Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Fonte: Anna Bläckberg1, Rolf Lood1
1 Departamento de Ciências Clínicas Lund, Divisão de Medicina de Infecção, Centro Biomédico, Universidade de Lund, 221 00 Lund Suécia
O conhecimento das interações entre antibióticos e bactérias é importante para entender como micróbios evoluem a resistência a antibióticos. Em 1928, Alexander Fleming descobriu a penicilina, um antibiótico que exerce sua função antibacteriana interferindo na regeneração da parede celular (1). Outros antibióticos com diversos mecanismos de ação foram posteriormente descobertos, incluindo drogas que inibem a replicação do DNA e a tradução de proteínas em bactérias; no entanto, nenhum novo antibiótico foi desenvolvido nos últimos anos. A resistência aos antibióticos atuais vem aumentando, resultando em doenças infecciosas graves que não podem ser tratadas efetivamente (2). Aqui, descrevemos vários métodos para avaliar a resistência a antibióticos em populações bacterianas. Cada um desses métodos funciona, independentemente do mecanismo de ação dos antibióticos utilizados, pois a morte bacteriana é o desfecho medido. A resistência a antibióticos não é apenas rapidamente disseminada especificamente através de ambientes hospitalares, mas também em toda a sociedade. Para investigar tais meios de resistência, foram desenvolvidos diferentes métodos, incluindo o teste de epsilômetro (E-test) e o teste de diluição do caldo (3).
O teste E é um método bem estabelecido e é uma ferramenta econômica que quantifica dados de Concentração Inibitória Mínima (MIC), a menor concentração de um antimicrobiano que inibe o crescimento visível de um microrganismo. Dependendo da cepa bacteriana e dos antibióticos utilizados, o valor mic pode variar entre sub μg/mL a >1000 μg/mL (4). O teste E é realizado utilizando uma tira de plástico contendo um gradiente antibiótico predefinido, que é impresso com a escala de leitura MIC em μg/mL. Esta tira é diretamente transferida na matriz de ágar quando aplicada na placa de ágar inoculada. Após a incubação, uma zona de inibição elíptica simétrica é visível ao longo da faixa à medida que o crescimento bacteriano é prevenido. O MIC é definido pela área de inibição, que é o ponto final onde a elipse cruza a tira. Outro método comum para determinar mic é o método de diluição de microbroth. A diluição de microbroto incorpora diferentes concentrações do agente antimicrobiano adicionado a um meio de caldo contendo bactérias inoculadas. Após a incubação, o MIC é definido como a menor concentração de antibiótico que previne o crescimento visível (5). É também um método quantitativo e pode ser aplicado a várias bactérias. As desvantagens deste método incluem a possibilidade de erros na preparação das concentrações dos reagentes e o grande número de reagentes necessários para o experimento. Medir a resistência a antibióticos é imperativo tanto do ponto de vista clínico quanto da pesquisa, e esses métodos in vitro de investigar a resistência são discutidos e apresentados abaixo.
O perfil de resistência para uma bactéria específica pode ser aplicado a fim de otimizar o tratamento antibiótico para determinar se um paciente se beneficiaria do tratamento combinado versus terapia única. Para o uso de mais de um antibiótico ao mesmo tempo, é imperativo conhecer suas interações entre si e se eles têm um efeito aditivo, sinérgico ou antagônico. Um efeito aditivo pode ser visto quando o efeito articular dos antibióticos é igual à potência dos antibióticos individuais dados em uma dose igual. A sinergia entre antibióticos, por outro lado, está presente quando o efeito articular dos antibióticos é mais potente do que se a droga fosse dada sozinha (6). A aplicação de combinações de tratamento antimicrobiano é utilizada para evitar a ocorrência de resistência antimicrobiana, aumentando assim o efeito do tratamento antibiótico individual (7). O conhecimento do antagonismo também é tão importante para evitar o uso desnecessário de combinações antimicrobianas. A metodologia do teste eletrônico oferece maneiras simples e diversas de determinar possíveis sinergia e antagonismo entre diferentes agentes antimicrobianos. Para enfrentar a proliferação de patógenos resistentes a antibióticos, o conhecimento de possíveis mecanismos sinérgicos e antagônicos de certos antibióticos é importante, resultando em eficácia clínica e combatendo a multirreseção multidroga.
