Curvas de crescimento: gerando curvas de crescimento usando unidades formadoras de colônias e medições de densidade óptica

1. Configuração

1. Materiais de laboratório necessários: mídia líquida, mídia de ágar solidificada, frascos de Erlenmeyer, tubos de ensaio de 15 mL, soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), espalhador de células bacterianas, 70% de etanol e um espectotógrafo. Todas as soluções e vidros devem ser esterilizados antes do uso.
2. Prepare a estação de trabalho esterilizando com 70% de etanol. Trabalhe perto de um queimador bunsen para evitar a contaminação da mídia.
3. Ao trabalhar com bactérias, devem ser utilizados equipamentos de proteção individual adequados e técnica asséptica. Um jaleco e luvas são necessários ao trabalhar com culturas bacterianas.
4. Receitas para buffers, soluções e reagentes
   1. Salino tampão fosfato (PBS) (8).
   2. Caldo Luria-Bertani (LB) (9).

2. Protocolo

1. Preparação de Mídia
   1. Identifique a mídia de crescimento com a qual cultivar as bactérias e prepare tanto caldo líquido quanto ágar sólido (1,5% w/v ágar) em garrafas autoclaváveis separadas. Aqui, caldo LB e ágar LB foram preparados para o crescimento de Escherichia coli.
   2. Esterilize a mídia com uma tampa semi-apertada em uma autoclave definida para 121 °C por 35 min.
   3. Para a mídia de ágar, depois de autoclaving, coloque em um banho de água definido para 50 °C por 30 minutos para esfriar. Uma vez resfriado, despeje 20-25 mL de ágar em pratos de Petri circulares de 100x15mm. Deixe as placas fixar 24 horas em temperatura ambiente antes de usar.
2. Preparação Inicial de Bactérias
   1. Do estoque congelado, bactérias de raia para isolamento em ágar de mídia selecionado para obter isolados de colônia única. Incubar em condições de crescimento permitidas para as bactérias escolhidas. Aqui, E. coli é listrado em ágar LB e é incubado a 37 °C durante a noite (16-18h).
   2. Usando um laço de inoculação estéril, selecione uma única colônia da placa de raia e inocula a mídia líquida de 4 mL em um tubo de ensaio de 15 mL e cresça em condições permitidas para as bactérias escolhidas. Aqui, E. coli é cultivado a 37 °C com tremor a 210 rpm durante a noite (16-18h).
3. Configuração da curva de crescimento
   1. Preparação de frascos de crescimento
      1. Autoclave apropriadamente dimensionado frascos Erlenmeyer. Normalmente, é usada uma proporção de 1:5 de mídia para o volume total de frascos. Aqui, 100 mL LB mídia é usado em um frasco de 500 mL.
      2. Usando uma pipeta sorológica, transfira mídia estéril para o frasco de Erlenmeyer.
   2. Preparação da série de diluição
      1. Rotular tubos de ensaio de 15 mL: -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 e -9, distribuindo 9mL PBS em cada um. Esses números correspondem ao fator de diluição utilizado para o cálculo da UFC/mL. Um novo conjunto de tubos é necessário para cada ponto de tempo de coleta. (Figura 2)
   3. Preparação da placa de ágar
      1. Placas de etiqueta com tempo de coleta e fator de diluição. Para cada ponto de tempo haverá uma placa para cada diluição.
4. Protocolo da Curva de Crescimento
   1. Inoculação da mídia
      1. Usando a cultura líquida durante a noite preparada como parte do passo 2.2.2, inocular a mídia de frasco com 1:1000 volume de cultura. Aqui, 100 μL cultura líquida durante a noite é adicionada a 100 mL de mídia LB.
      2. Redemoinho a mídia para distribuir uniformemente as bactérias.
   2. Coleção de ponto de tempo
      1. Configuração da condição de crescimento
         1. Coloque frascos em condições experimentais de crescimento escolhidas para as bactérias dadas. Os pontos de tempo devem ser tomados com frequência para bactérias de rápido crescimento e podem ser tomados em intervalos mais longos para bactérias de crescimento lento. Aqui, E. coli é cultivado a 37°C com agitação a 210 revoluções por minuto (rpm) e pontos de tempo tomados a cada 1 hora.
      2. Medição da densidade óptica (OD600)
         1. Em cada ponto de tempo, incluindo o ponto de tempo inicial (t = 0), retire 1 mL de cultura bacteriana e dispense em um cuvette espectrômetro.
         2. Limpe a cuvette limpa e registe a densidade óptica em comprimento de onda de 600 nm. Se a leitura de densidade óptica for superior a 1,0, diluir 100 μL de cultura 1:10 com 900 μL de mídia fresca, registo a densidade óptica e multiplique esse valor por 10 para a medição OD600.
      3. Medição da unidade de formação de colônias (UFC/mL)
         1. Em cada ponto de tempo, retire 1 mL de cultura bacteriana e dispense no tubo de ensaio de vidro -1 contendo 9 mL de PBS.
         2. Para a série de diluição, transfira serialmente 1 mL do tubo -1 para baixo todos os tubos de diluição para o -9, vórtice após cada transferência. (Figura 2)
         3. Para cada diluição, dispense 100 μL de suspensão celular à placa de ágar de mídia sólida correspondentemente rotulada. (Figura 2)
         4. Usando um espalhador de células que foi esterilizado em etanol, passou por uma chama de queimador Bunsen, e resfriado tocando a superfície do ágar, espalhe os 100 μL de suspensão celular até que a superfície da placa de ágar seque.
         5. Incubar as placas de spread de cabeça para baixo a uma temperatura que suporta o crescimento das bactérias. Aqui, E. coli é incubado a 37°C.
         6. Após a incubação, uma vez que surgem colônias visíveis, conte o número de colônias bacterianas em cada placa e regisse esses valores juntamente com seu fator de diluição associado para todas as placas em cada ponto de tempo.

