Name: Analisando Expressão Gênica de comunidades microbianas Marinha usando transcriptômica Ambiental (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: Aprenda transcriptômica ambiental para análise de expressão gênica em comunidades microbianas marinhas. Este método computacional permite estudar a atividade funcional de ecossistemas oceânicos.

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O financiamento foi fornecido pela The Gordon e Betty Moore Foundation concede e da National Science Foundation conceder MCB-0702125.

<ol><li>Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).</li>
<li>Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).</li>
<li>Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).</li>
<li>Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).</li>
<li>Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).</li>
<li>Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).</li>
<li>Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).</li>
</ol>

A investigação da expressão gênica por comunidades microbianas naturais tem se tornado comum nos últimos anos como um meio para explorar os papéis e funções ecológicas dos microrganismos. Usado em combinação com a detecção, quantificação e caracterização de microrganismos marinhos, análises de expressão gênica pode ser usada para ligar filogenia para funcionar em comunidades microbianas naturais. Muitas técnicas para orientar a expressão do gene funcional contar com sondas específicas ou conjuntos primário projetado par...

<table><tbody><tr><td>Tubos de esferas PowerSoil</td><td>kit</td><td>MoBio</td><td>12866-25-PBT</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNeasy Mini</td><td>kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNA-&lt;em&gt;free&lt;/em&gt;</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Isolamento de mRNA Procarionte mRNA-ONLY</td><td>kit</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>MOP51010/MOP51024</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Enriquecimento de mRNA Bacteriano MICROB&lt;em&gt;Express&lt;/em&gt;</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1905</td><td></td></tr><tr><td>Kit MICROB&lt;em&gt;Enrich&lt;/em&gt;</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1901</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Amplificação de RNA Bacteriano MessageAmp II</td><td>kit</td><td>Ambion</td><td>AM1790</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Universal de Síntese de cDNA RiboClone</td><td>kit</td><td>Promega Corp.</td><td>C4360</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Wizard de Purificação de DNA</td><td>kit</td><td>Promega Corp.</td><td>A7280</td><td></td></tr></tbody></table>

analisando expressão gênica de comunidades microbianas marinha usando transcriptômica ambiental

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

Análogo a metagenômica, transcriptômica ambiental (metatranscriptómica) recupera e seqüências de mRNAs ambientais a partir de um assemblage microbiana sem o conhecimento prévio do que genes a comunidade pode estar expressando. Assim, ele fornece a perspectiva mais imparcial sobre a expressão gênica comunidade<em&gt; In situ</em&gt;. Protocolos ambientais transcriptômica são tecnicamente difícil, uma vez mRNAs procarióticos geralmente falta a poli (A) caudas que fazem o isolamento de mensagens eucarióticas relativamente simples<sup&gt; 1</sup&gt; E por causa da meia vida relativamente curto de mRNAs<sup&gt; 2</sup&gt;. Além disso, mRNAs são muito menos abundante do que rRNAs em extratos totais de RNA, assim, um fundo rRNA muitas vezes supera os sinais de mRNA. No entanto, as técnicas para superar algumas dessas dificuldades têm sido recentemente desenvolvidos. Um procedimento para analisar transcriptomes ambiental através da criação de bibliotecas clone usando primers aleatórios para reverter-transcrever e amplificar mRNAs ambiental foi descrita recentemente foi bem sucedido em dois diferentes ambientes naturais, mas os resultados foram influenciados pela seleção dos primers aleatórios usado para iniciar a síntese de cDNA<sup&gt; 3</sup&gt;. Avanços na amplificação linear de mRNA evitaria a necessidade de primers aleatórios na etapa de amplificação e tornar possível a utilização de menos material de partida diminuindo o tempo de coleta e processamento de amostras e, assim, minimizar a degradação do RNA<sup&gt; 4</sup&gt;.<em&gt; In vitro</em&gt; Métodos de transcrição para RNAm ampliando envolvem polyadenylating o mRNA e incorporando um promotor T7 na extremidade 3 do transcrito. RNA amplificado (ARNA) pode então ser convertido em cDNA dupla fita usando hexâmeros aleatória e diretamente sequenciado por pyrosequencing<sup&gt; 5</sup&gt;. A primeira utilização deste método na Estação ALOHA demonstrado a sua utilidade para a caracterização de expressão gênica comunidade microbiana<sup&gt; 6</sup&gt;.

Nós apresentamos um método para gerar cDNA de mRNA ambiental. Em geral, o total de RNA é a primeira coletados do ambiente, rRNA é seletivamente removido, mRNA é seletivamente amplificado, e cDNA sintetizado a partir do pool de mRNA enriquecido é seqüenciado. Seqüências recuperadas podem ser anotados usando técnicas padrão de bioinformática para identificar os genes expressos.

Analisando Expressão Gênica de comunidades microbianas Marinha usando transcriptômica Ambiental

Análoga à metagenômica, a transcriptômica ambiental (metatranscriptômica) recupera e sequencia mRNAs ambientais de um agrupamento microbiano ...

