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Advanced Biology

Ensaio de placa: um método para determinar o título viral como unidades formadoras de placa (PFU)

Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

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Microbiology

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Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

6.8: Microscopy and Staining: Gram, Capsule, and Endospore Staining

6.10: Transformation of E. coli Cells Using an Adapted Calcium Chloride Procedure

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13:00 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Tilde Andersson¹, Rolf Lood¹
¹ Departamento de Ciências Clínicas Lund, Divisão de Medicina de Infecção, Centro Biomédico, Universidade de Lund, 221 00 Lund, Suécia

Vírus que infectam organismos procarióticos, chamados bacteriófagos ou simplesmente fálticos, foram identificados no início do século^XX por Twort (1) e d’Hérelle (2) de forma independente. Desde então, os phages têm sido amplamente reconhecidos por seu valor terapêutico (3) e sua influência sobre os humanos (4), bem como os ecossistemas globais (5). As preocupações atuais têm alimentado um interesse renovado no uso de phages como alternativa aos antibióticos modernos no tratamento de doenças infecciosas (6). Essencialmente, todas as pesquisas de phage dependem da capacidade de purificar e quantificar vírus, também conhecido como um titer viral. Inicialmente descrito em 1952, este era o propósito do ensaio da placa (7). Décadas e múltiplos avanços tecnológicos depois, o ensaio da placa continua sendo um dos métodos mais confiáveis para a determinação do título viral (8).

Bacteriophages subsistem injetando seu material genético em células hospedeiras, sequestrando as máquinas para produção de novas partículas de phage, e eventualmente fazendo com que o hospedeiro libere numerosos virions progêneres através da lise celular. Devido ao seu tamanho minucioso, os bacteriófagos não podem ser observados usando apenas microscopia leve; portanto, é necessária a microscopia eletrônica de varredura (Figura 1). Além disso, os phages não podem ser cultivados em placas de ágar nutricional como bactérias, pois precisam de células hospedeiras para se aproveitarem.

Figura 1: A morfologia de um bacteriófago, aqui exemplificado por um phage E. coli, pode ser estudado usando microscopia eletrônica de varredura. A maioria dos bacteriófagos pertence a Caudovirales (bacteriófagos tailed). Este phage em particular tem uma estrutura de cauda muito curta e uma cabeça icosaedral, colocando-a na família de Podovírus.

O ensaio da placa (Figura 2) baseia-se na incorporação de células hospedeiras, preferencialmente em crescimento de fase de registro, no meio. Isso cria uma densa camada turva de bactérias capazes de sustentar o crescimento viral. Uma praga isolada pode infectar, replicar dentro e lise uma célula. A cada célula lise, várias células adjacentes ficam imediatamente infectadas. Vários ciclos dentro, uma zona clara (uma placa) pode ser observada na placa turva (Figura 2B/Figura 3A), indicando a presença do que inicialmente era uma única partícula bacteriófago. O número de unidades formadoras de placas por volume (ou seja, PFU/mL) de uma amostra, pode ser determinado a partir do número de placas geradas.

Figura 2: O teste para unidades de formação de placas (PFU) é um método comum para determinar o número de bacteriófagos em uma amostra. (A) A base de uma placa de Petri estéril é coberta com um meio de nutrientes sólidos apropriado, seguido por uma mistura de mídia macia, células hospedeiras suscetíveis e uma diluição da amostra original de bacteriófago. Note que a suspensão de phage poderia, em alguns casos, também ser uniformemente espalhada pela superfície de ágar macio já solidificado. (B) O crescimento das bactérias hospedeiras forma um gramado de células na camada superior do ágar. A replicação do bacteriófago gera zonas claras, ou placas, causadas pela lise celular hospedeira.

Figura 3: Os resultados do teste de PFU mostram múltiplas placas geradas por bacteriófagos. Devido à lise de células hospedeiras suscetíveis, as placas podem ser vistas como zonas de compensação no gramado bacteriano, seja com (A) desobstrução total, ou (B) re-crescimento parcial causado pela geração de bactérias resistentes (ou possivelmente por phages temperados no ciclo lisogênico).

