias clonais são contadas. A placa de diluição para um determinado ponto de tempo que cresce entre 30 e 300 colônias é usada para calcular as UFCs por mililitro para esse ponto de tempo.

O segundo método comum de medição da concentração bacteriana é a densidade óptica. A densidade óptica de uma cultura pode ser medida instantaneamente, em relação a um meio em branco, com um espectrofotômetro. Normalmente, um comprimento de onda de 600 nanômetros, também conhecido como OD600, é usado para essas medições, que aumentam à medida que a densidade celular aumenta. Embora a densidade óptica seja menos precisa do que as UFCs, é conveniente porque pode ser obtida instantaneamente e requer relativamente poucos reagentes. Ambas as técnicas podem ser usadas juntas para criar uma curva padrão que se aproxime com mais precisão da contagem de células bacterianas de uma cultura. Neste vídeo, você aprenderá como obter medições de UFC e OD600 a partir de diluições seriais cronometradas de E. coli. Em seguida, duas curvas de crescimento usando as medidas UFC e OD600, respectivamente, serão plotadas antes de serem relacionadas por uma curva padrão.

Ao trabalhar com bactérias, é importante usar o equipamento de proteção individual adequado, como jaleco e luvas, e observar a técnica asséptica adequada.

Depois disso, esterilize a estação de trabalho com etanol 70%. Primeiro, prepare o caldo LB e o meio de ágar sólido LB em garrafas autoclaváveis separadas. Depois de fechar parcialmente as tampas dos frascos, esterilize a mídia em uma autoclave ajustada para 121 graus Celsius por 35 minutos. Em seguida, deixe o meio de ágar esfriar em banho-maria ajustado para 50 graus Celsius por 30 minutos. Depois de resfriado, despeje 20 a 25 mL em cada placa de Petri. Depois disso, deixe as placas endurecerem por 24 horas em temperatura ambiente.

Para preparar os isolados de colônia única que mais tarde serão usados para produzir uma cultura bacteriana líquida, use estoque previamente congelado e técnica adequada de plaqueamento de listras para listrar E. coli para isolamento em ágar LB. Incube o prato a 37 graus Celsius durante a noite. Depois disso, resfrie uma alça de inoculação esterilizada por chama no ágar antes de selecionar uma única colônia da placa listrada. Inocule 4 mL de meio líquido em um tubo de ensaio de 15 mL. Em seguida, cultive a E. coli a 37 graus Celsius durante a noite com agitação a 210 rpm.

Para configurar o volume de cultura bacteriana 1:1000 que será usado na curva de crescimento, primeiro obtenha um balão Erlenmeyer autoclavado de 500 mL. Em seguida, use uma pipeta sorológica de 50 mL para transferir 100 mL de meio estéril para o frasco. Em seguida, rotule nove tubos de ensaio de 15 ml consecutivamente como um a nove. Esses números correspondem ao fator de diluição que será usado para calcular a unidade formadora de colônias, ou UFC. Em seguida, adicione 9 mL de 1X PBS a cada tubo. Depois disso, rotule as placas de ágar preparadas com os pontos de tempo correspondentes e fatores de diluição que serão cultivados. Neste exemplo com E. coli, após o ponto de tempo inicial, os pontos de tempo são tomados uma vez a cada hora. Usando a cultura líquida de E. coli durante a noite previamente preparada, inocular o meio no frasco Erlenmeyer de 500 mL da autoclave com volume de cultura 1:1000. Agite a mídia para distribuir uniformemente as bactérias.

Depois de apagar um espectrofotômetro, limpe a cubeta com um pano sem fiapos. Em seguida, dispense 1 mL da cultura na cubeta e coloque-a no espectrofotômetro para obter a densidade óptica da cultura no ponto de tempo zero. Em seguida, cultive a E. coli a 37 graus Celsius com agitação a 210 rpm. Em cada ponto de tempo após o ponto zero, retirar do balão mais 1 ml de cultura bacteriana e repetir a medição da densidade óptica. Se a leitura da densidade óptica for maior que 1,0, dilua 100 microlitros de cultura bacteriana com 900 microlitros de meio fresco e meça a densidade óptica mais uma vez. Este valor pode ser multiplicado por 10 para a medição OD 600.