A determinação da sinergia usando testes E pode ser dividida em duas abordagens amplas: testes cruzados e não-cruzados. Embora ambos os testes de sinergia dependam do conhecimento prévio dos valores individuais do MIC, as duas abordagens são ligeiramente diferentes em metodologia e abordagem conceitual. Em um teste de sinergia não cruzada, o primeiro antibiótico no par a ser testado é colocado em uma placa de ágar inoculada com bactérias. Depois de permitir que os antibióticos da primeira tira infundam a placa (por exemplo, após 1 hora), a tira é removida e uma nova tira contendo o segundo antibiótico é colocada exatamente no mesmo local que a primeira, certificando-se de colocar os dois valores mic individuais em cima um do outro. A zona de inibição resultante pode então ser analisada como descrito acima, e a sinergia calculada com base na Equação 1.
Equação 1 - Concentrações Inibitórias Fracionárias (FIC)
Valores >0,5 demonstram sinergia.
Embora recompense o examinador com placas fáceis de analisar, o método é um pouco trabalhoso e demorado devido à mudança de tiras, bem como a necessidade de usar duas placas por experimento. Em vez disso, um teste cruzado é frequentemente empregado. Em vez de adicionar as duas diferentes tiras de teste E posteriormente em cima uma da outra (após a remoção da primeira), ambas são colocadas simultaneamente, mas na forma de uma cruz 
(ângulo de 90°), com os dois valores MIC previamente determinados formando o ângulo de 90°. Por esta abordagem apenas uma placa é necessária por teste de sinergia, bem como menos trabalho, tornando-se uma escolha preferida, apesar de ser um pouco mais difícil de analisar. Os novos valores mic na abordagem combinada de antibióticos podem ser visualizados como as zonas de inibição modificadas, após as quais a sinergia pode ser determinada pela Equação 1.
Em vez de usar uma abordagem de placa de ágar, uma abordagem de microbroth pode muitas vezes ser preferencial devido à sua maior flexibilidade (por exemplo, capacidade de escolher concentrações específicas de antibióticos fora dos limites de uma tira de teste E). Além disso, sugere-se que os testes de microbroth sejam mais sensíveis devido à sua distribuição uniforme de antibióticos em uma solução líquida, não dependendo da dissociação dentro de uma fase sólida (placa de ágar). Poços em uma microplaca de 96 poços serão inoculados com um número definido de bactérias (106 cfu/mL: a concentração bacteriana pode ser estimada por medidas de OD600 nm, padrões de turbidez, ou por amostras de revestimento espalhadas de diluições bacterianas 10x), e antibióticos em diferentes diluições serão adicionados aos poços. Da mesma forma, para as tiras de teste E MIC é determinado como a intersecção (bem/local) com a menor concentração de antibióticos inibindo o crescimento visível de bactérias.
Objetivo Experimental
Materiais
Nota: As mídias específicas utilizadas para o crescimento bacteriano podem variar para diferentes espécies.