Certos fáticos temperados podem adotar o que é chamado de ciclo de vida lisogênico, além do crescimento lítico descrito anteriormente. Na lysogenia, o vírus assume um estado latente através da incorporação de seu material genético no genoma da célula hospedeira (9), muitas vezes conferindo resistência a novas infecções por pragas. Isso às vezes é revelado através de uma leve nebulosidade da placa (Figura 3B). Vale ressaltar, porém, que as placas também podem aparecer borradas devido ao reesúde de bactérias que evoluíram resistência ao phage independente de infecções anteriores.

Os vírus podem se conectar, ou adsorb, a apenas uma gama limitada de bactérias hospedeiras (10). As faixas de host são ainda limitadas por estratégias antivirais intracelulares, como o sistema CRISPR-Cas (11). A resistência/sensibilidade para phages específicos exibidos por subgrupos bacterianos tem sido historicamente usada para categorizar cepas bacterianas em diferentes tipos de phage (Figura 4). Embora a eficácia deste método tenha sido agora superada por novas técnicas de sequenciamento, a digitação de phage ainda pode fornecer informações valiosas sobre interações bactérias-phage, por exemplo, facilitando o design de um coquetel phage para uso clínico.

Figura 4: Sensibilidade à praga de diferentes cepas bacterianas. Placas de ágar macio com cepa cutibacterium acnes (A) AD27 e (B) AD35, foram avistadas com 21 bacteriófagos C. acnes diferentes. Apenas o phage 11 foi capaz de infectar e matar AD27, enquanto a cepa AD35 mostrou sensibilidade para todas as pragas. Esta técnica, denominada digitação phage, pode ser usada para dividir espécies bacterianas e cepas em diferentes subgrupos com base na suscetibilidade de phage.

Procedure

1. Configuração

Antes de iniciar qualquer trabalho envolvendo micróbios, certifique-se de que o espaço de trabalho seja esterilizado (por exemplo, limpo com 70% de etanol). Use sempre um jaleco e luvas, mantenha os cabelos longos amarrados para trás e certifique-se de que todas as feridas estejam particularmente bem protegidas.
Quando terminar, esterilize todas as superfícies e lave/esterilize completamente as mãos e pulsos.