Para obter a medida da unidade formadora de colónias para cada ponto de tempo, retire mais 1 ml de cultura bacteriana do balão em cada ponto de tempo. Dispense a cultura bacteriana no tubo de ensaio negativo e no vórtice para misturar. Em seguida, execute a série de diluição transferindo primeiro 1 mL do tubo negativo para o tubo negativo dois e vórtice para misturar. Transfira 1 mL dos dois tubos negativos para os três tubos negativos e vortex para misturar. Continuar esta transferência em série por todos os tubos de diluição até ao tubo nove negativo. Dispense 100 microlitros de suspensão de células na placa rotulada correspondente para cada diluição. Para cada diluição, esterilize um espalhador de células em etanol, passe-o por uma chama de bico de Bunsen e resfrie-o tocando a superfície do ágar longe do inoculado. Em seguida, use o espalhador de células para espalhar a suspensão de células até que a superfície da placa de ágar fique seca. Incube as placas de cabeça para baixo a 37 graus Celsius. Assim que surgirem colônias visíveis, conte o número de colônias bacterianas em cada placa. Registar estes valores e os factores de diluição associados para cada placa em cada momento.

Para criar uma curva de crescimento OD 600, depois de garantir que todos os pontos de dados sejam inseridos corretamente em uma tabela, selecione todos os pontos de tempo e seus dados correspondentes. Para gerar um gráfico de curva de crescimento unitário formador de colônias, escolha a placa de diluição onde as contagens de colônias caíram dentro do intervalo de 30 a 300 bactérias para cada ponto de tempo. Multiplique o número de contagem de colônias pelo fator de diluição e depois por dez. Isso ocorre porque a propagação de 100 microlitros é considerada uma diluição adicional de 1:10 ao calcular as unidades formadoras de colônias por mililitro. Depois disso, plote as unidades formadoras de colônias versus o tempo em uma escala semi-logarítmica.

Esses gráficos produzidos com medições OD 600 e UFC, respectivamente, podem fornecer informações valiosas sobre a cinética de crescimento de E. coli. A densidade óptica e as unidades formadoras de colônias podem ser relacionadas, de modo que as UFC por mililitro podem ser estimadas a partir de medições de OD 600, economizando tempo e materiais em experimentos futuros.

Para fazer isso, plote as unidades formadoras de colônias em relação à densidade óptica em uma escala linear para leituras de OD 600 menores ou iguais a 1. 0. Depois disso, gere uma linha de tendência de regressão linear no formato Y = MX + B, onde M é a inclinação e B é a interceptação y. Clique com o botão direito do mouse nos pontos de dados e selecione adicionar linha de tendência e linear. Em seguida, marque a caixa para exibir a equação no gráfico e exibir o valor de R ao quadrado no gráfico. O valor de R ao quadrado é a medida estatística de quão próximos os dados corresponderam à linha de regressão ajustada. Neste exemplo, os primeiros 6 pontos de tempo são plotados com OD 600 no eixo x e CFUs por mililitro no eixo y. Em experimentos futuros com as mesmas condições de crescimento, esses valores de inclinação e interceptação y podem ser inseridos nessa equação para estimar UFCs a partir de leituras de OD 600. Em seguida, observe o gráfico da curva de crescimento da unidade formadora de colônias. Durante a fase exponencial, identifique dois pontos de tempo com a inclinação mais acentuada entre eles. Para calcular o tempo de duplicação, primeiro calcule a mudança no tempo entre os pontos de tempo selecionados. Em seguida, calcule a mudança nas gerações usando a equação mostrada aqui. Aqui, b minúsculo é o número de bactérias no ponto de tempo três e B maiúsculo é o número de bactérias no ponto de tempo dois. Finalmente, divida a mudança no tempo pela mudança nas gerações. Neste exemplo, o tempo de duplicação é 0. 26 horas ou 15 minutos e 19 segundos. A comparação dos tempos de duplicação em diferentes tratamentos experimentais nos permite identificar as melhores condições de crescimento para uma determinada espécie bacteriana. Portanto, o tratamento com o menor tempo de duplicação será o mais ideal das condições testadas.