Ensaio de placa: um método para determinar o título viral como unidades formadoras de placa (PFU)

1. Configuração

1. Antes de iniciar qualquer trabalho envolvendo micróbios, certifique-se de que o espaço de trabalho seja esterilizado (por exemplo, limpo com 70% de etanol). Use sempre um jaleco e luvas, mantenha os cabelos longos amarrados para trás e certifique-se de que todas as feridas estejam particularmente bem protegidas.
2. Quando terminar, esterilize todas as superfícies e lave/esterilize completamente as mãos e pulsos.

2. Protocolo

1. Preparação de mídia LB
   Nota: Dependendo da cepa bacteriana hospedeira e do bacteriófago, um meio líquido diferente pode ser mais adequado para a cultura inicial da cepa bacteriana hospedeira ou um meio sólido diferente pode ser mais adequado para o crescimento subsequente. O caldo de lysogeny (LB) é usado neste protocolo para o caldo e o ágar.
   1. Misture 4 g LB em 200 mL de água destilada, em triplicado, para o caldo LB, o ágar de fundo sólido e o ágar superior macio. Todas as soluções devem ser preparadas em recipientes capazes de conter o dobro do volume final para evitar o estouro enquanto se autoclavar.
      Nota: Se realizar o ensaio em triplicado, prepare o dobro da quantidade de ágar inferior LB.
   2. Ajuste o pH das três soluções para 7.4 usando NaOH ou HCl conforme apropriado.
   3. Adicione 3 g de potência de ágar à garrafa de ágar inferior para fazer uma solução de 1,5% de ágar para o ágar sólido
   4. Adicione 1,2 g de potência de ágar à garrafa de ágar superior para fazer uma solução de 0,6% de ágar para ágar macio.
   5. Coloque as garrafas, com tampas semi-apertadas, em uma autoclave fixada em 121°C por 20 minutos para esterilizar as soluções. Feche as tampas assim que a corrida estiver concluída para evitar contaminação.
   6. Quando a mídia LB atingir uma temperatura de aproximadamente 45-50°C, adicione 450 μL de cacl₂ estéril a todas as três soluções lb de 200 mL para fazer uma concentração final de 2,25 mM.
   7. Despeje 15 mL de alíquotas do meio de ágar sólido em placas de Petri estéreis (evite tremer para evitar espuma) e deixe que o ágar solidifique por algumas horas ou durante a noite à temperatura ambiente(Figura 4A). As placas podem ser armazenadas de cabeça para baixo a 4°C por vários dias.
2. Cultivo de células hospedeiras
   1. Um dia antes do ensaio, adicione 10 μL de cultura E. coli a 10 mL de caldo LB.
   2. Incubar a bactéria a 37°C durante a noite a 160 rpm em uma incubadora de agitação.
   3. Na manhã do ensaio, adicione 0,5 mL da cultura da noite para o dia a 10 mL de LB fresco.
      Nota: Se você está realizando o ensaio em triplicado, prepare o dobro da quantidade desta cultura.
   4. Incubar os a 37°C a 160 rpm em uma incubadora de agitação até que a cultura bacteriana esteja em crescimento em fase de registro. Isso pode ser determinado espectrofotometricamente por um OD600 de 0,5-0,7.
   5. Mantenha a cultura em temperatura ambiente até que as bactérias sejam adicionadas ao ágar LB superior.
3. Diluição serial de 10 vezes do bacteriófago
   1. Adicione 180μL de caldo LB a sete poços na primeira linha de uma placa de 96 poços
      Nota: Sugere-se realizar a diluição em triplicado, a fim de aumentar sua confiabilidade estatística. Para isso, prepare diluições adicionais do bacteriófago na segunda e terceira fileiras da placa.
   2. Cuidadosamente vórtice a amostra original de bacteriófago para garantir a homogeneidade e transferir 20 μL para o primeiro poço.
   3. Misture bem a amostra por pipetação e para baixo.
   4. Transferir 20 μL da suspensão resultante para o segundo poço.
