Analisando Expressão Gênica de comunidades microbianas Marinha usando transcriptômica Ambiental

Este procedimento começa com a aquisição de biomassa microbiana marinha de amostras de água por pré-filtração através de filtros de cinco e três micrômetros, seguida de coleta em um filtro de 0,22 micrômetro. O RNA total é então extraído dos organismos retidos no filtro de 0,22 micrômetro. Nosso RNA é removido do RNA total por degradação enzimática seletiva e hibridização subtrativa enriquecida Mr.N é amplificado linearmente via rejeito polyA e transcrição in vitro.

O RNA antisense amplificado é então convertido em CD NA de fita dupla usando hexâmero aleatório. O CD NA resultante pode ser clonado e sequenciado ou diretamente piro sequenciado. Olá, sou Rachel Persky, do laboratório da Dra. Marianne Moran no Departamento de Ciências Marinhas da Universidade da Geórgia.

Hoje vamos mostrar um procedimento para observar a expressão gênica de amostras ambientais. Usando metatranscriptômica ambiental. Scott Gifford mostrará como processar amostras ambientais para coleta de RNA.

Vou mostrar como extrair RNA das amostras e Johanna RINs. A AON demonstrará a remoção de RNA. Maria Kosta passará então pelas etapas de amplificação de RNA e síntese de CD NA.

Então vamos começar. Para iniciar a coleta de RNA ambiental, montamos o sistema de linha de filtro colocando uma extremidade da tubulação na água na profundidade desejada para amostragem e conectamos a extremidade oposta a um filtro de três micrômetros de alto volume, colocando a bomba entre as duas extremidades da tubulação. O filtro de três micrômetros é então conectado à torre de filtro de 0,22 micrômetro e o fluxo de saída é direcionado da torre de 0,22 micrômetro para uma carga graduada.

Passe vários litros de água pelo sistema para enxaguar. Quando terminar, remova a tubulação da água enquanto a bomba estiver funcionando para purgar a água restante da linha. Em seguida, use uma pinça para colocar um filtro de 0,22 micrômetro na torre do filtro e feche-o.

Coloque a extremidade da linha de volta na água e ligue a bomba. Deixe o ar ser purgado de ambos os filtros e monitore o volume de água filtrada com o garrafão. Uma vez filtrado o volume desejado, retire a linha da água e retire a água restante do sistema.

Assim que o filtro estiver seco, remova rapidamente a placa superior do filtro e dobre o papel de filtro. Coloque o filtro em um pacote giratório e congele em nitrogênio líquido. Antes de começarmos o experimento, é importante observar que, como os RNAs são onipresentes e os mRNAs se degradam rapidamente, as precauções padrão para trabalhar em um ambiente livre de ribonuclease devem ser seguidas, incluindo superfícies de trabalho e pipetas.

Com isso em mente, luvas limpas devem ser usadas ao manusear qualquer material usado neste procedimento. E as amostras devem ser processadas no menor tempo possível. Para iniciar a extração total de RNA do filtro de 0,22 micrômetro, preparamos tubos de beading adicionando oito mililitros de tampão RLT com beta-meto etanol adicionado a um tubo cônico de 50 mililitros.

Em seguida, um a dois mililitros de grânulos de RNA de um kit móvel de extração de solo são adicionados. Remova rapidamente o filtro congelado do freezer e mantenha-o na embalagem mundial. Quebre-o com um martelo.

Adicione o filtro quebrado ao tubo cônico de 50 mililitros preparado e sele a tampa do tubo com parfum ou vórtice de fita de laboratório por 10 minutos. Em seguida, centrifugue o tubo de 50 mililitros a 5.000 rpm por um minuto. À temperatura ambiente, retirar o máximo possível do lisado e transferi-lo para um tubo de 15 mililitros antes de voltar a centrifugar durante cinco minutos.

A 5.000 vezes G, o sobrenadante é então transferido para um novo tubo de 50 mililitros e um volume de etanol a 100% é adicionado ao lisado. Usando uma seringa de 10 mililitros, passe o lisado por uma agulha de calibre 18 a 21 e passe-o de volta cerca de cinco vezes. Etapas de extração subsequentes, use o KaiGen R e o mini kit fácil seguindo as instruções do fabricante, aplicando o lisado na coluna fornecida com o coletor de vácuo ou com centrifugação repetida.

Quantificar o espectro total de RNA fotometricamente. Depois de determinar o rendimento total de RNA, usamos o kit livre de DNA turbo Ambien de acordo com as instruções do fabricante para remover quaisquer contaminações de DNA. Agora que as extrações de RNA foram concluídas, vou entregar o RNA total para Johanna, que fará a primeira e a segunda etapas de remoção de RRNA.

Obrigado Rachel. Para iniciar a remoção do RRNA, misture suavemente e centrifugue brevemente o mRNA apenas 10 vezes o tampão de reação antes de usar em um tubo estéril de 0,5 mililitro livre de RNA, combine os volumes apropriados de 10 vezes o inibidor de RNA do tampão de reação, a amostra total de RNA e a exonuclease terminadora. De acordo com o protocolo do epicentro, incube a reação a 30 graus Celsius por 60 minutos em um termociclador com tampa aquecida ou banho-maria.