2. Protocolo

Preparação de mídia LB
Nota: Dependendo da cepa bacteriana hospedeira e do bacteriófago, um meio líquido diferente pode ser mais adequado para a cultura inicial da cepa bacteriana hospedeira ou um meio sólido diferente pode ser mais adequado para o crescimento subsequente. O caldo de lysogeny (LB) é usado neste protocolo para o caldo e o ágar.
1. Misture 4 g LB em 200 mL de água destilada, em triplicado, para o caldo LB, o ágar de fundo sólido e o ágar superior macio. Todas as soluções devem ser preparadas em recipientes capazes de conter o dobro do volume final para evitar o estouro enquanto se autoclavar.
  Nota: Se realizar o ensaio em triplicado, prepare o dobro da quantidade de ágar inferior LB.
2. Ajuste o pH das três soluções para 7.4 usando NaOH ou HCl conforme apropriado.
3. Adicione 3 g de potência de ágar à garrafa de ágar inferior para fazer uma solução de 1,5% de ágar para o ágar sólido
4. Adicione 1,2 g de potência de ágar à garrafa de ágar superior para fazer uma solução de 0,6% de ágar para ágar macio.
5. Coloque as garrafas, com tampas semi-apertadas, em uma autoclave fixada em 121°C por 20 minutos para esterilizar as soluções. Feche as tampas assim que a corrida estiver concluída para evitar contaminação.
6. Quando a mídia LB atingir uma temperatura de aproximadamente 45-50°C, adicione 450 μL de cacl₂ estéril a todas as três soluções lb de 200 mL para fazer uma concentração final de 2,25 mM.
7. Despeje 15 mL de alíquotas do meio de ágar sólido em placas de Petri estéreis (evite tremer para evitar espuma) e deixe que o ágar solidifique por algumas horas ou durante a noite à temperatura ambiente(Figura 4A). As placas podem ser armazenadas de cabeça para baixo a 4°C por vários dias.
Cultivo de células hospedeiras
1. Um dia antes do ensaio, adicione 10 μL de cultura E. coli a 10 mL de caldo LB.
2. Incubar a bactéria a 37°C durante a noite a 160 rpm em uma incubadora de agitação.
3. Na manhã do ensaio, adicione 0,5 mL da cultura da noite para o dia a 10 mL de LB fresco.
  Nota: Se você está realizando o ensaio em triplicado, prepare o dobro da quantidade desta cultura.
4. Incubar os a 37°C a 160 rpm em uma incubadora de agitação até que a cultura bacteriana esteja em crescimento em fase de registro. Isso pode ser determinado espectrofotometricamente por um OD600 de 0,5-0,7.
5. Mantenha a cultura em temperatura ambiente até que as bactérias sejam adicionadas ao ágar LB superior.
Diluição serial de 10 vezes do bacteriófago
1. Adicione 180μL de caldo LB a sete poços na primeira linha de uma placa de 96 poços
  Nota: Sugere-se realizar a diluição em triplicado, a fim de aumentar sua confiabilidade estatística. Para isso, prepare diluições adicionais do bacteriófago na segunda e terceira fileiras da placa.
2. Cuidadosamente vórtice a amostra original de bacteriófago para garantir a homogeneidade e transferir 20 μL para o primeiro poço.
3. Misture bem a amostra por pipetação e para baixo.
4. Transferir 20 μL da suspensão resultante para o segundo poço.
5. Continue a diluição serial transferindo 20 μL da solução no segundo poço para o terceiro poço, e assim por diante, até o sexto bem, deixando o sétimo bem como um controle negativo ao qual nenhuma suspensão phage será adicionada. Isso criará uma faixa de diluição de 10^-1-10^-6.
Chapeamento
1. Rotule a base das placas de Petri (previamente preparadas na etapa 2.1.7) com nome, data e uma breve descrição da amostra (incluindo o fator de diluição da amostra de phage). Pré-aqueça as placas de Petri na incubadora de 37°C uma hora antes do ensaio.
2. Derreta o ágar-médio macio solidificado (normalmente feito usando um micro-ondas; o ágar solidificado derrete a 85°C), e deixe-o chegar a cerca de 45°C. A mídia aquecida pode ser colocada em um banho de água de 45°C por ~1h para atingir uma temperatura apropriada. Deve ser quente o suficiente para permanecer em forma líquida, mas frio o suficiente para não matar bactérias adicionadas.
3. Misture cultura bacteriana de 4 mL (a partir do passo 2.2) com ágar macio de 35 mL LB (a 45°C). Redemoinho para distribuir uniformemente as células, mas evite tremer para evitar espuma(Figura 4A).
4. Rotule um tubo de ensaio estéril para cada uma das etapas de diluição serial e outro para a amostra de controle, para um total de 7 tubos de ensaio rotulados. Coloque 5 mL aliquots da cultura bacteriana/mistura de ágar macio da etapa 2.4.3 para os 7 tubos. Trabalhe rapidamente através da etapa 2.4.6 porque esses pequenos volumes de mídia à base de ágar se solidificarão rapidamente à temperatura ambiente.
5. Adicione 100 μL da amostra de controle (da etapa 2.3) ao tubo de ensaio de controle e gire cuidadosamente. Descarte a ponta de pipeta usada e transfira o mesmo volume de cada uma das amostras de bacteriófago diluídas em série (etapa 2.3) para seus respectivos tubos de ensaio, girando para misturar.
6. Transfira imediatamente as misturas de 5 mL para as placas de ágar rotuladas, pré-aquecidas e sólidas(Figura 4A). Gire suavemente as placas para até mesmo espalhar as misturas.
  Nota: Se você estiver executando o ensaio em triplicado, repita as etapas 2.4.3-6 mais duas vezes.
7. Sele cada placa com filme de laboratório, e permita que ambas as camadas se solidifiquem adequadamente à temperatura ambiente (aproximadamente 15 minutos) antes de colocá-las de lado para baixo em uma incubadora de 37°C, estimulando o crescimento tanto da bactéria quanto da praga, por 24 horas ou até que as placas se desenvolvam, normalmente leva cerca de 1-5 dias para que as placas apareçam(Figura 4B), mas o tempo varia consideravelmente dependendo das condições de incubação, média e as espécies bacterianas.