   5. Continue a diluição serial transferindo 20 μL da solução no segundo poço para o terceiro poço, e assim por diante, até o sexto bem, deixando o sétimo bem como um controle negativo ao qual nenhuma suspensão phage será adicionada. Isso criará uma faixa de diluição de 10^-1-10^-6.
4. Chapeamento
   1. Rotule a base das placas de Petri (previamente preparadas na etapa 2.1.7) com nome, data e uma breve descrição da amostra (incluindo o fator de diluição da amostra de phage). Pré-aqueça as placas de Petri na incubadora de 37°C uma hora antes do ensaio.
   2. Derreta o ágar-médio macio solidificado (normalmente feito usando um micro-ondas; o ágar solidificado derrete a 85°C), e deixe-o chegar a cerca de 45°C. A mídia aquecida pode ser colocada em um banho de água de 45°C por ~1h para atingir uma temperatura apropriada. Deve ser quente o suficiente para permanecer em forma líquida, mas frio o suficiente para não matar bactérias adicionadas.
   3. Misture cultura bacteriana de 4 mL (a partir do passo 2.2) com ágar macio de 35 mL LB (a 45°C). Redemoinho para distribuir uniformemente as células, mas evite tremer para evitar espuma(Figura 4A).
   4. Rotule um tubo de ensaio estéril para cada uma das etapas de diluição serial e outro para a amostra de controle, para um total de 7 tubos de ensaio rotulados. Coloque 5 mL aliquots da cultura bacteriana/mistura de ágar macio da etapa 2.4.3 para os 7 tubos. Trabalhe rapidamente através da etapa 2.4.6 porque esses pequenos volumes de mídia à base de ágar se solidificarão rapidamente à temperatura ambiente.
   5. Adicione 100 μL da amostra de controle (da etapa 2.3) ao tubo de ensaio de controle e gire cuidadosamente. Descarte a ponta de pipeta usada e transfira o mesmo volume de cada uma das amostras de bacteriófago diluídas em série (etapa 2.3) para seus respectivos tubos de ensaio, girando para misturar.
   6. Transfira imediatamente as misturas de 5 mL para as placas de ágar rotuladas, pré-aquecidas e sólidas(Figura 4A). Gire suavemente as placas para até mesmo espalhar as misturas.
      Nota: Se você estiver executando o ensaio em triplicado, repita as etapas 2.4.3-6 mais duas vezes.
   7. Sele cada placa com filme de laboratório, e permita que ambas as camadas se solidifiquem adequadamente à temperatura ambiente (aproximadamente 15 minutos) antes de colocá-las de lado para baixo em uma incubadora de 37°C, estimulando o crescimento tanto da bactéria quanto da praga, por 24 horas ou até que as placas se desenvolvam, normalmente leva cerca de 1-5 dias para que as placas apareçam(Figura 4B), mas o tempo varia consideravelmente dependendo das condições de incubação, média e as espécies bacterianas.

3. Análise e Resultados de Dados

1. Contando placas
   1. Certifique-se de que nenhuma placa esteja visível nas placas marcadas como "controle", pois isso indicaria contaminação viral.
   2. Comece com as placas rotuladas 10^-6,contendo a amostra de bacteriófago mais diluída. Conte as placas sem remover a tampa, marcando-as com uma caneta enquanto você vai para indicar quais placas já foram contadas.
   3. Conte as placas restantes. Algumas placas podem ter poucas ou muitas placas para contar. Use as placas com placas de 10 a 150 para análise posterior.
2. Cálculo pfu
   1. Divida o número de placas pelo fator de diluição (ex. 10^-6 para a amostra mais diluída) paraobentar o número de Unidades de Formação de Placa (PFU) em 100 μL de mistura de phage.
      Nota: Se realizar o ensaio em triplicado, use o número médio de placas das três placas.
   2. Para determinar a concentração (em PFU/mL) da amostra original, multiplique por um fator adicional de diluição de 10, uma vez que apenas 100 μL de amostra foram emplacados. (ie)
   3. Calcule o valor médio do PFU/mL para todas as diluições que tinham entre 10 e 150 placas para obter um resultado mais confiável.