Analisando Expressão Gênica de comunidades microbianas Marinha usando transcriptômica Ambiental

Este procedimento começa com a aquisição de biomassa microbiana marinha a partir de amostras de água por pré-filtração através de filtros de cinco e três micrômetros, seguida pela coleta em um filtro de 0,22 micrômetro. O RNA total é então extraído dos organismos retidos no filtro de 0,22 micrômetro. Nosso RNA é removido do RNA total por degradação enzimática seletiva e o Mr.N enriquecido por hibridização subtrativa é amplificado linearmente por caudação de poliA e transcrição in vitro.

O RNA antissenso amplificado é então convertido em DNA de dupla fita utilizando hexâmeros aleatórios. O DNA resultante pode ser clonado e sequenciado ou diretamente submetido à pirosequenciação. Olá, sou Rachel Persky do laboratório da Dra. Marianne Moran do Departamento de Ciências Marinhas da Universidade da Geórgia.

Hoje vamos mostrar um procedimento para analisar a expressão gênica a partir de amostras ambientais, utilizando metatranscriptômica ambiental. Scott Gifford mostrará como processar amostras ambientais para a coleta de RNA.

Mostrarei como extrair RNA das amostras e dos RINs de Johanna. AON demonstrará a remoção de RNA. Em seguida, Maria Kosta explicará as etapas de amplificação de RNA e síntese de CD NA.

Então vamos começar. Para iniciar a coleta de RNA ambiental, montamos o sistema de filtração colocando uma extremidade da tubulação na água na profundidade desejada para a amostragem e conectando a extremidade oposta a um filtro de alto volume de três micrômetros, posicionando a bomba entre as duas extremidades da tubulação. O filtro de três micrômetros é então conectado à torre de filtro de 0,22 micrômetro, e o efluente é direcionado da torre de 0,22 micrômetro para um recipiente graduado.

Execute vários litros de água pelo sistema para enxaguar. Ao finalizar, remova o tubo da água enquanto a bomba está em funcionamento para eliminar a água remanescente da linha. Em seguida, use um par de pinças para colocar um filtro de 0,22 micrômetro na torre de filtro e feche-a.

Coloque a extremidade da mangueira de volta na água e ligue a bomba. Deixe o ar ser expulso dos dois filtros e monitore o volume de água filtrada no balde. Uma vez que o volume desejado tenha sido filtrado, remova a mangueira da água e elimine a água restante do sistema.

Assim que o filtro estiver seco, remova rapidamente a placa superior do filtro e dobre o papel de filtro. Coloque o filtro em um recipiente tipo whirl pack e congele rapidamente em nitrogênio líquido. Antes de iniciarmos o experimento, é importante observar que, como os RNAs são ubíquos e os RNAs mensageiros se degradam rapidamente, devem ser seguidas as precauções padrão para trabalhar em um ambiente livre de ribonucleases, incluindo superfícies de trabalho e pipetas.

Com isso em mente, luvas limpas devem ser usadas ao manipular quaisquer materiais empregados neste procedimento. Além disso, as amostras devem ser processadas no menor tempo possível. Para iniciar a extração de RNA total do filtro de 0,22 micrômetro, preparamos tubos com esferas de vidro adicionando oito mililitros de tampão RLT com beta meto etanol a um tubo cônico de 50 mililitros.

Em seguida, adiciona-se um a dois mililitros de perlas de RNA de um kit de extração de solo com energia móvel. Retire rapidamente o filtro congelado do congelador e mantenha-o no pacote térmico. Quebre-o com um martelo.

Adicione o filtro fragmentado ao tubo cônico de 50 mililitros preparado e feche a tampa do tubo com parafilm ou fita laboratorial. Vortexe por 10 minutos. Em seguida, centrifugue o tubo de 50 mililitros a 5.000 RPM por um minuto. À temperatura ambiente, remova o máximo possível do lisado e transfira-o para um tubo de 15 mililitros antes de centrifugar novamente por cinco minutos.

A 5.000 ×g, o sobrenadante é então transferido para um novo tubo de 50 mililitros e um volume de etanol a 100% é adicionado ao lisado. Usando uma seringa de 10 mililitros, aspire o lisado através de uma agulha de 18 a 21 calibres e repasse-o aproximadamente cinco vezes. Nas etapas subsequentes de extração, utilize o kit KaiGen R e easy mini seguindo as instruções do fabricante, aplicando o lisado na coluna fornecida, seja com o manifold a vácuo ou com centrifugações repetidas.

Quantifique o RNA total espectrofotometricamente. Após determinar o rendimento total de RNA, utilizamos o kit Ambien turbo DNA free de acordo com as instruções do fabricante para remover quaisquer contaminações por DNA. Agora que as extrações de RNA estão concluídas, vou entregar o RNA total à Johanna, que realizará os passos de remoção do rRNA primário e secundário.

Obrigado, Rachel. Para iniciar a remoção de rRNA, misture suavemente e centrifugue brevemente o tampão de reação 10 vezes antes do uso em um tubo estéril livre de RNase de 0,5 mililitro, combine os volumes apropriados de tampão de reação 10 vezes, inibidor de RNA, amostra de RNA total e exonuclease terminator. De acordo com o protocolo da Epicenter, incube a reação a 30 graus Celsius por 60 minutos em um termociclador com tampa aquecida ou banho-maria.

