Name: Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Aprenda microinjeção de oócitos Xenopus laevis para estudar transporte nucleocitoplasmático usando microscopia eletrônica de cortes finos. Este método permite visualizar substratos importados no núcleo celular.

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Agradecemos a David Theilmann (Pacific Agri-Food Research Centre, Summerland, British Columbia) para fornecer o baculovírus AcMNPV e para a discussão útil. Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Canadense para a Inovação (CFI), o Canadian Institutes of Health Research (CIHR), a Fundação Michael Smith para Pesquisa em Saúde (MSFHR), e as Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia Council of Canada (NSERC) .

Parte 1: Preparação de ovócitos para Xenopus microinjeção <ol><li> Coloque um pedaço pequeno (cerca de 2 cm) de Xenopus ovário laevis em um tubo de 50 ml cônico contendo 20 ml de colagenase solução (5 mg / ml de colagenase em cálcio livre modificado Barth salina: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Colagenase é usado para remover as células do folículo que cercam os oócitos. </li><li> Colocar o tubo em uma plataforma shaker e rock-a gentilmente (a 100 RPM) por uma hora. Esse tempo varia com diferentes lotes de colagenase. Assim, após uma hora, dê uma pequena amostra de oócitos e examiná-las sob um microscópio de dissecação. Adequadamente de-folliculated oócitos devem ser bem separados um do outro, e isso deve ser fácil de inserir uma agulha de vidro no citoplasma do ovócito. Se os oócitos não são suficientemente de-folliculated, eles são deixados na solução de colagenase e verificados novamente a cada cinco minutos. </li><li> Lavar os oócitos três vezes com solução salina modificada Barth (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 0,41 mM CaCl 2, 10 Hepes mM, pH 7,5), e transferi-los para um de 100 mm de diâmetro prato de Petri contendo MBS mais 1% de penicilina / estreptomicina. Os ovócitos são agora pronto para ser microinjeção. Se microinjeção será realizada em outro dia, armazenar os ovócitos a 4 ° C por até uma semana. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, selecione oócitos estágio maduro VI para microinjeção. Estes oócitos são grandes, com bom contraste entre o hemisfério negros de origem animal e do hemisfério cremosa de cor vegetal. </li><li> Transferência dos ovócitos maduros VI estágio em uma microplaca (Nunc, 10 mL de volume bem). Isto deve ser feito com cuidado, usando uma pipeta de 200 mL com uma ponteira que foi cortado no final para permitir sucção ininterrupta dos ovócitos. </li></ol> Parte 2: microinjeção de oócitos Xenopus <ol><li> Prepare o substrato de importação a microinjeção, adicionando uma pequena quantidade de 1% azul de bromofenol, para ajudar na visualização de microinjeção. Por exemplo, podemos adicionar 1 ml de azul de bromofenol para 10 ml de substrato. </li><li> Coloque uma pequena tira de Parafilm em um prato de 100 mm de diâmetro Petri, e dispensar uma queda de 5 mL da solução a ser injetado na faixa Parafilm. </li><li> Preencher uma agulha de injeção previamente calibrado (obtida por puxar um 6,6 mL micropipeta Drummond com o Inject + Extrator Matic) com a solução a ser injetada. Para isso, o microinjetor está definido o modo de aspiração. Para calibrar a agulha de injeção fazer marcas ponto na agulha a cada 0,5 mm, que correspondem a um volume de 50 nl. </li><li> Para injeção citoplasmática, insira a ponta da agulha em um óvulo no hemisfério vegetal, muito perto do hemisfério animal, em um ângulo de aproximadamente 45 graus. Ativar a configuração microinjetor para microinject e microinject cada ovócito com 50 nl de substrato de importação. As marcas de ponto na agulha são usados ​​para monitorar a quantidade de substrato que foi injetado. </li><li> Transferir os oócitos injetados para uma pequena placa de Petri (35 mm de diâmetro) cheio de MBS, e incubar à temperatura ambiente durante o período de tempo desejado (pontos no tempo são escolhidos de forma a permitir a observação do substrato importação associado com NPCs, o que ocorre entre 10 e 30 minutos para as proteínas e vírus que são ativamente transportados para o NPC, desta vez também depende do local da injeção e do tamanho da proteína / vírus). </li><li> Quando a incubação é completa, a transferência de oócitos para um frasco de vidro de 4 ml contendo glutaraldeído 2% em MBS, e corrigir durante a noite a 4 ° C. </li></ol> Parte 3: Dissecção de oócitos Xenopus <ol><li> No dia seguinte, lave os oócitos 3 vezes com MBS. </li><li> Transferência de oócitos a uma placa de Petri pequena preenchida com tampão de pouco sal (LSB: 1 mM KCl, 0,5 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,5). Usando um microscópio de dissecação e dissecando uma pinça, remova o pólo vegetal de cada ovócito. É útil para estabilizar o ovócito sendo dissecado com um par de pinças, enquanto o outro par é usado como tesouras para remover o pólo vegetal. Neste ponto, é possível avaliar o sucesso da microinjeção