3. Análise e Resultados de Dados

Contando placas
1. Certifique-se de que nenhuma placa esteja visível nas placas marcadas como “controle”, pois isso indicaria contaminação viral.
2. Comece com as placas rotuladas 10^-6,contendo a amostra de bacteriófago mais diluída. Conte as placas sem remover a tampa, marcando-as com uma caneta enquanto você vai para indicar quais placas já foram contadas.
3. Conte as placas restantes. Algumas placas podem ter poucas ou muitas placas para contar. Use as placas com placas de 10 a 150 para análise posterior.
Cálculo pfu
1. Divida o número de placas pelo fator de diluição (ex. 10^-6 para a amostra mais diluída) paraobentar o número de Unidades de Formação de Placa (PFU) em 100 μL de mistura de phage.
  Nota: Se realizar o ensaio em triplicado, use o número médio de placas das três placas.
2. Para determinar a concentração (em PFU/mL) da amostra original, multiplique por um fator adicional de diluição de 10, uma vez que apenas 100 μL de amostra foram emplacados. (ie)
3. Calcule o valor médio do PFU/mL para todas as diluições que tinham entre 10 e 150 placas para obter um resultado mais confiável.

Bacteriófagos, também chamados de phages, são vírus que infectam especificamente bactérias e podemos confirmar sua presença e quantificá-las usando uma ferramenta chamada ensaio de placa. Bacteriófagos infectam seus hospedeiros suscetíveis, primeiro anexando-se à parede celular bacteriana e injetando seu material genético. Então, eles sequestram as máquinas biossintéticas da célula para replicar seu DNA e produzir numerosas partículas de phage progênero, que eles então liberam lise e matando a célula hospedeira.

Esta atividade lítica é a base de uma técnica de enumeração de phage amplamente utilizada conhecida como ensaio de placa ou ensaio de camada de ágar duplo. Aqui, uma mistura de bacteriófago é preparada pela primeira vez em um caldo de nutriente derretido contendo ágar de baixa concentração. Todas as bactérias utilizadas na mistura devem estar vivas e ativamente se dividindo na fase de tronco de seu crescimento, o que garantirá que uma grande porcentagem das bactérias sejam viáveis e capazes de formar um gramado denso ao redor das placas. Em seguida, esta mistura de ágar bacteriana-phage derretida é espalhada sobre um meio de nutrientes ágar mais sólido e concentrado que já está solidificado em uma placa de Petri. Na incubação à temperatura ambiente, o caldo de baixa concentração de ágar-phage-bactérias também se solidifica para formar uma sobreposição de ágar macia.

Aqui, as células bacterianas podem derivar nutrientes adicionais da camada inferior e devem se multiplicar rapidamente para produzir um gramado confluente de bactérias. No entanto, como as partículas de phage também estão presentes na camada macia, elas infectarão e replicarão seu material genético dentro das bactérias, culminando na lise celular, que libera múltiplas progêneres. Essas descendentes de fábulas então infectam as células vizinhas, já que o estado semissólido da camada de bactérias-phage restringe seu movimento a células hospedeiras mais distantes. Esse ciclo de infecção e lise continua ao longo de várias rodadas, matando um grande número de bactérias em uma área localizada. O efeito das células vizinhas serem destruídas, é produzir uma única zona circular clara, chamada de placa, que pode ser vista a olho nu, amplificando efetivamente a atividade bacteriana da praga e permitindo sua enumeração.

O número de placas em uma placa de Petri são referidos como Unidades formadoras de placas, ou PFUs, e, desde que a concentração inicial de bacteriófago fosse suficientemente diluída, deve corresponder diretamente ao número de partículas de phage infecciosas na amostra original. Esta técnica também pode ser usada para caracterização da morfologia da placa, para auxiliar na identificação de tipos de phage, ou para isolar mutantes de phage. Neste laboratório, você aprenderá como realizar o ensaio de placa para enumerar phages, usando o phage T7 de E. coli como exemplo.

Primeiro, identifique um meio adequado para acultura das células bacterianas hospedeiras e do bacteriófago. Aqui o caldo de lysogeny, ou meio LB, foi usado para cultivar E. coli e o phage T7. Em seguida, pegue três garrafas de vidro limpas e rotule-as com mídia, nome, e depois a primeira como LB-Broth, a segunda como LB-Bottom Agar, e a terceira como LB-Top Agar. Agora, pese quatro gramas de pó LB pré-formulado em três conjuntos e, em seguida, transfira um conjunto de mídia seca pesada em cada garrafa. Adicione 200 mililitros de água à primeira garrafa. Misture o conteúdo usando uma barra de agitação magnética.