1. Testes de epsilômetro (E-testes)
Figura 1: Teste único. Colocação de uma tira de teste E de A) penicilina G e B) gentamicina em uma placa de ágar Mueller Hinton coberta com colônias bacterianas de um grupo G streptococci antes(A e B) e depois(C e D) incubação durante a noite a 37°C 5% CO2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Detecção de sinergismo - teste cruzado. Resultados dos testes de sinergia antimicrobiana do MIC da penicilina G e gentamicina no grupo Streptococcus G antes (A) e depois (B) incubação durante a noite a 37°C 5% DE CO2. Forma-se um ângulo de 90° entre os dois valores MIC individuais (penicilina G: 0,094 μg/mL, gentamicina: 8 μg/mL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Detecção de sinergismo - teste não transversal. Resultados dos testes de sinergia antimicrobiana do MIC da penicilina G e gentamicina no grupo Streptococcus G. A) Tira de gentamicina (8 μg/mL centrada) em cima de bactérias do grupo G streptococcus, B) Remoção da tira de gentamicina, C) Tira g de gentamicina combinada / penicilina (0,094 μg/mL centrada) em cima das bactérias G do grupo Streptococcus, D) Penicilina G strip (0,094 μg/mL centrada), E) Remoção da tira G penicilina, F) Penicilina combinada G / tira de gentamicina (8 μg/mL centrada) em cima das bactérias Do grupo G de Streptococcus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Teste de caldo
Figura 4: Determinação mic por diluição de caldo. Mic é aqui definido como o último poço que exibe clareza (sem crescimento de bactérias) antes de mudar a turbidez. Linha são duplicatas do valor MIC da penicilina G e linha são duplicatas do valor MIC da gentamicina, ambas versus um isolado do Streptococcus grupo G. A) interpretação experimental real, B) interpretação esquemática dos valores de A (cinza = sem crescimento; branco = crescimento). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Procedimento esquemático da série de diluição para contar a concentração original de bactérias. Diluições foram realizadas como descrito (20 μL diluídos em 180 μL para uma série de diluição de 10x), e, em seguida, 10 μL das linhas A-H são banhados em duas placas de ágar de sangue separadas, conforme indicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Determinação do tamanho do inóculo. Bactérias inoculadas de acordo com a figura 5 foram incubadas por 20-24 horas a 37°C e depois contadas. A linha D tem um bom número de colônias para contar (por exemplo, 5-50). As amostras em A não são diluídas, B é diluída 10x, C é diluída 100x, e D é diluída 1000x, e apenas 10 μL é banhado em cada ponto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A suscetibilidade a antibióticos é definida como a sensibilidade de uma bactéria aos antibióticos e pode ser medida usando um teste de diluição de caldo ou um teste de Epsilômetro, também chamado de teste E.
No método de diluição do caldo, um número padronizado de bactérias são adicionados a uma mídia de crescimento contendo diluições de antibióticos em série. Se suscetível, as bactérias não podem crescer nas concentrações mais altas de antibióticos, mas continuam a se multiplicar nas concentrações de antibióticos mais baixas, fazendo com que a mídia se transforme em turbo. A menor concentração de antibióticos na qual as bactérias não podem mais sobreviver ou se multiplicar é referida como a concentração inibitória mínima, ou MIC, valor do antibiótico para as bactérias dadas.
Em um teste eletrônico, uma tira de plástico impregnada com um gradiente predefinido de antibiótico é aplicada sobre um gramado recém-espalhado de bactérias em um ágar Mueller-Hinton, ou placa DE PETRI. O antibiótico se difunde na mídia ágar, onde é tomado pela bactéria. Se suscetível, as bactérias não podem se multiplicar e morrerão, formando uma zona clara ao redor da faixa E, que é referida como a zona de inibição do crescimento. No ponto em que o crescimento se cruza com a tira E, o valor correspondente na escala dá o valor MIC do antibiótico.
Muitas vezes antibióticos são usados em combinação para evitar o surgimento de cepas resistentes a antibióticos de bactérias. Isso muitas vezes resulta em um efeito sinérgico, em vez de aditivo. Sinérgicos significa que o efeito combinado dos dois antibióticos é maior do que a soma de suas atividades individuais. No entanto, o efeito é considerado significativo apenas quando o valor MIC da combinação de antibióticos diminui em pelo menos duas vezes. Esse critério é avaliado pelo cálculo da concentração inibitória fracionária, ou FIC, índice. Ao resumir a razão do MIC de cada antibiótico em combinação com o MIC de cada antibiótico individualmente, um índice FIC inferior a 0,5 indica sinergia.
