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Células bacterianas, como E. coli, são capazes de transferir informações genéticas de célula para célula. A conjugação difere de outros mecanismos de transferência de DNA, como transdução ou transformação, pois requer contato físico entre as células.
Para prosseguir, a conjugação requer uma célula doadora que expresse o fator de fertilidade, ou F, e uma célula receptora sem ele, uma célula F menos. O processo requer duas etapas. O primeiro é o estabelecimento do contato direto célula a célula. Para fazer isso, a célula doadora gera uma estrutura filamentosa extracelular chamada pilus sexual. É chamado assim porque a conjugação é uma forma de acasalamento para bactérias que se reproduzem assexuadamente, mas deve-se notar que não é uma reprodução sexuada verdadeira, pois nenhum gameta é trocado e nenhum descendente é formado.
O segundo passo é a entrega de DNA à célula receptora. Depois que o pilus sexual estabelece contato entre duas células, um canal chamado sistema de secreção Tipo IV é construído, permitindo a transferência de DNA. A célula doadora então começa a replicar o DNA extracromossômico que será transferido selecionado com base na presença de um elemento genético conhecido como OriT ou origem da transferência. Uma extremidade do DNA recém-replicado é enfiada no conduto por meio da ligação à proteína do DNA. À medida que o DNA é replicado, ele é bombeado através do canal, facilitado por um complexo de proteínas codificadas por genes localizados próximos ao OriT. Uma vez que o DNA é totalmente transferido, ele formará um plasmídeo cromossômico extra ou poderá se integrar ao cromossomo da célula receptora. Qualquer que seja o ponto final do DNA transferido, os genes que ele codifica serão expressos. Essa expressão gênica pode ser usada para confirmar a conjugação bem-sucedida.
Por exemplo, considere um cenário em que a cepa do doador expressa resistência à ampicilina e a transmite no DNA conjugado para a bactéria receptora, mas a cepa receptora também tem um gene de resistência à tetraciclina não presente no doador. Nesse caso, quando as células são plaqueadas em meio LB contendo tetraciclina e ampicilina, as colônias devem crescer apenas a partir de bactérias conjugadas com sucesso, que expressarão ambos os fenótipos de resistência. Para confirmar ainda mais a conjugação bem-sucedida, o DNA do plasmídeo dessas colônias pode ser colhido e, em seguida, uma seção de DNA específica do plasmídeo transferido pode ser amplificada usando a reação em cadeia da polimerase, ou PCR. Quando o produto de PCR é executado em um gel de eletroforese ao lado de uma escada de tamanhos padrão, um fragmento de PCR de tamanho conhecido deve ser visível no gel, confirmando ainda mais a conjugação bem-sucedida. Neste experimento, um plasmídeo será usado para transferir o gene de resistência à ampicilina via conjugação de uma cepa doadora para uma cepa receptora resistente à tetraciclina. Em seguida, para confirmar a conjugação, a mistura de conjugação será incubada em uma placa contendo os dois antibióticos, deixando apenas as bactérias transformadas. Finalmente, a conjugação bem-sucedida será confirmada com PCR.
Antes de iniciar o procedimento, coloque o equipamento de proteção individual adequado, incluindo jaleco e luvas. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho usando etanol 70% para limpar a superfície.
Neste procedimento, o gene de resistência à ampicilina será transferido da cepa WM3064 de E. coli para a cepa J53 de E. coli via conjugação. A cepa doadora WM3064 é resistente à tetraciclina e ampicilina e requer ácido diaminopimélico, ou DAP, para crescer. A cepa receptora J53 é resistente apenas à tetraciclina e não requer DAP para crescer. Isso significa que as células conjugadas com sucesso devem ser resistentes à tetraciclina e ampicilina e podem crescer sem DAP.
Preparar a cultura da estirpe doadora inoculando cinco mililitros de LB contendo 0,3 milimoles de DAP com um resíduo do stock de glicerol da estirpe doadora congelada. Em seguida, prepare a cepa receptora inoculando cinco mililitros de caldo LB sem DAP com um pedaço do estoque de glicerol da cepa receptora congelada. Cultive essas culturas durante a noite a 37 graus Celsius com aeração e agitação a 220 RPM em uma incubadora agitada. Uma vez que as culturas tenham crescido para um OD 600 de dois, remova um mililitro de cultura de cada uma e coloque-o em dois novos tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugue essas alíquotas a 3000 RPM por cinco minutos para peletar as células bacterianas. Descarte o sobrenadante e lave cada pellet com 250 microlitros de PBS 1X. Centrifugar novamente as amostras e, depois de rejeitar o sobrenadante, ressuspender cada pellet em 500 microlitros de PBS.
Para iniciar o procedimento de conjugação, primeiro combine 50 microlitros de células receptoras com 50 microlitros de células doadoras em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e misture pipetando para cima e para baixo suavemente. Em seguida, pipete 100 microlitros da cultura de células receptoras em outra placa de tetraciclina 1X contendo DAP. Em seguida, prepare seu controle negativo pipetando 100 microlitros da cultura de células receptoras apenas em uma placa de ágar não seletiva contendo DAP. Em seguida, incube as placas de conjugação e controle negativo durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, pegue um raspador de células estéreis e colha as células da placa de conjugação coletando colônias. Em seguida, transfira as colônias para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro contendo um mililitro de PBS 1X. Repita esse processo para coletar as células receptoras da outra placa.