3. Análise e Resultados de Dados

1. Gráfico da curva de crescimento de densidade óptica (OD600)
   1. Plote a densidade óptica (OD600) versus o tempo em uma escala de semi-log. (Figura 3)
2. Lote da curva de crescimento da Unidade de Formação de Colônias (CFU/mL)
   1. Para cada ponto de tempo, escolha a placa de diluição onde a contagem da colônia caiu dentro da faixa de 30-300 bactérias. Multiplique o número da contagem de colônias pelo fator de diluição e, em seguida, por 10, pois o spread de 100 μL é considerado uma diluição adicional de 1:10 no cálculo da UFC/mL.
      
   2. Plote as unidades formadoras da colônia versus o tempo em uma escala de semi-log. (Figura 4)
3. Relacionando densidade óptica e unidades formadoras de colônias
   1. Plote as unidades formadoras da colônia versus densidade óptica em escala linear para leituras OD600 menores ou iguais a 1,0 OD600, pois a relação entre OD600 e CFU/mL é menos precisa além de 1.0 OD600. Aqui, os primeiros seis pontos de tempo estão traçados. (Figura 5)
   2. Gerar uma linha de tendência de regressão linear exibindo a equação e o valor R^2.
4. Determinando o tempo de duplicação de bactérias
   1. Utilizando a curva de crescimento da unidade formadora da colônia, durante a fase exponencial, identifique dois pontos no gráfico com a inclinação mais íngreme entre eles para calcular o tempo de duplicação.
   2. Calculando o tempo de duplicação
      1. 
      2. ΔTime = t₂ - t₁, onde t₁ = Ponto de tempo 1 e t₂ = Ponto de tempo 2
      3. , onde b = número de bactérias em t₂, B = número de bactérias em t₁, e n = número de gerações. Derivado de: .
      4. Calcule o tempo de duplicação usando: