Ensaio de placa: um método para determinar o título viral como unidades formadoras de placa (PFU)

Os bacteriófagos, também chamados de fagos, são vírus que infectam especificamente bactérias e podemos confirmar sua presença e quantificá-los usando uma ferramenta chamada ensaio de placa. Os bacteriófagos infectam seus hospedeiros suscetíveis primeiro se ligando à parede celular bacteriana e injetando seu material genético. Em seguida, eles sequestram a maquinaria biossintética da célula para replicar seu DNA e produzir numerosas partículas de fagos de progênie, que eles liberam lisando e matando a célula hospedeira.

Essa atividade lítica é a base de uma técnica de enumeração de fagos amplamente utilizada, conhecida como ensaio de placa ou ensaio de camada de ágar duplo. Aqui, uma mistura de bacteriófagos é preparada primeiro em um caldo de nutrientes fundidos contendo ágar de baixa concentração. Todas as bactérias usadas na mistura devem estar vivas e se dividindo ativamente na fase logarítmica de seu crescimento, o que garantirá que uma grande porcentagem das bactérias seja viável e capaz de formar um gramado denso ao redor das placas. Em seguida, essa mistura de ágar bactéria-fago fundido é espalhada sobre um meio nutriente de ágar mais sólido e concentrado que já está solidificado em uma placa de Petri. Na incubação à temperatura ambiente, o caldo de ágar-fago-bactéria de baixa concentração também se solidifica para formar uma camada de ágar macia.

Aqui, as células bacterianas podem derivar nutrientes adicionais da camada inferior e devem se multiplicar rapidamente para produzir um gramado confluente de bactérias. No entanto, como as partículas de fagos também estão presentes na camada mole, elas infectam e replicam seu material genético dentro das bactérias, culminando na lise celular, que libera múltiplas progênies. Essa progênie de fagos infecta as células vizinhas, pois o estado semissólido da camada de fagos de bactérias restringe seu movimento a células hospedeiras localizadas mais distantes. Este ciclo de infecção e lise continua por várias rodadas, matando um grande número de bactérias em uma área localizada. O efeito da destruição das células vizinhas é produzir uma única zona circular clara, chamada placa, que pode ser vista a olho nu, amplificando efetivamente a atividade lítica bacteriana do fago e permitindo sua enumeração.

O número de placas em uma placa de Petri é chamado de Unidades Formadoras de Placas, ou PFUs, e, desde que a concentração inicial de bacteriófagos tenha sido suficientemente diluída, deve corresponder diretamente ao número de partículas de fagos infectantes na amostra original. Esta técnica também pode ser usada para caracterização da morfologia da placa, para auxiliar na identificação de tipos de fagos ou para isolar mutantes de fagos. Neste laboratório, você aprenderá como realizar o ensaio de placa para enumerar fagos, usando o fago T7 de E. coli como exemplo.

Primeiro, identifique um meio adequado para a cultura das células bacterianas hospedeiras e do bacteriófago. Aqui, o caldo de lisogenia, ou meio LB, foi usado para cultivar E. coli e o fago T7. Em seguida, pegue três garrafas de vidro limpas e rotule-as com mídia, nome e, em seguida, a primeira como LB-Broth, a segunda como LB-Bottom Agar e a terceira como LB-Top Agar. Agora, pese quatro gramas de pó LB pré-formulado em três conjuntos e, em seguida, transfira um conjunto de mídia seca pesada para cada frasco. Adicione 200 mililitros de água à primeira garrafa. Misture o conteúdo usando uma barra de agitação magnética.

Em seguida, usando um medidor de pH e agitação constante, traga o pH final para 7,4 através da adição de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico. Repita a adição de água e o ajuste do pH para as outras duas garrafas restantes também. Agora, pese três gramas de ágar em pó e adicione-o à segunda garrafa para fazer um ágar de fundo a 1,5%. Por fim, pesar 1. 2 gramas de ágar e adicione-o ao terceiro frasco para fazer o ágar superior de 6% LB. A condição do caldo na garrafa um não precisa de adição de ágar. Tampe o frasco com semi-força e, em seguida, esterilize a mídia em autoclave a 121 graus Celsius por 20 minutos. Depois de concluído, remova os frascos de mídia da autoclave e gire imediatamente as tampas dos frascos para fechá-los totalmente para evitar contaminação. Mantenha os meios LB-Broth e LB-Top Agar na bancada para uso posterior. Coloque o LB-Bottom Agar para esfriar em banho-maria predefinido para aproximadamente 45 graus Celsius.

Quando o ágar LB-Bottom atingir aproximadamente 45 graus Celsius, transfira-o para a bancada de trabalho. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho com 70% de etenol. Em seguida, adicione 450 microlitros de cloreto de cálcio estéril de um molar ao ágar de fundo fundido para fazer uma concentração final de 2,25 milimolar. Gire suavemente a garrafa para misturar. Em seguida, coloque sete placas de Petri limpas. Rotule cada prato no fundo com o nome da mídia e a data de preparação. Em seguida, despeje 15 mililitros do ágar inferior em cada uma das sete placas de Petri. Deixe as placas endurecerem por algumas horas ou durante a noite em temperatura ambiente. Uma vez definidas, as placas de cultura podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por vários dias, se necessário, de cabeça para baixo para minimizar a condensação. Transfira as placas de Petri da geladeira de quatro graus Celsius para uma incubadora de 37 graus Celsius uma hora antes do ensaio.

No dia anterior à realização do ensaio, a E. coli deve ser cultivada. Aqui, 10 microlitros de cultura de E. coli foram inoculados em 10 mililitros de LB-Broth. Coloque as bactérias para crescer durante a noite em uma incubadora agitada ajustada para 37 graus Celsius a 160 RPM. Em seguida, no dia do ensaio, remova a cultura bacteriana da incubadora. Semeie 10 mililitros frescos de caldo LB fresco com 0,5 mililitros da cultura noturna. Coloque essas células para crescer em uma incubadora agitada ajustada para 37 graus Celsius a 160 RPM. Em seguida, use um espectrofotômetro para verificar quando essa cultura atinge o crescimento da fase logarítmica, indicado por uma densidade óptica de 0,5 a 0,7. Quando o OD atingir esse nível, interrompa a incubação transferindo a cultura de células para a bancada. Eles agora estão prontos para serem usados para ensaio de sobreposição de fagos.

Os títulos de fagos podem variar exponencialmente entre diferentes tipos e amostras de fagos. Portanto, para contá-los de forma eficaz, eles devem ser diluídos para gerar uma ampla gama de concentrações de fagos. No dia do ensaio, gerar uma série de diluições de fagos que variam de um décimo a um milionésimo das concentrações, seguindo uma técnica de diluição de 10 vezes. Para obter dados estatisticamente significativos e precisos, realizar a diluição seriada em triplicata.

Em seguida, derreta o ágar LB-top solidificado usando um micro-ondas. Em seguida, coloque-o em banho-maria predefinido em 45 graus Celsius por uma hora. Após uma hora, recolher da incubadora as placas de Petri que contêm a camada inferior de ágar. Rotule as placas com a concentração de fagos e a data do ensaio. Em seguida, coloque sete tubos de ensaio limpos. Rotular cada tubo de ensaio com o número de diluição do fago em série e designar um como controlo.

Quando o ágar LB-top atingir 45 graus Celsius, transfira-o para a bancada de trabalho. Agora, adicione 450 microlitros de cloreto de cálcio molar ao ágar 200 mililitros para fazer uma concentração final de 2,25 milimolar. Gire suavemente a garrafa para misturar. Em seguida, adicione 35 mililitros de ágar LB-top e quatro mililitros de suspensão bacteriana a um tubo cônico estéril. Agite suavemente para distribuir uniformemente as células, mas evite agitar para evitar a formação de espuma.

Agora, aliquota cinco mililitros desta mistura de ágar topo de bactéria para cada um dos sete tubos de ensaio. Em seguida, transfira 100 microlitros das amostras de bacteriófagos diluídas em série e meios de controle, que devem ser simplesmente meios sem bacteriófago, para os tubos de ensaio respeitosamente rotulados. Agite a mistura suavemente para garantir uma mistura adequada. Transfira suavemente cinco mililitros de mistura de bacteriófagos para a respectiva placa de Petri. Espalhe uniformemente a mistura por toda a superfície, girando suavemente a placa de Petri.

Uma vez que todas as placas de Petri estejam em camadas com a mistura, permita a solidificação da camada superior incubando em temperatura ambiente por 15 minutos. Após a conclusão dessas etapas, repita o processo para o segundo e depois o terceiro conjuntos de placas de Petri usando os dois conjuntos restantes de diluições de fagos. Sele cada prato com parafilme e incube em temperatura ambiente por 15 minutos. Coloque a placa de cultura de cabeça para baixo a uma temperatura adequada por 24 horas ou até que as placas se desenvolvam. Aqui, as placas foram colocadas em uma incubadora de 37 graus Celsius por um dia, uma condição de crescimento estimulante para E. coli e o fago T7.

As placas aparecerão após um a cinco dias de incubação, dependendo da espécie bacteriana, das condições de incubação e da escolha do meio. Aqui, as placas eram visíveis após um dia de incubação a 37 graus Celsius. Comece verificando as placas marcadas como controle e certifique-se de que nenhuma placa foi formada nessas placas, pois isso indicaria contaminação viral. Para determinar o título de fago na amostra original, comece com as placas contendo a amostra de fago mais diluída primeiro e conte as placas sem remover as tampas, marcando-as para indicar quais já foram contadas. Repita a contagem para cada placa em cada conjunto. Algumas placas podem ter muitas ou poucas placas para serem contadas. Considere 10 a 150 como uma contagem ideal de placas.

Em seguida, gere uma tabela listando os valores do número de placas para as diferentes diluições e réplicas. Em seguida, calcule os valores médios do número de placas para as placas de diluição que continham o número ideal de contagens de placas. Neste exemplo, este foi o número médio de placas formadas nas placas de diluição de 10 para menos três e 10 para menos quatro placas de diluição. Agora, ajuste o fator de diluição do fago dividindo os valores médios de placa obtidos pelos respectivos fatores de diluição do fago. Aqui, o número médio de placas formadas para 10 para menos três e 10 para menos quatro placas de diluição, foram divididas por seus respectivos fatores de diluição para obter o número de unidades formadoras de placas, ou PFUs, em 100 microlitros de mistura de fagos. Para converter o valor em PFU por mililitro, multiplique os valores gerados por 10, pois apenas 100 microlitros de mistura de diluição de fagos foram usados durante a etapa de preparação da sobreposição de bacteriófagos, produzindo um fator de diluição adicional de 10. Por fim, calcular a média dos valores obtidos a partir das diferentes placas de diluição. Isso dará o número médio de PFUs por mililitro. O número de PFUs corresponde ao número de partículas de fagos infecciosos na amostra original.