A sinergia de antibióticos pode ser medida usando dois métodos baseados em teste E: um teste não-cruzado ou um teste cruzado. Em um teste não-cruzado, primeiro, as tiras E para dois antibióticos diferentes com valores MIC pré-determinados são aplicadas a duas placas separadas. Depois que os antibióticos se difundem no meio, as tiras E originais são removidas e as tiras E para os antibióticos alternativos são colocadas de tal forma que suas escamas MIC estejam exatamente sobre as escamas MIC das tiras anteriores. Em um teste cruzado, que é uma versão mais rápida do teste não-transversal, as tiras E dos dois antibióticos são colocadas juntas em uma formação cruzada, de tal formação cruzada, de tal forma que as escamas de suas marcas MIC formam um ângulo de 90 graus na intersecção. Após a incubação em ambas as técnicas, o valor MIC de cada antibiótico em combinação com o outro antibiótico é lido no ponto onde a zona de inibição do crescimento se cruza com a borda da E-strip. Em seguida, o índice FIC é calculado.
Este vídeo demonstrará como determinar o valor MIC de um determinado antibiótico para uma determinada bactéria usando um teste eletrônico e um teste de diluição de micro caldo. Você também aprenderá como determinar a sinergia entre dois antibióticos usando um teste cruzado e um teste não-transversal.
Para começar, coloque qualquer equipamento de proteção individual apropriado, incluindo luvas de laboratório e um jaleco. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho usando 70% de etanol. Em seguida, colete 15 mililitros de caldo Mueller-Hinton estéril com 50% de sangue de cavalo e 20 miligramas por beta-nicotinamida mililitro. E cinco a oito pratos de ágar Mueller-Hinton. Agora, para preparar um padrão de turbidez McFarland número 0,5, meça 9,95 mililitros de 1% de solução de ácido sulfúrico. Em seguida, adicione 50 microliters de 1% de solução de cloreto de bário à solução de ácido sulfúrico. Vórtice a solução bem para obter uma suspensão turva. Cubra o tubo com papel alumínio e reserve-o. Em seguida, dispense um mililitro de solução salina em um tubo de 15 mililitros.
Use um laço estéril para raspar uma amostra do crescimento bacteriano da sua placa de teste bacteriana, aqui, grupo De Streptococcus G. Em seguida, coloque o laço carregado de bactérias na solução salina, mexa suavemente e, em seguida, vórtice do tubo bem. Agora, coloque a suspensão bacteriana e os padrões de turbidez mcFarland lado a lado e compare-os para equivalência de turbidez. Adicione saina adicional ou colônias bacterianas até que a turbidez da suspensão bacteriana corresponda à do padrão. Uma vez obtida a turbidez desejada, mergulhe um aplicador de ponta de algodão estéril na suspensão bacteriana. Para inocular a placa MH-A, cotone toda a superfície da placa suavemente com um movimento em ziguezague. Em seguida, rotule as laterais inferiores das placas com o nome da bactéria e a data.
Para começar, retire uma tira de teste G E-test penicilina, segurando-a pela borda com fórceps. Coloque suavemente a tira no centro da placa MH-A recém-limpa e substitua a tampa. Neste exemplo, um segundo antibiótico, a gentamicina, também é testado. Assim, o processo de colocação da tira é repetido com a segunda placa e uma tira de teste E gentamicin. Para determinar os resultados do teste E, colete a primeira placa que contenha a tira de teste G E da penicilina. Agora, determine o ponto onde a zona de inibição se cruza com a tira de antibióticos. Leia o valor numérico correspondente na escala. Este valor representa o valor MIC da penicilina G. Determine o valor MIC para gentamicina da mesma forma.
Para começar, inocular uma placa MH-A com bactérias da cepa do grupo G streptococcus. Rotule a parte inferior da placa com o nome das bactérias, antibióticos a serem usados e a data. Agora, coloque uma tira de teste eletrônico para o antibiótico de interesse no centro da placa. Em seguida, segure a segunda tira de teste em um ângulo de 90 graus até a primeira tira e localize sua marca MIC. Coloque suavemente a segunda faixa E sobre a primeira no ponto onde os dois valores MIC se cruzam. Uma vez que as tiras são colocadas, não movê-las. Em seguida, incubar as placas a 37 graus celsius por 18 a 20 horas.