Em seguida, utilizando um medidor de pH e agitação constante, leve o pH final para 7,4 através da adição de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico. Repita a adição de água e o ajuste de pH para as outras duas garrafas restantes, também. Agora, pese três gramas de ágar em pó e adicione-o à segunda garrafa para fazer um ágar inferior de 1,5%. Finalmente, pesar 1. 2 gramas de ágar e adicione-o à terceira garrafa para fazer o ágar superior de 0,6 % LB. A condição do caldo na garrafa não precisa de adição de ágar. Tampe a garrafa semi-firmemente e, em seguida, esterilize a mídia autoclaving a 121 graus Celsius por 20 minutos. Uma vez concluída, remova as garrafas de mídia da autoclave e torça imediatamente as tampas das garrafas para fechá-las completamente para evitar contaminação. Mantenha a mídia LB-Broth e LB-Top Agar no banco para uso posterior. Coloque o Ágar LB-Bottom para esfriar em um banho de água que é predefinido a aproximadamente 45 graus Celsius.

Quando o ágar LB-Bottom atingir aproximadamente 45 graus Celsius, transfira-o para o banco de trabalho. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho usando 70 % de ethenol. Em seguida, adicione 450 microliters de cloreto de cálcio molar estéril ao ágar de fundo derretido para fazer uma concentração final de 2,25 milimililar. Gire suavemente a garrafa para misturar. Então, coloque sete pratos de Petri limpos. Rotule cada prato na parte inferior com o nome da mídia e data de preparação. Em seguida, despeje 15 mililitros do ágar inferior em cada uma das sete placas de Petri. Deixe as placas fixar por algumas horas ou durante a noite em temperatura ambiente. Uma vez definidas, as placas de cultura podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por vários dias, se necessário, de cabeça para baixo para minimizar a condensação. Transfira as placas de Petri da geladeira de quatro graus Celsius para uma incubadora de 37 graus Celsius uma hora antes do ensaio.

Um dia antes do ensaio ser pré-formado, o E. coli deve ser cultivado. Aqui, 10 microliters da cultura E. coli foram inoculados em 10 mililitros de CALdo LB. Coloque as bactérias para crescer durante a noite em uma incubadora de agitação fixada a 37 graus Celsius a 160 RPM. Então, no dia do ensaio, remova a cultura bacteriana da incubadora. Semente um fresco 10 mililitros de caldo LB fresco com 0,5 mililitros da cultura da noite para o dia. Coloque essas células para crescer em uma incubadora de agitação a 37 graus Celsius a 160 RPM. Em seguida, use um espectrômetro para verificar quando essa cultura atinge o crescimento da fase de registro, indicada por uma densidade óptica de 0,5 a 0,7. Uma vez que o OD atinja esse nível, pare a incubação transferindo a cultura celular para o banco. Eles estão agora prontos para serem usados para ensaio de sobreposição de phage.

Os titulantes de phage podem variar exponencialmente entre diferentes tipos de phage e amostras. Assim, a fim de contá-los efetivamente, eles devem ser diluídos para gerar uma ampla gama de concentrações de phage. No dia do ensaio, gerar uma série de diluições de phage variando de um décimo a um milionésimo de concentrações, seguindo uma técnica de diluição de 10 vezes. Para obter dados estatisticamente significativos e precisos, realize a diluição serial em triplicado.

Em seguida, derreta o ágar lb-top solidificado usando um micro-ondas. Em seguida, coloque-o em um banho de água que é predefinido a 45 graus Celsius por uma hora. Após uma hora, colete as placas de Petri contendo a camada de ágar inferior da incubadora. Rotule as placas com concentração de phage e data do ensaio. Então, coloque sete tubos de ensaio limpos. Rotule cada tubo de ensaio com o número de diluição de phage serial e designe um como controle.

