Conjugação: um método para transferir a resistência à ampicilina da E. coli doadora para a receptora

1. Configuração

1. Autoclave aproximadamente 1L de médium Luria-Bertani (LB). Este LB estéril será usado para fazer aproximadamente 5 mL de LB contendo ácido diaminopimelic de 0,3 mM (DAP).
2. Recolher as seguintes placas: placas de ágar LB com 1X Tet e 0,3 mM DAP, placas de ágar LB apenas com 1X Tet e placas de ágar LB apenas com 1X Amp/Tet.
3. Certifique-se de que um pouco de glicerol e uma caixa de pontas de pipeta de plástico pré-esterilizadas estejam próximas.
4. Antes de iniciar qualquer trabalho envolvendo micróbios, esterilize o espaço de trabalho com 70% de etanol. Use sempre os equipamentos de proteção pessoal necessários, incluindo um jaleco e luvas.
5. Uma vez terminado, esterilize todas as superfícies e luvas com 70% de etanol e lave as mãos.

2. Preparação da cepa de doadores e receptores

1. Prepare 5 mL culturas bacterianas das cepas de doadores e receptores e cultivá-las durante a noite a 37 °C com aeração e agitação a 220 rpm. A cepa de doadores deve ser cultivada em LB com 0,3 mM DAP.
2. Gire 1 mL de ambas as culturas (~3000 rpm por 5 minutos) e lave as células com PBS.
3. Resuspend as células em 500 μL de salina tamponada de fosfato (PBS).

3. Conjugação

1. Combine 50 μL de células receptoras com 50 μL de células doadoras em um tubo de microcentrifuus e misture por pipetação.
2. Incubar a mistura celular por 1 hora a 37 °C. Isso aumentará a eficiência da conjugação antes e durante a próxima etapa de chapeamento.
3. Pipet 100 μL da mistura celular em uma placa de ágar com 1X Tet e 0,3 mM DAP. Não se espalhe na placa.
4. Pipet 100 μL de cultura celular receptora em uma placa de ágar com 1X Tet e 0,3 mM DAP. Não se espalhe na placa.
5. Incubar ambas as placas durante a noite a 37 °C.
6. Raspe a mistura de células de conjugação e a cultura celular receptora com um raspador de células estéril. Transfira as células para o tubo de microcentrifusagem estéril e resuspenque as células em 1 mL de PBS.
7. Vórtice das células e gire-as suavemente para baixo (~3000 rpm por 5 minutos).
8. Resuspense as células em 1 mL de PBS.
9. Aplaque a mistura da célula de reação de conjugação em uma placa de ágar LB apenas com 1X Amp/Tet. Nesta placa, espera-se que apenas as bactérias receptoras que obtiveram sucesso do gene de resistência amp através da conjugação cresçam.
10. Coloque as células receptoras em uma placa de ágar LB apenas com 1X Tet. Nesta placa, espera-se que apenas bactérias receptoras não julgadas, que não possuem o gene de resistência amp, cresçam.
11. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.
12. Escolha colônias únicas de ambas as placas e use-as para cultivar culturas durante a noite em 5 mL de mídia (37 °C com aeração a 220 rpm).

4. Isolamento do DNA

1. Isole o DNA das culturas previamente preparadas usando 4,5 mL do volume total de cultura por miniprep de DNA.
2. Para isso, elute o DNA usando 35 μL de água sem nuclease.
3. O DNA puro gerará uma razão de absorção (A_260/280) de aproximadamente 1,8.
4. Use os 0,5 mL restantes de cada cultura para preparar os estoques de glicerol, fazendo uma mistura de cultura bacteriana 1:1 e 100% glicerol.
5. Armazene os estoques do congelador a -80 °C.

5. Confirmação da Conjugação de Transferência Plasmid pela PCR

1. Prepare duas misturas mestres pcr, cada uma com um conjunto diferente de primers para frente e para trás, uma visando um segmento de 500 pares de base dentro do gene de resistência à ampicilina e a outra visando um segmento dentro de um gene de limpeza.
   1. Os primers genéticos de limpeza foram projetados para amplificar um segmento de DNA dentro da codificação genética bacteriana para o DNA gyrase B (14).
   2. Os seguintes volumes de reagente foram utilizados para preparar 90 μL de cada mix mestre:
      7,5 μL de 10 μM primer para frente
      7,5 μL de primer reverso de 10 μM
      75 μL de 2X PCR Master Mix
2. Prepare as seguintes seis reações de PCR usando 15 μL master mix, 10 ng de DNA de modelo e água sem nuclease até um volume final de 25 μL.
   DNA de reação conjugal e primers de ampicilina
   DNA de reação conjugal e primers de limpeza
   Dna de controle negativo e primers de ampicillina
   DNA de controle negativo e primers de limpeza
   Sem primers de DNA e ampicillina
   Sem dna e primers de limpeza
3. Transfira essas reações para uma máquina PCR com o bloco pré-aquecido para 98 C e comece a termociclamento sob as seguintes condições:
   98 °C por 30 segundos
   25-35 ciclos de 98 °C para 5-10 segundos, 45-72 °C por 10 a 30 segundos, e 72 °C para 15-30 segundos por kb
   72 °C por 5-10 minutos
   Mantenha a 4 °C
4. Carregue todas as seis reações do PCR em um gel de 1% de agarose e execute a ~150V por cerca de 20 minutos.
5. Visualize o produto do PC usando um iluminador UV.