pela presença de uma coloração azul no citosol. O protocolo é mantido apenas para os oócitos que receberam microinjeções com sucesso. Além disso, se as amostras devem estar preparados para EM, este passo dissecção torna muito mais fácil encontrar o núcleo quando desbastar e cortar as amostras. </li><li> Corrigir os oócitos dissecados novamente com glutaraldeído 2% em LSB durante uma hora a temperatura ambiente. </li><li> Após a fixação, lave os oócitos dissecados três vezes com LSB. </li></ol> Parte 4: Preparação de Oócitos Injected para Incorporação e Thin-Seccionamento EM <ol><li> Transferir os oócitos dissecados para um slide depressão. Aspirar o máximo de líquido como posvel, e então rapidamente (para que não sequem) abrangem os oócitos dissecados com 2% de baixo ponto de fusão agarose. Enquanto a agarose ainda está mole, use uma ponteira para separar os oócitos uns dos outros, e para garantir que cada ovócito está virada para cima ou para baixo (não para os lados). </li><li> Permitir que a agarose para solidificar por aproximadamente 10 minutos. Uma vez que a agarose se solidifica, use uma lâmina de barbear para cortar a agarose em pequenos pedaços, cada um contendo um óvulo dissecados. </li><li> Coloque os oócitos agarose-incorporado em um frasco de vidro de 4 ml, e pós-corrigi-los com 1% OsO 4 em LSB durante uma hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar a amostra três vezes em LSB. Se necessário, guardar a amostra a 4 ° C durante a noite e continuar o protocolo no dia seguinte. </li><li> Seqüencialmente desidratar as amostras em uma série crescente de álcool (50, 70, e etanol 90% por 20 min cada). Isso é seguido por duas mudanças em etanol 100% por 15 min cada. Finalmente desidratar as amostras com acetona 100% por 15 min. </li><li> Infiltrar amostras com uma mistura 1:1 de Epon (Fluka) e acetona por uma hora, seguido de infiltração com uma mistura 2:1 de Epon e acetona por duas horas, e finalmente em Epon puro por pelo menos seis horas. </li><li> Colocar as amostras em moldes de incorporação flat cheio de fresco e puro Epon. Os ovócitos são orientados de tal forma que o lado do núcleo mais próximo do local da injeção - neste caso o lado dos oócitos que tem sido dissecado - será seccionada em primeiro lugar. Este passo otimiza a oportunidade de visualizar de importação do substrato escolhido. </li><li> Finalmente, a Epon polimerizar por dois dias a 60 ° C. </li><li> Para visualizar as amostras, os blocos são cortados e seccionados usando um ultramicrótomo. As seções são transferidos para as redes EM, coradas utilizando o procedimento padrão, e visualizados com um microscópio eletrônico de transmissão. Não vamos mostrar essa parte do protocolo, pois é procedimento padrão EM. </li></ol> Parte 5: Resultados Representante: Se o protocolo tem sido bem sucedida, então o envelope nuclear (NE) e NPCs deve ser claramente visível em micrografias EM. Dependendo do substrato e injetada a quantidade de tempo entre a injeção e fixação, o substrato deve estar visível na face citoplasmática da NPC, no NPC, ou em face nuclear do NPC. A Figura 1 mostra um NE seção transversal com citoplasma adjacente (c) e núcleo (n) a partir de um ovócito Xenopus que foi injetado com capsídeos do baculovírus AcMNPV, incubadas a 4 ° C por quatro horas, e processadas para a incorporação e seção fina EM, como descrito. Setas apontam para NPCs. A docking capsídeo na face citoplasmática de um NPC é indicado por uma seta branca. Em contraste, a Figura 2 mostra uma seção transversal NE com citoplasma adjacente (c) e núcleo (n) a partir de um ovócito Xenopus que foi injetado com o vírus da parvovirose Minuto de Ratos (MVM), incubadas à temperatura ambiente durante quatro horas, e processadas para a incorporação e seção fina EM como descrito. Usando esta técnica, nós descobrimos que induz MVM interrupções da NE (Cohen e Pante, 2005). Parênteses indicam quebra no NE. Setas apontam para NPCs. Capsídeos MVM putativos associados à NE são indicados por setas brancas. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="Figura 1" width="600" height="459" /> Figura 1: Micrografia eletrônica de uma secção transversal-NE com citoplasma adjacente (c) e núcleo (n) a partir de um ovócito Xenopus que foi injetado com capsídeos do baculovírus Ac MNPV, incubadas a 4 ° C por quatro horas, e processados ​​para incorporação e seção fina EM como descrito. Setas apontam para NPCs. Capsídeos são indicados por setas brancas. Barra de escala: 100 nm. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="Figura 2" width="600" height="264" /> Figura 2: Micrografia eletrônica de uma secção transversal-NE com citoplasma adjacente (c) e núcleo (n) a partir de um ovócito Xenopus que foi injetado com o vírus da parvovirose Minuto de Ratos (MVM), incubadas à temperatura ambiente durante quatro horas, e processadas para a incorporação e seção fina EM como descrito. Setas apontam para NPCs. Parênteses indicam quebra no NE. Capsídeos MVM putativos associados à NE são indicados por setas brancas. Barra de escala: 100 nm.