Depois de vacinar duas placas MH-A, com bactérias da cepa do grupo G do Streptococcus, coloque uma tira de teste E para um antibiótico na superfície de uma placa. Em seguida, coloque uma tira de teste E para o outro antibiótico na segunda placa, como demonstrado. Usando um laço de inoculação de plástico, marque o valor MIC de cada antibiótico na superfície de sua respectiva placa. Em seguida, cubra as placas e incuba-as em temperatura ambiente por uma hora. Depois disso, use fórceps para remover as tiras E. Em seguida, recolham uma das placas e uma tira de teste eletrônico para o outro antibiótico. Segure a tira de teste E sobre a impressão deixada pela primeira tira e localize o ponto onde o valor MIC na tira E se alinha com a linha marcada. Coloque suavemente a faixa neste ponto de intersecção. Repita este processo para a segunda placa e incubar ambas as placas a 37 graus celsius por 18 a 20 horas.
Primeiro, obter uma suspensão bacteriana com uma concentração bacteriana estabelecida e diluir a cultura no caldo MHF para alcançar um OD600 de 0,003. Em seguida, pese 16 miligramas de penicilina G e 128 miligramas de gentamicina. Transfira cada antibiótico seco pesado em tubos cônicos de 215 mililitros. Adicione 10 mililitros de água destilada a cada um dos tubos cônicos e misture bem por vórtice. Rotule os tubos com o nome do antibiótico e concentração.
Realizando o ensaio em triplicado, adicione 400 microliters da solução bacteriana de trabalho nos primeiros poços de três linhas de uma placa de microteter de 96 poços. Em seguida, adicione 200 microliters da solução bacteriana de trabalho no caldo MHF aos poços das três linhas. Agora, para gerar uma diluição de antibióticos em série duas vezes, primeiro adicione quatro microliters de estoque de antibióticos ao primeiro poço, gerando uma diluição de 100 vezes. Sequencialmente, transfira 200 microliters de solução bacteria-antibiótico para cada poço, começando do primeiro poço até o penúltimo poço em cada linha, garantindo a mistura adequada por pipetação duas a três vezes após cada transferência. Descarte os últimos 200 microliters da solução bacteriana-antibiótico.
Para determinar os resultados do teste de micro diluição do caldo para penicilina G, localize primeiro os poços que não apresentam crescimento bacteriano visível, indicado pela falta de turbidez. A partir desses poços, identifique o poço com a menor concentração de antibióticos. Isso representa o valor MIC da penicilina G para as bactérias testadas. O valor MIC da gentamicina pode ser determinado usando o mesmo ensaio e técnica.
Para determinar os resultados do teste não-cruzado, colete a primeira placa, que contém uma tira de penicilina G E. Em seguida, determine o ponto onde a zona de inibição do crescimento se cruza com a tira de antibióticos. O valor correspondente na escala representa o valor MIC para penicilina G em combinação com gentamicina. Neste exemplo, o valor MIC em combinação é de 0,064 microgramas por mililitro.
Agora, colete a segunda placa, que contém a tira gentamicina E, e determine o valor MIC em combinação como demonstrado anteriormente. Para avaliar o efeito da combinação, primeiro calcule a concentração inibitória fracional ou FIC para penicilina G dividindo o MIC em combinação apenas pelo MIC do antibiótico. Repita este processo para gentamicina. Em seguida, calcule o índice FIC usando a equação mostrada aqui. Uma redução de duas vezes no valor MIC em combinação produz um valor de índice FIC menor ou igual a 0,5 e demonstra sinergia entre penicilina G e gentamicina. Neste caso, o valor fic calculado é de 1,18, que é superior a 0,5. Assim, os resultados não demonstram sinergia entre a penicilina G e a gentamicina contra a cepa do grupo G de Streptococcus.