Quando o ágar lb-top atingir 45 graus Celsius, transfira-o para o banco de trabalho. Agora, adicione 450 microliters de um cloreto de cálcio molar ao ágar de 200 mililitros para fazer uma concentração final de 2,25 mililitros. Gire suavemente a garrafa para misturar. Em seguida, adicione 35 mililitros de ágar lb-top e quatro mililitros de suspensão bacteriana a um tubo cônico estéril. Gire suavemente para distribuir uniformemente as células, mas evite tremer para evitar espuma.

Agora, alíquota de cinco mililitros desta mistura de ágar de topo para cada um dos sete tubos de ensaio. Em seguida, transfira 100 microliters das amostras de bacteriófago diluídas em série e mídia de controle, que deve ser simplesmente mídia sem bacteriófago, para os tubos de ensaio respeitosamente rotulados. Gire a mistura suavemente para garantir a mistura adequada. Transfira suavemente cinco mililitros de mistura de bacteriófago para a respectiva placa de Petri. Espalhe uniformemente toda a superfície girando suavemente a placa de Petri.

Uma vez que todas as placas de Petri estejam em camadas com a mistura, permita a solidificação da camada superior incubando à temperatura ambiente por 15 minutos. Após a conclusão dessas etapas, repita o processo para a segunda e, em seguida, os terceiros conjuntos das placas de Petri usando os dois conjuntos restantes de diluições de phage. Sele cada prato com parafilm e incubar em temperatura ambiente por 15 minutos. Coloque a placa de cultura de cabeça para baixo a uma temperatura adequada por 24 horas ou até que as placas se desenvolvam. Aqui, as placas foram colocadas em uma incubadora de 37 graus Celsius por um dia, uma condição de crescimento estimulante para E. coli e o phage T7.

As placas aparecerão após um a cinco dias de incubação, dependendo das espécies bacterianas, condições de incubação e escolha do meio. Aqui, as placas eram visíveis após um dia de incubação a 37 graus Celsius. Comece verificando o controle das placas marcadas e garantindo que não foram formadas placas nessas placas, pois isso indicaria contaminação viral. Para determinar o titulador de phage na amostra original, comece com as placas contendo a amostra de phage mais diluída primeiro e conte as placas sem remover as tampas, marcando-as para indicar quais já foram contadas. Repita a contagem de cada placa em cada conjunto. Algumas placas podem ter muitas ou poucas placas para serem contadas. Considere de 10 a 150 como uma contagem de placas ideal.

Em seguida, gere uma tabela listando os valores do número da placa para as diferentes diluições e réplicas. Em seguida, calcule os valores médios do número da placa para as placas de diluição que continham o número ideal de contagem de placas. Neste exemplo, estes foram o número médio de placas formadas nas 10 para as menos três e 10 para as menos quatro placas de diluição. Agora, ajuste para fator de diluição de phage dividindo os valores médios da placa obtidos pelos respectivos fatores de diluição de fásia. Aqui, o número médio de placas formadas para os 10 a menos três e 10 para as menos quatro placas de diluição, foram divididos por seus respectivos fatores de diluição para obter o número de unidades formadoras de placas, ou PFUs, em 100 microliters de mistura de phage. Para converter o valor em PFU por mililitro, multiplique os valores gerados por 10, pois apenas 100 microliters de mistura de diluição de fágio foram utilizados durante a etapa de preparação de sobreposição de bacteriófago, produzindo um fator adicional de diluição de 10. Por fim, calcule a média dos valores obtidos das diferentes placas de diluição. Isso dará o número médio de PFUs por mililitro. O número de PFUs corresponde ao número de partículas de phage infecciosas na amostra original.

Applications and Summary

Apesar dos múltiplos avanços tecnológicos, os ensaios de placas continuam sendo o padrão-ouro para a determinação do título viral (como PFU) e essencial para o isolamento de populações de bacteriófagos puros. Células hospedeiras suscetíveis são cultivadas na camada superior de uma placa de ágar de duas camadas, formando uma cama homogênea que permite a replicação viral. O evento inicial em que um bacteriófago isolado no ciclo de vida lítico infecta uma célula, se replica dentro dela e, eventualmente, a lise, é muito pequena para ser observada. No entanto, os virions liberados infectarão células adjacentes, posteriormente dando origem a uma zona de desobstrução, ou placa, denotando a presença de um único PFU.