Em seguida, interrompa a reação por precipitação com fenol-álcool, primeiro adicionando água livre de RNAses a um volume total de 200 microlitros e, em seguida, adicionando um volume de uma solução de fenol-clorofórmio na proporção um para um ao mRNA em centrífuga. Recolha a fase aquosa e, então, precipite com etanol a cem por cento e assalto. Este é um ponto potencial de interrupção.

O RNA pode ser armazenado a menos 80 graus Celsius até que se esteja pronto para usar a amostra em aplicações posteriores. Após concluirmos o primeiro enriquecimento de mRNA, utilizaremos os kits Ambien microbe enrich e microbe express de acordo com as instruções do fabricante para remover qualquer rRNA residual da nossa amostra. Para facilitar a remoção de rRNA eucariótico, utilizaremos o kit microbe enrich.

Todos os volumes são determinados pela leitura das instruções do fabricante. Para iniciar, pipete 300 microlitros de tampão de ligação em um tubo de 1,5 mililitro. Adicione de 5 a 100 microgramas de RNA total em um volume máximo de 30 microlitros e vortexe.

Adicione cuidadosamente dois microlitros da mistura de oligos de captura para cinco microgramas de RNA em tampão de ligação e bata suavemente no tubo. Centrifugue brevemente a mistura. Desnature a mistura a 70 graus Celsius por 10 minutos antes de incubá-la a 37 graus Celsius por uma hora.

Durante esta incubação, prepare as microesferas magnéticas com oligos lavando-as uma vez com água livre de nucleases e uma vez com tampão de ligação, capturando as microesferas em um suporte magnético entre cada lavagem. Armazene as microesferas no gelo e aqueça-as até a temperatura ambiente. Cinco minutos antes do uso, aqueça a solução de lavagem a 37 graus Celsius em um bloco térmico.

Adicione a mistura de oligos de captura de RNA aos grânulos magnéticos com oligos lavados, misture suavemente o tubo e centrifugue. Incube brevemente a mistura a 37 graus Celsius por 15 minutos. Coloque o tubo no suporte magnético e aguarde cerca de três minutos antes de aspirar o sobrenadante contendo mRNA e, em seguida, transfira-o para um tubo de coleta sobre gelo.

Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de lavagem pré-aquecida às microesferas capturadas. Vortexe suavemente para capturar as microesferas e recolher o sobrenadante. Transfira este sobrenadante, contendo o Mr.NA, para um tubo de coleta mantido em gelo.

Coloque um tubo de coleta em gelo enquanto prepara a remoção do rRNA de procariotos utilizando o kit Ambi Microbe Express, que será usado para remover o rRNA residual de procariotos. Utilize o Bioanalyzer ou o Experion para verificar a contaminação por rRNA e a qualidade do MR.NA. Este é um ponto potencial de interrupção.

O RNA pode ser armazenado a menos 80 graus Celsius. Uma vez que o rRNA tenha sido removido, utilizaremos o kit Ambien Message AMP dois bactérias de acordo com as instruções do fabricante para amplificar nosso mRNA. Agora que temos uma amostra pura de mRNA, passarei o experimento para Maria, que irá guiá-los pela amplificação de mRNA e síntese de cDNA.

Obrigado, Hannah. Antes de iniciarmos a amplificação de mRNA, calcule os volumes de cada componente dos master mixes do kit Ambien Message AMP dois bactérias on-line. Começamos a poliadenilação do RNA modelo colocando até 1000 nanogramas de RNA total em um tubo microfuga estéril livre de RNA. Use 6,5 microlitros da amostra e água livre de RNA no primeiro tampão para sintetizar um RNA por transcrição in vitro.

Recomenda-se o uso de forno ou incubadora de hibridização devido à sua temperatura uniforme. E, como é extremamente importante que não se forme condensação no interior dos tubos, recomendamos fortemente uma incubação da reação de transcrição in vitro por 14 horas. Para maximizar o rendimento de RNA para o maior rendimento possível de RNA A, realize a IBT em um volume final de reação de 40 microlitros e armazene o RNA A a menos 80 graus Celsius em alíquotas de aproximadamente 10 microlitros.

Uma vez que o RNA é amplificado, é hora de sintetizar o DNA complementar ou cDNA. O kit Promega Universal RiboClone de síntese de cDNA é usado para sintetizar cDNA a partir do RNA. O kit fornece instruções para converter dois microgramas de RNA em cDNA. Recomendamos a utilização de seis a dez microgramas de RNA e o ajuste proporcional das reações.

Limpe o DNAc utilizando uma precipitação com etanol ou o sistema Promega Wizard de purificação de DNA. De acordo com as instruções do fabricante, armazene as amostras a menos 80 graus Celsius. Neste ponto, o DNAc de fita dupla pode ser sequenciado diretamente. A partir de 10 litros de água do mar, extraímos aproximadamente 10 microgramas de RNA ambiental e amplificamos 20 vezes por meio da conversão do RNAm amplificado em DNAc de fita dupla, gerando quantidades suficientes de material para o sequenciamento e análise de transcritos ambientais. Acabamos de mostrar como avaliar a expressão gênica em comunidades microbianas marinhas utilizando metatranscriptômica ambiental.

Lembre-se sempre de que, ao realizar este procedimento, o mRNA é degradado rapidamente e os RNAs são ubíquos. Portanto, tome as precauções padrão para trabalhar em um ambiente livre de ribonucleases e processe as amostras o mais rapidamente possível. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.