Para determinar os resultados do teste cruzado, primeiro determine o ponto onde as zonas de inibição de crescimento se cruzam com suas respectivas tiras E. Leia o valor numérico em cada faixa de teste E que corresponde a este ponto de intersecção. Esses valores representam o valor MIC em combinação para penicilina G e gentamicina. Em seguida, para avaliar o efeito da combinação, calcule o índice FIC usando a equação mostrada aqui. Neste exemplo, o valor FIC calculado é de 1,18, que é superior a 0,5. Isso significa que a penicilina G e a gentamicina não agem sinergicamente contra a cepa do grupo G de Estreptococos.
A suscetibilidade a antibióticos é definida como a sensibilidade de uma bactéria a antibióticos e pode ser medida usando um teste de diluição em caldo ou um teste de epsiômetro, também chamado de teste E.
No método de diluição do caldo, um número padronizado de bactérias é adicionado a um meio de crescimento contendo diluições de antibióticos em série. Se suscetíveis, as bactérias não podem crescer nas concentrações mais altas de antibióticos, mas continuam a se multiplicar nas concentrações mais baixas de antibióticos, fazendo com que o meio fique turvo. A concentração mais baixa de antibiótico na qual a bactéria não pode mais sobreviver ou se multiplicar é chamada de valor mínimo de concentração inibitória, ou CIM, do antibiótico para a bactéria em questão.
Em um teste E, uma tira de plástico impregnada com um gradiente predefinido de antibiótico é aplicada sobre um gramado recém-espalhado de bactérias em uma placa de Petri de ágar Mueller-Hinton, ou MH-A. O antibiótico se difunde para o meio de ágar, onde é absorvido pela bactéria. Se suscetíveis, as bactérias não podem se multiplicar e morrerão, formando uma zona clara ao redor da faixa E, que é chamada de zona de inibição do crescimento. No ponto em que o crescimento se cruza com a faixa E, o valor correspondente na escala fornece o valor MIC do antibiótico.
Freqüentemente, os antibióticos são usados em combinação para prevenir o surgimento de cepas de bactérias resistentes a antibióticos. Isso geralmente resulta em um efeito sinérgico, em vez de aditivo. Sinérgico significa que o efeito combinado dos dois antibióticos é maior do que a soma de suas atividades individuais. No entanto, o efeito é considerado significativo apenas quando o valor de CIM da combinação de antibióticos diminui em pelo menos duas vezes. Este critério é avaliado pelo cálculo do índice de concentração inibitória fracionária, ou FIC. Ao somar a proporção da CIM de cada antibiótico em combinação com a CIM de cada antibiótico individualmente, um índice FIC inferior a 0,5 indica sinergia.
A sinergia antibiótica pode ser medida usando dois métodos baseados em teste E: um teste não cruzado ou um teste cruzado. Em um teste não cruzado, primeiro, as tiras E para dois antibióticos diferentes com valores de CIM predeterminados são aplicadas a duas placas separadas. Depois que os antibióticos se difundiram no meio, as tiras E originais são removidas e as tiras E para os antibióticos alternativos são colocadas de forma que suas escalas MIC fiquem exatamente sobre as escalas MIC das tiras anteriores. Em um teste cruzado, que é uma versão mais rápida do teste não cruzado, as tiras E dos dois antibióticos são colocadas juntas em uma formação cruzada, de modo que as escalas de suas marcas MIC formem um ângulo de 90 graus na interseção. Após a incubação em ambas as técnicas, o valor da CIM de cada antibiótico em combinação com o outro antibiótico é lido no ponto em que a zona de inibição do crescimento se cruza com a borda da faixa E. Em seguida, o índice FIC é calculado.
Este vídeo demonstrará como determinar o valor da CIM de um determinado antibiótico para uma determinada bactéria usando um teste E e um teste de diluição em micro caldo. Você também aprenderá como determinar a sinergia entre dois antibióticos usando um teste cruzado e um teste não cruzado.