References

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Transcript

Bacteriophages, also called phages, are viruses that specifically infect bacteria and we can confirm their presence and quantify them using a tool called the plaque assay. Bacteriophages infect their susceptible hosts by first attaching to the bacterial cell wall and injecting their genetic material. Then, they hijack the cell’s biosynthetic machinery to replicate their DNA and produce numerous progeny phage particles, which they then release by lysing and killing the host cell.

This lytic activity is the basis of a widely used phage enumerating technique known as the plaque assay or double agar layer assay. Here, a bacteriophage mix is first prepared in a molten nutrient broth containing low concentration agar. All bacteria used in the mix should be alive and actively dividing in the log phase of their growth, which will ensure that a large percentage of the bacteria are viable and able to form a dense lawn around the plaques. Next, this molten bacterial-phage agar mix is spread over a more solid, concentrated agar nutrient medium which is already solidified on a Petri dish. On incubation at room temperature, the low concentration agar-phage-bacteria broth also solidifies to form a soft agar overlay.

Here, the bacterial cells can derive additional nutrients from the bottom layer and should rapidly multiply to produce a confluent lawn of bacteria. However, as phage particles are also present in the soft layer, these will infect and replicate their genetic material within the bacteria, culminating in cell lysis, which releases multiple progeny. These phage progeny then infect the neighboring cells, as the semi-solid state of the bacteria-phage layer restricts their movement to more distantly located host cells. This cycle of infection and lysis continues over multiple rounds, killing a large number of bacteria in a localized area. The effect of the neighboring cells being destroyed, is to produce a single circular clear zone, called a plaque, which can be seen by the naked eye, effectively amplifying the bacteria lytic activity of the phage and enabling their enumeration.

The number of plaques on a Petri dish are referred to as Plaque-Forming Units, or PFUs, and, providing the initial bacteriophage concentration was sufficiently dilute, should directly correspond to the number of infective phage particles in the original sample. This technique can also be used for characterization of plaque morphology, to aid in identification of phage types, or to isolate phage mutants. In this lab, you will learn how to perform the plaque assay for enumerating phages, using the T7 phage of E. coli as an example.

First, identify a suitable medium for the culturing of the host bacterial cells and the bacteriophage. Here lysogeny broth, or LB medium, was used to culture E. coli and the T7 phage. Next, take three clean glass bottles and label them with media, name, and then the first as LB-Broth, the second as LB-Bottom Agar, and the third as LB-Top Agar. Now, weigh out four grams of pre-formulated LB powder in three sets and then transfer one set of weighed dried media into each bottle. Add 200 milliliters of water to the first bottle. Mix the contents using a magnetic stir bar.

Then, using a pH meter and constant stirring, bring the final pH to 7.4 through the addition of sodium hydroxide or hydrochloric acid. Repeat the water addition and pH adjustment for the other two remaining bottles, as well. Now, weigh out three grams of agar powder and add it to the second bottle to make a 1.5 % bottom agar. Finally, weigh 1. 2 grams of agar and add it to the third bottle to make the .6 % LB top agar. The broth condition in bottle one does not need an agar addition. Cap the bottle semi-tightly and then, sterilize the media by autoclaving at 121 degrees Celsius for 20 minutes. Once complete, remove the media bottles from the autoclave and immediately twist the bottle caps to close them fully to prevent contamination. Keep the LB-Broth and LB-Top Agar media on the bench for later use. Place the LB-Bottom Agar to cool in a water bath that is preset to approximately 45 degrees Celsius.

When the LB-Bottom agar reaches approximately 45 degrees Celsius, transfer it to the work bench. Next, sterilize the workspace using 70 % ethenol. Next, add 450 microliters of sterile one molar calcium chloride to the molten bottom agar to make a final concentration of 2.25 millimolar. Gently swirl the bottle to mix. Then, set out seven clean Petri dishes. Label each dish on the bottom with the media name and preparation date. Then, pour 15 milliliters of the bottom agar into each of the seven Petri dishes. Allow the plates to set for a few hours or overnight at room temperature. Once set, the culture plates can be stored at four degrees Celsius for several days if needed, upside down to minimize condensation. Transfer the Petri dishes from the four degrees Celsius refrigerator to a 37 degrees Celsius incubator one hour before the assay.

