Name: Homing das células hematopoiéticas da medula óssea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprenda um protocolo para estudar o homing de células hematopoiéticas na medula óssea usando marcação com corante e rastreamento em animais recipientes. Este método permite comparar a eficiência de homing entre diferentes linhagens.

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Este protocolo foi testado e otimizado no laboratório do Dr. David Scadden. Financiamento é fornecido pelo Dana Farber Cancer Institute / Massachusetts General Hospital de Clínicas de Hematologia e Oncologia do Programa Fellowship.

<ol><li> Começamos a experiência homing, extraindo células para serem usadas no experimento. Para esta experiência atual que estamos interessados ​​em descobrir se o homing de medula óssea para os nichos nos ossos longos de animais destinatário é diferente para as células extraídas da medula óssea de animais WT, como C57BL/6J (WT) e aqueles que são transgênicos nocautes para o receptor de Lysophosphatidic 1 (LPAR1) (KO). </li><li> Antes de iniciar o experimento, iremos recolher os materiais que precisamos para este experimento. Em nosso laboratório todas as dissecções do mouse são realizadas em um fluxo laminar de cultura de tecidos, especialmente se as células vão ser transplantados em um animal destinatário, em vez de serem utilizadas para a análise ex-vivo. Começamos colocando uma folha azul dentro do capô. Outros objetos necessários incluem um par de fórceps e uma tesoura afiada que foram autoclavados, um bisturi estéril e descartável cotonetes e álcool. Vamos precisar de PBS modificado e uma placa de 6 estéril bem, um morteiro, azul, 50cc pilão cobertas tubo cônico e um filtro 70uM descartáveis. </li><li> Começamos por tomar um WT e um rato KO. </li><li> Estes ratos são sacrificados por inalação de CO 2 e em seguida mergulhado em 70% isopropranolol por 5 segundos. Este passo impede a contaminação das células de interesse com pele de rato e em nossas mãos não levou a qualquer compromisso no rendimento de células ou resultados experimentais. </li><li> Os ratos são, então, dissecado por sua vez, usando um par de pinças e tesouras afiadas. Nós geralmente começam com o mouse WT como uma questão de rotina. Um snip pequeno é feito na pele ventral do rato que cobre o abdômen e, em seguida, a pele é esticada usando as mãos. A pele sai nos membros posteriores com facilidade. O fêmur ea tíbia são, então, extraído tomando cuidado para não desalojar a cabeça do fêmur como este contém uma grande quantidade de medula óssea. Os membros superiores são destacados de torso do animal pela simples aplicação de tração para eles, mantendo o tronco imóvel. Isso remove os membros superiores como uma peça. Os úmeros são então extraídos os membros superiores. </li><li> Os ossos retirados são colocados em PBS modificado que foi adicionado a 6 pratos bem. PBS modificado é feita pela adição de 2 ml de calor soro fetal bovino inativado e 2 cc de EDTA 0,5 M PH8. Esta solução é então filtrada através de um filtro de 0,45 uM Nalgene e pode ser armazenado a 4 graus Celsius por pelo menos um mês. </li><li> É essencial para rotular os poços da placa, a fim de ser capaz de identificar WT e KO ossos corretamente. </li><li> As carcaças mouse são removidos e eliminados off. </li><li> A nova planilha é colocado no capô e os ossos são limpos usando um bisturi descartáveis. </li><li> Os ossos limpos são colocados um rato em um momento no almofariz. Dois ml de PBS modificado é adicionado à argamassa e os ossos são esmagados utilizando um pilão. É importante primeiro fragmento dos ossos com 10 a frente e para trás dos movimentos da mão e, em seguida, pulverize-as com movimentos rotatórios circular. Eu costumo fazer 50 no sentido horário, então 50 movimentos anti-horário e assim por diante até que o material deixado na argamassa é de cor branca e do PBS modificado adicionado ao material permanece branco ou transparente. </li><li> Depois de cada conjunto de 50 movimentos circulares esmagamento, nós transferimos o líquido da argamassa para a 70 uM filtro colocado no topo de um tubo de 50 ml. Não se esqueça de adicionar 2 ml de PBS para a argamassa depois de cada transferência ao filtro. Você não quer tentar pulverizar ossos secos ou deixe-os secar por qualquer período de tempo que isso levará a apoptose de células. </li><li> Uma vez que o material a argamassa torna-se branco, o material do filtro é transferido para a argamassa eo esmagamento é novamente executada. Isso garante que as células do filtro não são desperdiçados. Normalmente demora um ou dois conjuntos de circular movimentos rotatórios para novamente fazer o material na argamassa na cor branca no momento em que a extração de células está completa. </li><li> A solução no tubo cônico agora é centrifugado (lembre-se de manter as células do WT e mouse KO separado. Daí você terá dois tubos diferentes (uma com células WT, o outro com células KO). Centrifugar a 1200 rpm por 10 minutos. </li><li> Aspirar fora do sobrenadante usando pipetas aspirador separado para cada tubo. Adicione 2 cc de tampão de lise ACK para cada pellet. Este tampão de lise deve ser estéril. Incubar no gelo por 5 minutos. </li><li> Adicionar 8 ml de PBS modificado a cada tubo. Levar 10 ul de cada tubo e pipetar em dois poços separados em uma placa de 96 poços. Colocar os tubos na centrífuga e girá-los a 1200 rpm por 10 minutos. </li><li> Enquanto os tubos estão girando, adicionar 30 ul de tryphan corante azul e 60 ul de PBS modificado a cada poço da placa de 96 poços que transporta as células de interesse. </li><li> Adicionar 10 ul da mistura (por favor, misture bem por pipetagem cima e para baixo) para um hemocitômetro e contar as células nas quatro praças exterior. </li><li> A contagem de células em cada amostra por ml é o número de células contadas, assim, dividido por 4 e multiplied por 100 000. </li><li> Uma vez que a centrifugação for concluída, remova os tubos da centrífuga e ressuspender as células em PBS sem cálcio, magnésio ou glutamina L a uma concentração de 20 milhões de células por ml. Você provavelmente vai ter cerca de 5 ml de volume para o WT e 5 ml de volume para o animal KO. A partir desse passo, vamos estar usando PBS, PBS não modificados para o protocolo. </li><li> A cada tubo adicionar DII, um corante de coloração de células, para alcançar uma concentração final de 5um. Vortex imediatamente por 10 segundos. Incubar a 37 graus por 10 minutos e evitar a exposição à luz. </li><li> Encher os tubos com PBS e girar por 10 minutos a 1200 rpm. </li><li> Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em PBS a 40 milhões de células por ml. </li><li> Carga 500 ul em 1 cc seringas com agulha 27G (5 seringas para o mouse WT e 5 seringas para os camundongos KO). Pode ser prudente para preparar 6 seringas para cada coorte. Ter um extra pode ajudar como injeções cauda veia que vamos fazer a seguir pode ser complicado. </li><li> Cubra com papel alumínio as seringas, a fim de manter a DII se desintegre. </li><li> Injetar 500 ul da mistura de células em cada animal destinatário; (5 para cada coorte). </li><li> Estes animais precisam ser irradiados com 9 Gy de irradiação 4-24 horas antes da injeção. </li><li> 48 horas após a injeção, a medula óssea a partir da colheita de membros posteriores de cada animal destinatário. </li><li> Processo como descrito acima para os doadores. Ressuspender as células de cada animal em 1 cc de PBS. Obter uma contagem de células utilizando um hemocitômetro. </li><li> Leia no citômetro de fluxo LSR II da BD ou um instrumento equivalente. O resultado pode ser expressa como a percentagem ou número absoluto de células na medula óssea, que são analisados ​​DII positivo. </li></ol>