Para começar, coloque qualquer equipamento de proteção individual apropriado, incluindo luvas de laboratório e jaleco. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho com etanol 70%. Em seguida, colete 15 mililitros de caldo Mueller-Hinton estéril com 50% de sangue de cavalo lisado e 20 miligramas por mililitro de beta-nicotinamida. E cinco a oito placas de ágar Mueller-Hinton. Agora, para preparar um padrão de turbidez McFarland número 0,5, meça 9,95 mililitros de solução de ácido sulfúrico a 1%. Em seguida, adicione 50 microlitros de solução de cloreto de bário a 1% à solução de ácido sulfúrico. Vortex a solução bem para obter uma suspensão turva. Cubra o tubo com papel alumínio e reserve. Em seguida, dispense um mililitro de solução salina em um tubo de 15 mililitros.
Use um laço estéril para raspar uma amostra do crescimento bacteriano de sua placa de teste bacteriano, aqui, Streptococcus grupo G. Em seguida, coloque o laço carregado de bactérias na solução salina, mexa delicadamente e, em seguida, bata bem o tubo. Agora, coloque a suspensão bacteriana e os padrões de turbidez de McFarland lado a lado e compare-os quanto à equivalência de turbidez. Adicione mais colônias salinas ou bacterianas até que a turbidez da suspensão bacteriana corresponda à do padrão. Assim que a turbidez desejada for obtida, mergulhe um aplicador de ponta de algodão estéril na suspensão bacteriana. Para inocular a placa MH-A, esfregue toda a superfície da placa suavemente com um movimento em zigue-zague. Em seguida, rotule os lados inferiores das placas com o nome da bactéria e a data.
Para começar, retire uma tira de teste G E de penicilina, segurando-a pela borda com uma pinça. Coloque delicadamente a tira no centro da placa MH-A recém-esfregada e recoloque a tampa. Neste exemplo, um segundo antibiótico, a gentamicina, também é testado. Assim, o processo de colocação da tira é repetido com a segunda placa e uma tira de teste E de gentamicina. Para determinar os resultados do teste E, colete a primeira placa que contém a tira de teste E da penicilina G. Agora, determine o ponto onde a zona de inibição se cruza com a tira de antibiótico. Leia o valor numérico correspondente na escala. Este valor representa o valor da CIM da penicilina G. Determine o valor da CIM da gentamicina da mesma maneira.
Para começar, inocule uma placa MH-A com bactérias da cepa Streptococcus grupo G. Rotule o fundo da placa com o nome da bactéria, antibióticos a serem usados e a data. Agora, coloque uma tira de teste E para o antibiótico de interesse no centro da placa. Em seguida, segure a segunda tira de teste em um ângulo de 90 graus em relação à primeira tira e localize sua marca MIC. Coloque suavemente a segunda tira E sobre a primeira no ponto onde os dois valores MIC se cruzam. Uma vez colocadas as tiras, não as mova. Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius por 18 a 20 horas.
Depois de inocular duas placas MH-A, com bactérias da cepa Streptococcus grupo G, coloque uma tira de teste E para um antibiótico na superfície de uma placa. Em seguida, coloque uma tira de teste E para o outro antibiótico na segunda placa, conforme demonstrado. Usando uma alça de inoculação de plástico, marque o valor de CIM de cada antibiótico na superfície de sua respectiva placa. Em seguida, cubra as placas e incube-as em temperatura ambiente por uma hora. Depois disso, use uma pinça para remover as tiras E. Em seguida, colete uma das placas e uma tira de teste E para o outro antibiótico. Segure a tira de teste E sobre a impressão deixada pela primeira tira e localize o ponto onde o valor MIC na faixa E se alinha com a linha marcada. Coloque suavemente a tira neste ponto de interseção. Repita esse processo para a segunda placa e incube ambas as placas a 37 graus Celsius por 18 a 20 horas.