Depois disso, vortex as amostras para misturar. Após a mistura, transfira os tubos para uma centrífuga para peletar suavemente as células. Descarte o sobrenadante, depois lave os grânulos celulares em um mililitro de PBS e vortex os tubos para ressuspender as células. Pulverize as células novamente por centrifugação. Rejeitar novamente o sobrenadante e ressuspender ambas as células em um mililitro de PBS. Agora, usando uma ponta de pipeta estéril, coloque 100 microlitros da mistura de células de reação de conjugação em uma placa de ágar LB sem DAP contendo 1X tetraciclina e 1X ampicilina. Repita o método de plaqueamento usando 100 microlitros de uma diluição de dez vezes da mesma mistura de células em PBS em outra placa de ágar LB sem DAP contendo 1X tetraciclina e 1X ampicilina.
Finalmente, pipete 100 microlitros da mistura de células de controle negativo em uma única placa de ágar LB com apenas tetraciclina 1X. Após a incubação noturna a 37 graus Celsius, as colônias devem estar visíveis. Usando uma ponta de pipeta estéril, pegue uma única colônia da placa de reação de conjugação e adicione-a a um tubo contendo cinco mililitros de meio LB seletivo contendo ambos os antibióticos. Em seguida, repita o isolamento da colônia selecionando uma única colônia da placa de células receptoras. Cultive essas culturas durante a noite a 37 graus Celsius com aeração a 220 RPM.
No dia seguinte, limpe a bancada com etanol a 70% e remova as placas da incubadora. Use um mini kit de preparação de DNA para isolar o DNA de 4. 5 mililitros de cada cultura de acordo com as instruções do fabricante. Depois de completar a mini preparação de DNA, elua o DNA usando 35 microlitros de água livre de nuclease. Por fim, use o 0 restante. 5 mililitros de cada cultura para preparar estoques de glicerol de um mililitro adicionando 0,5 mililitros de glicerol 100% para uma diluição de um para um. Coloque essas alíquotas a 80 graus Celsius negativos para armazenamento até que seja necessário.
Para confirmar a conjugação bem-sucedida por PCR, primeiro prepare uma mistura mestre de PCR adicionando 75 microlitros de mistura mestre de PCR 2X a um tubo de microcentrífuga. Em seguida, adicione 7,5 microlitros de um primer direto de 10 micromolares e um primer reverso de 10 micromolares projetado para amplificar o gene de resistência à ampicilina do plasmídeo. Em seguida, prepare uma segunda mistura mestre de PCR adicionando 75 microlitros de mistura mestre de PCR 2X a um tubo de microcentrífuga e, em seguida, adicionando 7,5 microlitros de um primer direto de 10 micromolares e um primer reverso de 10 micromolares projetados para amplificar um gene de manutenção, neste caso DNA girase B.
Agora, adicione 15 microlitros da primeira mistura principal a um tubo de PCR e, em seguida, adicione 10 nanogramas, aproximadamente dois microlitros do DNA experimental molde para o mesmo tubo. Aumente a reação até um volume final de 25 microlitros com água livre de nuclease. Repita essas etapas para produzir as cinco reações restantes, de modo que os tubos contenham os componentes mostrados aqui. Agora, transfira essas reações para um termociclador com o bloco pré-aquecido a 98 graus Celsius e, em seguida, inicie o programa. Após a conclusão do PCR, remova os tubos da máquina. Em seguida, carregue dois microlitros de cada reação misturados com dois microlitros de corante de carga e quatro microlitros de um marcador de peso molecular em poços consecutivos de um gel de agarose a 1%. Defina o gel para funcionar a 150 volts por 20 minutos. Por fim, visualize o gel usando um iluminador UV.
Neste experimento, a transferência bem-sucedida do gene de resistência à ampicilina via conjugação foi confirmada via PCR. Aqui, uma banda de aproximadamente 500 pares de bases deve ser observada no poço contendo o DNA conjugado e os primers de ampicilina, bem dois neste exemplo. Um gene de manutenção, DNA girase B, foi carregado nos poços três e cinco com DNA conjugado e DNA de células receptoras, respectivamente. As bandas observadas nesses poços atuam como um controle positivo para garantir que o molde de DNA esteja presente e que a PCR tenha sido bem-sucedida. As bandas não devem ser observadas no poço que contém a reação para o DNA da célula receptora e o par de primers de ampicilina, bem quatro neste exemplo, porque as células receptoras não são resistentes à ampicilina. Além disso, nenhuma banda deve ser observada nas reações sem DNA molde, poços seis e sete aqui. Se essas condições forem atendidas, isso confirmará a transferência bem-sucedida do gene de resistência à ampicilina, conferindo resistência à ampicilina da cepa WM3064 de E. coli para a cepa J53 de E. coli.