<ol><li>Adams, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+engraftment+at+the+endosteal+niche+is+specified+by+the+calcium-sensing+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor.</a> Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).</li>
<li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Chemokines in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).</li>
</ol>

Homing é o processo pelo qual células da medula óssea, incluindo as células-tronco, as células progenitoras e células diferenciadas, o seu caminho para a medula óssea depois de ser injetado na corrente sanguínea ou na cavidade da medula óssea de camundongos. Como é óbvio a partir da definição, um cientista pode optar por estudar o homing das células-tronco hematopoiéticas, células progenitoras ou células diferenciadas identificados por imunofenotipagem e isoladas por separação de células. Normalmente os cientistas injet...

<table><tbody><tr><td>DPBS (Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco&amp;rsquo;s)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Bezerro Fetal Esteril</td><td>Valley Biomedical, Inc.</td><td>BS3033</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M (pH 8,0)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BM-150</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Azul de Tripan</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tampão Lise ACK</td><td>Lonza Inc.</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Isopropranolol U.S.P.</td><td>Denison Pharmaceuticals, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução corante celular Vybrant DiD</td><td>Invitrogen</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Solução corante celular Vybrant DiI</td><td>Invitrogen</td><td>V22885</td><td></td></tr></tbody></table>

homing das células hematopoiéticas da medula óssea

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing é o fenômeno pelo qual transplantadas células hematopoiéticas são capazes de viajar de e para enxertar ou estabelecer residência na medula óssea. Chemomkines vários e receptores estão envolvidos no homing das células-tronco hematopoiéticas. [1, 2] Este documento descreve o protocolo clássico homing utilizados em estudos de células-tronco hematopoiéticas. Em geral, isso envolve isolar a população de células cuja homing precisa ser investigada, manchando esta população com um corante de juros e injetar essas células na corrente sanguínea de um animal destinatário. O animal é então destinatário sacrificados em um tempo pré-determinado após a injeção e da medula óssea avaliados para a percentagem ou número absoluto de células que são positivos para a tintura de interesse. Em um dos esquemas mais comuns experimental, a eficiência homing das células hematopoiéticas de dois animais geneticamente distintos (um animal tipo selvagem e fora knock-correspondente) é comparada. Este artigo descreve o protocolo de células hematopoiéticas homing no quadro de como o experimento.