<ol><li>Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li>
<li>Panté, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li>
<li>Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li>
<li>Cohen, S., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+Envelope%3A+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li>
<li>Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li>
</ol>

Microinjeção de oócitos Xenopus combinado com thin-corte EM é uma ferramenta altamente eficaz para estudar o transporte nucleocytoplasmic. Este sistema tem sido usado para mapear etapas distintas de importação através do NPC, por exemplo, a interação de um substrato de importação nuclear com componentes estruturais do NPC, tais como os filamentos citoplasmáticos e cesta nuclear (revisado por Pante, 2006). Também tem sido usado para estudar a importação nuclear nuclear de replicar-vírus (Pante e Kann, 2002; Rabe...

microinjeção de oócitos xenopus laevis

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjeção de oócitos Xenopus laevis seguido por thin-corte de microscopia eletrônica (EM) é um excelente sistema para estudar o transporte nucleocytoplasmic. Por causa de seu grande núcleo e alta densidade dos complexos de poro nuclear (NPCs), o transporte nuclear pode ser facilmente visualizado no oócito Xenopus. Visão muito sobre os mecanismos de importação e exportação nuclear foi adquirida através do uso deste sistema (revisado por Pante, 2006). Além disso, temos utilizado microinjeção de oócitos Xenopus para dissecar as vias de importação nuclear de vários vírus que se replicam no núcleo host. Aqui demonstramos a microinjeção citoplasmática de oócitos Xenopus com um substrato importação nuclear. Mostramos também a preparação dos oócitos injetados para visualização por thin-corte EM, incluindo dissecção, desidratação e incorporação dos oócitos em uma resina epóxi incorporação. Finalmente, fornecemos resultados representativos para oócitos que foram microinjeções do capsídeo do baculovírus nucleopoliedrovirus Autographa californica (AcMNPV) ou o vírus da parvovirose Minuto de Ratos (MVM), e discutir possíveis aplicações da técnica.

Aqui demonstramos microinjeção citoplasmática de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos com um substrato de importação nuclear, bem como a preparação dos oócitos injetados para visualização por thin-corte de microscopia eletrônica.

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

A microinjeção de oócitos de Xenopus laevis seguida de microscopia eletrônica (ME) com cortes finos é um sistema excelente para estudar a nucleocitoplasmática...