Em seguida, termine a reação com uma precipitação de fenol etanol Adicionando primeiro água livre de RNAs a um volume total de 200 microlitros e, em seguida, adicionando um volume de uma solução de fenol clorofórmio um para um à centrífuga de mRNA. Colete a fase aquosa e precipite com cem por cento de etanol e ataque. Este é um ponto de parada potencial.

O RNA pode ser armazenado a 80 graus Celsius negativos até que se esteja pronto para usar a amostra em aplicações downstream. Depois de concluir o primeiro enriquecimento de mRNA, usaremos os kits de enriquecimento de micróbios e expresso de micróbios Ambien de acordo com as instruções do fabricante para remover qualquer RRNA residual de nossa amostra. Para facilitar a remoção do RRNA eucariótico, usaremos o kit de enriquecimento de micróbios.

Todos os volumes são determinados lendo as instruções do fabricante. Para iniciar a pipeta, 300 microlitros de tampão de ligação em um tubo de 1,5 mililitro. Adicione cinco a 100 microgramas de RNA total em um volume máximo de 30 microlitros e vórtice.

Adicione suavemente dois microlitros de mistura de oligo de captura para cinco microgramas de RNA no tampão de ligação e bata suavemente no tubo. Gire brevemente a mistura. Desnature a mistura a 70 graus Celsius por 10 minutos antes de ajoelhar a mistura a 37 graus Celsius por uma hora.

Durante esta incubação, prepare os grânulos oligo mag lavando-os uma vez em água livre de nuclease e uma vez em tampão de ligação e capturando os grânulos em um suporte magnético entre as lavagens. Guarde as contas no gelo e aqueça-as até a temperatura ambiente. Cinco minutos antes de usar, aqueça a solução de lavagem a 37 graus Celsius em um bloco de calor.

Adicione a mistura de oligo de captura de RNA aos grânulos de oligo mag lavados, enterre delicadamente, misture o tubo e gire. Incube brevemente a mistura a 37 graus Celsius por 15 minutos. Coloque o tubo no suporte magnético e aguarde cerca de três minutos antes de aspirar o mRNA contendo sobrenadante e depois transferi-lo para um tubo de coleta no gelo.

Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de lavagem pré-aquecida às esferas capturadas. E gentilmente captura as contas e recupera o tolo sobrenadante. Este sobrenadante com Mr.NA no tubo de coleta no gelo.

Coloque um tubo de coleta no gelo enquanto se prepara para remover o RRNA procariótico usando o kit ambi microbe express, que usaremos para remover o RRNA procariótico residual. Use o bioanalisador ou Experion para verificar se há contaminação por RRNA e RM. Qualidade NA. Este é um ponto de parada potencial.

O RNA pode ser armazenado a 80 graus Celsius negativos. Uma vez removido o RRNA, usaremos o kit de duas bactérias AMP da mensagem Ambien de acordo com as instruções do fabricante para amplificar nosso mRNA. Então, agora que temos uma amostra pura de mRNA, vou entregar o experimento para Maria, que o guiará através da amplificação de mRNA e síntese de CDNA.

Obrigada, Hannah. Antes de começarmos a amplificação do mRNA, calculamos os volumes de cada componente da mensagem Ambien AMP duas misturas mestras de bactérias online, começamos a poliadenilação do RNA modelo colocando até 1000 nanogramas de RNA total em um tubo de micro fuge livre de RNA estéril. Use 6,5 microlitros de amostra e nenhuma água livre de RNA no primeiro tampão para sintetizar um RNA por meio da transcrição in vitro.

Recomenda-se o uso de um forno de hibridização ou incubadora devido à sua temperatura uniforme. E porque é extremamente importante que a condensação não se forme dentro dos tubos, recomendamos fortemente uma incubação de reação de transcrição in vitro de 14 horas. Para maximizar um rendimento de RNA para o maior rendimento de RNA A, conduza o IBT em um volume de reação final de 40 microlitros, armazene um RNA a 80 graus Celsius negativos em quats de aproximadamente 10 microlitros.

Uma vez que o RNA é amplificado, é hora de sintetizar o complementar ou CDNA. O Ribot Universal Promega Clone. O kit do sistema de síntese de CDNA é usado para sintetizar CD NA a partir de um NA. O kit fornece instruções para converter dois microgramas, um NA para CD NA. Recomendamos a entrada de seis a 10 microgramas por NA e o dimensionamento das reações de acordo.

Limpe o CD NA usando uma precipitação de etanol ou o sistema de limpeza de DNA do assistente promega. De acordo com as instruções do fabricante, armazenar amostras a 80 graus Celsius negativos CDNA de fita dupla pode ser sequenciado diretamente neste ponto a partir de 10 litros de água do mar, extraímos aproximadamente 10 microgramas de RNA ambiental e amplificamos a 20 vezes através da conversão do MR amplificado. NA para CDNA de fita dupla foram geradas quantidades suficientes de material para sequenciamento e análise de transcritos ambientais. Acabamos de mostrar como avaliar a expressão gênica de comunidades microbianas marinhas usando metatranscriptômica ambiental.

Lembre-se sempre de que, ao fazer este procedimento, o mRNA se degrada rapidamente e os RNAs são onipresentes. Portanto, tome as precauções padrão para trabalhar em um ambiente livre de núcleo de costela e processe as amostras o mais rápido possível. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.