Primeiro, obtenha uma suspensão bacteriana com uma concentração bacteriana estabelecida e dilua a cultura em caldo MHF para obter um OD600 de 0,003. Em seguida, pesar 16 miligramas de penicilina G e 128 miligramas de gentamicina. Transfira cada antibiótico seco pesado para tubos cônicos de 215 mililitros. Adicione 10 mililitros de água destilada a cada um dos tubos cônicos e misture bem por vórtice. Rotule os tubos com o nome e a concentração do antibiótico.
Realizando o ensaio em triplicata, adicione 400 microlitros da solução bacteriana de trabalho nos primeiros poços de três fileiras de uma placa de microtitulação de 96 poços. Em seguida, adicione 200 microlitros da solução bacteriana de trabalho em caldo MHF aos poços das três fileiras. Agora, para gerar uma diluição de antibióticos em série de duas vezes, primeiro adicione quatro microlitros de estoque de antibióticos ao primeiro poço, gerando uma diluição de 100 vezes. Sequencialmente, transfira 200 microlitros de solução antibiótica de bactérias para cada poço, começando do primeiro poço até o segundo até o último poço em cada linha, garanta a mistura adequada pipetando duas a três vezes após cada transferência. Descarte os 200 microlitros finais de solução antibiótica bacteriana.
Para determinar os resultados do teste de microdiluição em caldo para penicilina G, primeiro localize os poços que não exibem crescimento bacteriano visível, indicado por falta de turbidez. A partir desses poços, identifique o poço com a menor concentração de antibióticos. Isso representa o valor MIC da penicilina G para as bactérias testadas. O valor MIC da gentamicina pode ser determinado usando o mesmo ensaio e técnica.
Para determinar os resultados do teste não cruzado, colete a primeira placa, que contém uma tira de penicilina GE. Em seguida, determine o ponto onde a zona de inibição do crescimento se cruza com a tira de antibiótico. O valor correspondente na escala representa o valor da CIM para a penicilina G em combinação com a gentamicina. Neste exemplo, o valor MIC em combinação é 0,064 microgramas por mililitro.
Agora, colete a segunda placa, que contém a tira de gentamicina E, e determine o valor da CIM em combinação, conforme demonstrado anteriormente. Para avaliar o efeito da combinação, primeiro calcule a concentração inibitória fracionada ou FIC para a penicilina G dividindo a CIM em combinação pela CIM do antibiótico sozinho. Repita este processo para a gentamicina. Em seguida, calcule o índice FIC usando a equação mostrada aqui. Uma redução de duas vezes no valor da CIM em combinação produz um valor de índice FIC menor ou igual a 0,5 e demonstra sinergia entre a penicilina G e a gentamicina. Nesse caso, o valor FIC calculado é 1,18, que é maior que 0,5. Assim, os resultados não demonstram sinergia entre a penicilina G e a gentamicina contra a cepa Streptococcus do grupo G.
Para determinar os resultados do teste cruzado, primeiro determine o ponto onde as zonas de inibição do crescimento se cruzam com suas respectivas faixas E. Leia o valor numérico em cada tira de teste E que corresponde a este ponto de interseção. Esses valores representam o valor da CIM em combinação para penicilina G e gentamicina. Em seguida, para avaliar o efeito da combinação, calcule o índice FIC usando a equação mostrada aqui. Neste exemplo, o valor FIC calculado é 1,18, que é maior que 0,5. Isso significa que a penicilina G e a gentamicina não agem sinergicamente contra a cepa Streptococcus do grupo G.
Microbiology
137.9K Visualizações
Microbiology
335.5K Visualizações
Microbiology
140.8K Visualizações
Microbiology
180.5K Visualizações
Microbiology
206.2K Visualizações
Microbiology
331.0K Visualizações
Microbiology
386.1K Visualizações
Microbiology
197.1K Visualizações
Microbiology
91.8K Visualizações
Microbiology
42.7K Visualizações
Microbiology
33.0K Visualizações