A microinjeção de opus lavu citos, seguida de microscopia eletrônica de seccionamento fino, é um excelente sistema para estudar o transporte nucleocitoplasmático. Neste experimento, os ovócitos são desfolliculados com colagenase e os citos estágio seis são selecionados e colocados em uma placa de múltiplos poços. Em seguida, os citos são microinjetados com um substrato de importação nuclear após incubação dos citos à temperatura ambiente para permitir que o substrato entre no núcleo.Os citos são fixados e dissecados. Os citos dissecados são embutidos em agarose de baixo ponto de fusão, fixados novamente com tetróxido de ósmio, desidratados e embutidos em resina epóxi. As amostras embutidas em resina epóxi são cortadas com um ultramicrótomo e os cortes são colocados em uma grade de espécime de cobre.Após a coloração, as seções são visualizadas em um microscópio eletrônico de transmissão. Olá, sou Sarah Cohen do laboratório da Dra. Nellie Pane do Departamento de Zoologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Sou Shelly Ow, também do laboratório Panta.Hoje vamos mostrar um procedimento para microinjeção de células Zenap Lavis. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a importação nuclear de cargas, como vírus. Então, vamos começar.Para iniciar o experimento, coloque um pequeno pedaço de cerca de dois centímetros de ovário Zenap Lavis em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 20 mililitros de solução de colagenase. A colagenase remove as células foliculares que envolvem os cítos; em seguida, coloque o tubo na plataforma agitadora e agite suavemente a 100 RPM por 30 minutos. Esse tempo varia conforme diferentes lotes de colagenase.Após uma hora, colete uma pequena amostra dos citos e examine-os ao microscópio estereoscópico. Células adequadamente desfolhadas devem estar bem separadas umas das outras. Insira uma agulha de vidro em um cito para verificar se ela penetra facilmente.Se os cítos não estiverem suficientemente desfolhados, deixe-os na solução de colagenase e verifique novamente a cada cinco minutos. Uma vez que os cítos estejam suficientemente desregulados, lave-os três vezes com salina de bar modificada e transfira-os para uma placa de Petri de 100 milímetros contendo MBS mais 1% penicilina-estreptomicina. Utilizando um microscópio estereoscópico, selecione cítos maduros no estágio seis para microinjeção.Essas células são grandes, com bom contraste entre o hemisfério animal preto e o hemisfério vegetal de cor creme. Transfira as células maduras no estágio seis para uma placa de múltiplas cavidades. Para isso, utilize uma pipeta de 200 microlitros com uma ponteira cuja extremidade foi cortada para permitir a sucção não perturbadora dos ovócitos e transfira cuidadosamente os ovócitos para a placa de múltiplas cavidades.Utilizamos uma placa sem poço micro com volume de poço de 10 microlitros; os locais EO agora estão prontos para serem microinjetados. Prepare o substrato de importação a ser microinjetado adicionando um microlitro de azul de bromofenol a 1% em 10 microlitros de substrato. O corante azul de bromofenol permite a visualização da microinjeção.Em seguida, coloque uma pequena tira de paraforma em uma placa de Petri de 100 milímetros de diâmetro e dispense uma gota de cinco microlitros da solução de injeção sobre a tira de paraforma. Depois, obtenha uma agulha de injeção puxando uma micropipeta Drummond de 6,6 microlitros com o injetor plus Matt Puller. Calibre a agulha de injeção fazendo marcas pontilhadas na agulha a cada 0,5 milímetros, o que corresponde a um volume de 50 nanolitros. Configure o microinjetor no modo de aspiração e preencha a agulha com a solução de injeção para injeção citoplasmática.Insira a ponta da agulha em um cito no hemisfério vegetal, bem próximo ao hemisfério animal, em um ângulo aproximado de 45 graus. Em seguida, gire o seletor do microinjetor para microinjeção e microinjete cada cito com 50 nanolitros de substrato de importação. Observe as marcas pontilhadas na agulha para monitorar a quantidade de substrato injetada ao final das injeções.Transfira os cítos para uma placa de Petri de 35 milímetros preenchida com MBS. Incube os cítos à temperatura ambiente pelo tempo desejado. Escolha pontos de tempo que permitam a observação do substrato de importação associado aos complexos pobres nucleares ou NPCs.Normalmente utilizamos pontos temporais entre 10 e 30 minutos para proteínas e vírus que são transportados ativamente em direção ao NPC. Esses pontos temporais também dependem do local da injeção e do tamanho da proteína ou do vírus. Quando a incubação estiver concluída, transfira os cítos para um frasco de vidro de quatro mililitros contendo 2% de glutaraldeído em MBS e fixe durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave os cítos três vezes com MBS; agora estamos prontos para dissecar os cítos.Transfira os ocitos para uma pequena placa de Petri contendo