The day before the assay is to be preformed, the E. coli should be cultured. Here, 10 microliters of E. coli culture was inoculated into 10 milliliters of LB-Broth. Place the bacteria to grow overnight in a shaking incubator set to 37 degrees Celsius at 160 RPM. Then, on the day of the assay, remove the bacterial culture from the incubator. Seed a fresh 10 milliliters of fresh LB broth with 0.5 milliliters of the overnight culture. Place these cells to grow into a shaking incubator set to 37 degrees Celsius at 160 RPM. Next, use a spectrophotometer to check when this culture reaches log phase growth, indicated by an optical density of 0.5 to 0.7. Once the OD reaches this level, stop the incubation by transferring the cell culture to the bench. They are now ready to be used for phage overlay assay.

Phage titers can vary exponentially across different phage types and samples. So in order to count them effectively, they should be diluted to generate a wide range of phage concentrations. On the day of the assay, generate a series of phage dilutions ranging from one tenth to one millionth concentrations, following a 10-fold dilution technique. To obtain statistically significant and accurate data, perform the serial dilution in triplicate.

Next, melt the solidified LB-top agar using a microwave. Then, place it in a water bath that is preset at 45 degrees Celsius for one hour. After one hour, collect the Petri dishes containing the bottom agar layer from the incubator. Label the plates with phage concentration and assay date. Then, set out seven clean test tubes. Label each test tube with the serial phage dilution number and designate one as control.

When the LB-top agar reaches 45 degrees Celsius, transfer it to the working bench. Now, add 450 microliters of one molar calcium chloride to the 200 milliliter agar to make a final concentration of 2.25 millimolar. Gently swirl the bottle to mix. Next, add 35 milliliters of LB-top agar and four milliliters of bacterial suspension to a sterile conical tube. Gently swirl to evenly distribute the cells but avoid shaking to prevent foaming.

Now, aliquot five milliliters of this bacteria- top agar mix to each of the seven test tubes. Then, transfer 100 microliters of the serially diluted bacteriophage samples and control media, which should be simply media with no bacteriophage, to the respectfully labeled test tubes. Swirl the mixture gently to ensure proper mixing. Gently transfer five milliliters of bacteriophage mix onto the respective Petri plate. Evenly spread the mix throughout the whole surface by gently swirling the Petri plate.

Once all of the Petri plates are layered with the mix, allow solidification of the top layer by incubating at room temperature for 15 minutes. After completion of these steps, repeat the process for the second and then the third sets of the Petri dishes using the remaining two sets of phage dilutions. Seal each dish with parafilm and incubate at room temperature for 15 minutes. Place the culture plate upside down at a suitable temperature for 24 hours or until plaques develop. Here, plates were placed in a 37 degrees Celsius incubator for one day, a stimulating growth condition for E. coli and the T7 phage.

Plaques will appear after one to five days of incubation, depending on the bacterial species, incubation conditions, and the choice of medium. Here, plaques were visible after one day of incubation at 37 degrees Celsius. Begin by checking the plates marked control and ensure that no plaques were formed in these plates, as this would indicate viral contamination. To determine the phage titer in the original sample, start with the plates containing the most diluted phage sample first and count the plaques without removing the lids, marking them to indicate which ones have already been counted. Repeat the counting for each plate in every set. Some plates might have too many or too few plaques to be counted. Consider 10 to 150 as an ideal plaque count.

Next, generate a table listing the plaque number values for the different dilutions and replicates. Then, calculate the mean plaque number values for the dilution plates that contained the ideal number of plaque counts. In this example, these were the average number of plaques formed in the 10 to the minus three and 10 to the minus four dilution plates. Now, adjust for phage dilution factor by dividing the obtained mean plaque values by the respective phage dilution factors. Here, the average number of plaques formed to the 10 to the minus three and 10 to the minus four dilution plates, were divided by their respective dilution factors to obtain the number of plaque forming units, or PFUs, in 100 microliters of phage mixture. To convert the value to PFU per milliliter, multiply the generated values by 10, as only 100 microliters of phage dilution mix was used during the bacteriophage overlay preparation step, producing an additional dilution factor of 10. Finally, calculate the average of the values obtained from the different dilution plates. This will give the average number of PFUs per milliliter. The number of PFUs corresponds to the number of infective phage particles in the original sample.

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