Este procedimento inicia-se com a aquisição de biomassa microbiana marinha a partir de amostras de água por pré-filtração através de filtros de cinco e três micrômetros, seguida pela coleta em um filtro de 0,22 micrômetro. O RNA total é então extraído dos organismos retidos no filtro de 0,22 micrômetro. Nosso RNA é removido do RNA total por degradação enzimática seletiva e o Mr.N enriquecido por hibridização subtrativa é amplificado linearmente por meio de cauda de poliA e transcrição in vitro.O RNA antissenso amplificado é então convertido em DNA de dupla fita utilizando hexâmeros aleatórios. O DNA resultante pode ser clonado e sequenciado ou diretamente submetido à pirosequenciação. Olá, sou Rachel Persky do laboratório da Dra. Marianne Moran do Departamento de Ciências Marinhas da Universidade da Geórgia.Hoje vamos mostrar um procedimento para analisar a expressão gênica a partir de amostras ambientais, utilizando metatranscritômica ambiental. Scott Gifford mostrará como processar amostras ambientais para a coleta de RNA.Mostrarei como extrair RNA das amostras e dos RINs de Johanna. AON demonstrará a remoção de RNA. Em seguida, Maria Kosta explicará as etapas de amplificação de

analyzing-gene-expression-from-marine-microbial-communities-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Construção de uma biblioteca fosmid com DNA genômico ambiental isolado do contínuo de profundidade vertical de um fiorde sazonalmente hipóxica é descrito. A biblioteca clone resultante é escolhido em 384 poços pratos e arquivados para seqüenciamento e análise funcional a jusante pela aplicação de um sistema automatizado colônia colheita.

Grandes Inserir Produção Ambiental Biblioteca Genômica

Um método para a extração de metabólitos de comunidades planctônicas microbianas é apresentado. Amostragem comunidade inteira é obtida por filtração em filtros especialmente preparados. Após liofilização, aquosa solúveis em metabolitos são extraídos. Esta abordagem permite a aplicação da metabolômica ambientais para trans-genómica investigações de comunidades microbianas naturais ou experimentais.

Concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para Metabolomics ambiental utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear

Caracterizar a comunidade microbiana tem sido um objetivo de longa data na microbiologia ambiental. Os métodos de sequenciamento de última geração agora permitem a caracterização de comunidades microbianas em uma profundidade sem precedentes, com custo e mão de obra mínimos. Detalhamos aqui nossa abordagem para sequenciar genes de RNA ribossômico 16S bacteriano usando um sequenciador de bancada.

O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons

Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para avaliar a disponibilidade de nutrientes orgânicos e inorgânicos e a abundância e estrutura das comunidades microbianas e virais em ambientes marinhos remotos.

Desvendando os jogadores invisíveis no Oceano - Um Guia de Campo para Química da Água e Microbiologia Marinha

Este manuscrito descreve o uso de tecnologia de ponta fornecida por microarrays de DNA. Os microarrays fornecem uma visão geral das alterações transcriptômicas em bactérias incorridas sob uma condição específica. Além disso, destacamos a facilidade com que grandes quantidades de dados podem ser analisadas usando pacotes de software desenvolvidos internamente convenientes.

A Pipeline rápido e confiável para estudo de Análise de Caso bacteriana transcriptoma: Regulamento Gene Serina-dependente em<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Este protocolo é para a extração e concentração de proteína e DNA de biomassa microbiana coletada da água do mar, seguida pela geração de peptídeos trípticos adequados para análise proteômica baseada em espectrometria de massa em tandem.

Um Aquatic Microbial metaproteômica fluxo de trabalho: a partir de células para Tryptic Peptides adequado para análise baseada em espectrometria de massa em tandem

Desenvolvemos um protocolo rápido, sensível e reprodutível para o perfil de expressão gênica de patógenos durante uma infecção.

Gene Expression Profiling de micróbios Contaminando utilizando uma plataforma digital de codificação em barra

Um protocolo para quantificar genes bacterianos de rRNA 16S e transcritos de sedimentos costeiros por meio de PCR em tempo real é fornecido. A metodologia inclui a coextração de DNA e RNA; preparação de RNA livre de DNA; e quantificação do gene 16S rRNA e transcrito via RT-q-PCR, incluindo construção de curva padrão.

DNA-RNA simultânea de extração de sedimentos costeiros e quantificação de 16S rRNA genes e transcritos por PCR em tempo real

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar os impactos da fratura hidráulica nos córregos próximos, analisando suas comunidades microbianas de água e sedimentos.

Avaliando o impacto da fratura hidráulica nos córregos usando assinaturas moleculares microbianas

O protocolo detecta os principais genes do ciclo de metano nas zonas úmidas costeiras do sul do Texas e visualiza sua distribuição espacial para melhorar a compreensão da regulação do metano e seus impactos ambientais nesses ecossistemas dinâmicos.

Visualizando a dinâmica microbiana do ciclo de metano em zonas úmidas costeiras

Aprenda transcriptômica ambiental para análise de expressão gênica em comunidades microbianas marinhas. Este método computacional permite estudar a atividade funcional de ecossistemas oceânicos.

Analisando Expressão Gênica de comunidades microbianas Marinha usando transcriptômica Ambiental

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