tampão de baixa salinidade. Usando um microscópio estereoscópico e pinças de dissecação, remova o polo vegetal de cada ocito. É útil estabilizar o ocito com um par de pinças enquanto o outro par é usado como uma tesoura para remover o polo vegetal; esta etapa de dissecação facilita muito a localização do núcleo durante o corte e o preparo das amostras para microscopia eletrônica.Neste ponto, a presença de uma coloração azulada no citosol indica uma microinjeção bem-sucedida; descarte os citos que não foram microinjetados com sucesso. Em seguida, fixe novamente os citos dissecados com glutaraldeído 2% em LSB por uma hora à temperatura ambiente. Após a fixação, lave os citos dissecados três vezes com LSB. Uma vez que os citos tenham sido lavados, estamos prontos para preparar os ovócitos injetados para inclusão e seccionamento fino em.Transfira os ovócitos dissecados para uma lâmina de depressão, aspire o máximo possível do líquido e, em seguida, atue rapidamente para que não sequem. Cubra os ovócitos dissecados com agarose de baixo ponto de fusão a 2%, enquanto a agarose ainda estiver macia. Use a ponteira de uma pipeta para separar os ovócitos uns dos outros e garantir que cada ovócito esteja voltado para cima ou para baixo, mas nunca de lado.Deixe o ágar solidificar por cerca de 10 minutos. Uma vez que o ágar tenha solidificado, use uma lâmina de barbear para cortar os ágares em pequenos pedaços, cada um contendo um citólio dissecado. Em seguida, coloque os ágares com citólios embutidos em um frasco de vidro de quatro mililitros e, utilizando um agitador rotatório, fixe-os com tetróxido de ósmio 1% em LSB por uma hora à temperatura ambiente.Após fixar por uma hora, lave a amostra três vezes em LSB, se necessário. Armazene a amostra a quatro graus Celsius durante a noite e continue o protocolo no dia seguinte. Desidrate sequencialmente as amostras em etanol 50%, 70% e 90% por 20 minutos cada, depois desidrate duas vezes em etanol 100% por 15 minutos cada.Por fim, desidrate as amostras com acetona a 100% durante 15 minutos após a conclusão das etapas de desidratação. Infiltra as amostras com uma mistura na proporção de um para um de epon, flua e acetona por uma hora, seguida de infiltração com uma mistura na proporção de dois para um de epon e acetona por duas horas, e finalmente em epon puro por pelo menos seis horas. Quando a etapa final de infiltração estiver concluída, coloque as amostras em moldes planos para inclusão preenchidos com epon fresco e puro.Oriente as células de modo que o lado do núcleo mais próximo ao local de injeção seja seccionado primeiro. Nesse caso, será seccionado o lado das células que foi dissecado. Primeiramente, esta etapa otimiza a probabilidade de visualizar a importação do substrato escolhido.Uma vez que as células estejam adequadamente orientadas, polimerize o epon por dois dias a 60 graus Celsius. Após a etapa de polimerização, obtenha seções com espessura de 50 nanômetros das amostras embutidas em epóxi utilizando um ultramicrótomo. Recolha as seções em uma grade de cobre para microscopia eletrônica de transmissão, cora as amostras e visualize-as em um microscópio eletrônico de transmissão.Se o protocolo tiver sido bem-sucedido, o envelope nuclear e os NPCs devem ser claramente visíveis em micrografias de EM. Dependendo do substrato injetado e do tempo entre a injeção e a fixação, o substrato deve ser visível na face citoplasmática do NPC, no interior do NPC ou na face nuclear do NPC. Este resultado representativo mostra uma seção transversal do envelope nuclear com citoplasma e núcleo adjacentes de um zigoto zenap injetado com capsídeos do vírus vao.As setas A-C-M-N-P-V apontam para CPCs e uma cápside ancorada na face citoplasmática de um CPC é indicada por uma seta branca. Em contraste, esta figura mostra uma seção transversal da membrana nuclear com citoplasma e núcleo adjacentes de um oócito zenap que foi injetado com o parvovírus de camundongos. Utilizando esta técnica, descobrimos que o MVM induz interrupções na membrana nuclear.Colchetes indicam interrupções no envelope nuclear. Setas apontam para NPCs e capsídeos putativos do MVM associados ao envelope nuclear são indicados por setas brancas. Acabamos de mostrar como microinjetar e dissecar células xap levu.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que diferentes lotes de colagenase variam. Portanto, teste sua colagenase cuidadosamente para determinar o tempo ideal para a desfoliação. Além disso, após a etapa de desfoliação e lavagem com MBS, os citos podem ser armazenados a quatro graus Celsius por até uma semana antes da microinjeção.Por fim, mantenha sempre seu glúteo completamente submerso em gelo e nunca permita que o osis seque. Eles devem permanecer totalmente submersos durante todas as etapas de desidratação e infiltração. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

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