Este artigo descreve um protocolo usado para estudar o homing das células hematopoiéticas para seus nichos na medula óssea.

Homing das células hematopoiéticas da medula óssea

O homing é o fenômeno pelo qual células hematopoiéticas transplantadas são capazes de migrar e realizar o enxerto ou estabelecer residência na medula óssea. Diversos...

Homing é o fenômeno em que células hematopoiéticas transplantadas encontram seu caminho até a medula óssea do receptor. Este artigo descreve um protocolo para estudar o homing de células hematopoiéticas para áreas específicas na medula óssea. Ao isolar a população celular de interesse, corar essa população com um corante e injetá-la na corrente sanguínea de um animal receptor.O percentual de células positivas para o corante no animal é então determinado após um período de tempo. Com este método, pode-se comparar a eficiência de homing dessas células provenientes de dois animais geneticamente distintos. Olá, meu nome é RHI Reen Yusef, e sou pesquisadora pós-doutoranda no laboratório do Dr. David Skadden no Centro de Medicina Regenerativa do Hospital Geral de Massachusetts e no Instituto de Células-Tronco de Harvard.Hoje vamos mostrar um procedimento para estudar a homing de células-tronco hematopoiéticas na medula óssea, onde normalmente residem. Utilizamos este protocolo em nosso laboratório para estudar as diferenças entre a homing de células-tronco hematopoiéticas provenientes de diversos camundongos geneticamente modificados. Então, vamos começar.Para iniciar o experimento de ho

homing-of-hematopoietic-cells-to-the-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

Os monócitos são os principais reguladores da imunidade inata e desempenham um papel crítico na renovação do sistema fagocítico mononuclear periférico e em caso de inflamação. Este manuscrito descreve o procedimento de imagem em tempo real da medula óssea da calvária de camundongos para estudar o mecanismo de mobilização de monócitos.

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

É apresentada uma estratégia para analisar quantitativamente os dados histológicos na medula óssea. A microscopia confocal de células marcadas com fluorescência em seções de tecido resulta em imagens bidimensionais, que são analisadas automaticamente. As análises de co-localização de diferentes tipos de células são comparadas com dados de imagens simuladas, fornecendo informações quantitativas sobre as interações celulares.

Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas

Microscopia de fluorescência intravital (IVFM) da calvária é aplicada em combinação com modelos de animais geneticamente para estudar o homing e enxertia das células hematopoiéticas em nichos de medula óssea (BM).

Combinando a microscopia Intravital fluorescente (IVFM) com modelos genéticos para estudar a dinâmica de enxertia das células hematopoiéticas para nichos de medula óssea

É apresentado um método para criar e imagem viva diferentes meninos de medula óssea humanizados em camundongos. Com base no nicho de suporte criado por células mesenquimais humanas, a adição de células endoteliais humanas induz a formação de vasos humanos, enquanto que a adição de rhBMP-2 induz a formação de tecido ósseo maduro quimérico humano-rato.

Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

Aqui, descrevemos um protocolo simples para o isolamento e coloração de células murinas da medula óssea para fenótipo de células-tronco hemopoéticas e progenitoras, juntamente com células-tronco endoteliais e mesenquimais de nicho de suporte. Um método para enriquecer células localizadas em áreas endosteal e medula óssea central também é incluído.

Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal

Aqui, descrevemos um sistema microfisiológico padronizado e fácil de implementar que reflete a complexidade da estrutura in vivo da medula óssea humana, fornecendo um modelo pertinente para estudar finamente uma ampla gama de eventos normais e patológicos.

Um modelo 3D de medula óssea humana para investigar a dinâmica e as interações entre células residentes em contextos fisiológicos ou tumorais

Nós identificamos a placenta como um órgão hematopoiético importante durante o desenvolvimento. Descobrimos que as células-tronco hematopoéticas (HSCs) são gerados e se expandiu na placenta em única nichos microambientais. Aqui, descrevemos as técnicas experimentais necessárias para o isolamento e visualização de HSCs na placenta mouse.

Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Aprenda um protocolo para estudar o homing de células hematopoiéticas na medula óssea usando marcação com corante e rastreamento em animais recipientes. Este método permite comparar a eficiência de homing entre diferentes linhagens.

Homing das células hematopoiéticas da medula óssea

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