Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

A microinjeção de Opus Lavu Cytes, seguida de microscopia eletrônica de corte fino, é um excelente sistema para o estudo do transporte nucleocitoplasmático. Neste experimento, os oócitos são desfolhados com colagenase e os citos do estágio seis são selecionados e colocados em uma placa de vários poços. Os citos são então microinjetados com um substrato de importação nuclear após a incubação dos citos à temperatura ambiente para permitir que o substrato entre no núcleo.

Os citos são fixados e dissecados. Os citos dissecados são embebidos em aros de baixo ponto de fusão, fixados novamente com tetróxido de ósmio, desidratados e embebidos em resina epóxi. As amostras embebidas em epóxi são seccionadas com um ultramicrótomo e as seções são colocadas em uma grade de amostra de cobre.

Após a coloração, as seções são visualizadas sob um microscópio eletrônico de transmissão. Olá, sou Sarah Cohen, do laboratório da Dra. Nellie Pane no Departamento de Zoologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Eu sou Shelly Ow, também do laboratório Panta.

Hoje vamos mostrar-lhe um procedimento para Microinjeção de Zenap Lavis Cytes. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a importação nuclear de cargas, como vírus. Então vamos começar.

Para começar o experimento, coloque um pequeno pedaço de cerca de dois centímetros de ovário Zenap Lavis em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 20 mililitros de solução de colagenase. A colagenase remove as células foliculares que circundam os citos, depois coloca o tubo na plataforma do agitador e lança suavemente a 100 RPM por 30 minutos. Este tempo varia com diferentes lotes de colagenase.

Então, depois de uma hora, pegue uma pequena amostra dos citos e examine-os sob um microscópio de dissecação. Devidamente. Os citos desfolhados devem ser bem separados uns dos outros. Insira uma agulha de vidro em um citador para ver se ela desliza facilmente.

Se os citos não estiverem suficientemente desfolhados, deixe-os na solução de colagenase e verifique novamente a cada cinco minutos. Uma vez que os citos estejam suficientemente desregulados, lave-os três vezes com solução salina modificada e transfira-os para uma placa de Petri de 100 milímetros contendo MBS mais 1% de estreptomicina de penicilina. Usando um microscópio de dissecação, selecione citos maduros do estágio seis para microinjeção.

Esses citos são grandes com bom contraste entre o hemisfério animal preto e o hemisfério vegetal de cor cremosa. Transfira os cytes maduros do estágio seis para um prato de vários poços. Para fazer isso, use uma pipetadora de 200 microlitros com uma ponta de pipeta cortada na extremidade para permitir a sucção ininterrupta dos oócitos e transfira cuidadosamente os oócitos para o poço múltiplo.

Usamos um prato sem micro poço com um volume de 10 microlitros Os locais de EO agora estão prontos para serem microinjetados. Prepare o substrato de importação a ser microinjetado adicionando um microlitro de azul de fenol 1% brom a 10 microlitros de substrato. O corante azul brom fol adiciona a visualização da microinjeção.

Em seguida, coloque uma pequena tira de paraforme em uma placa de Petri de 100 milímetros de diâmetro e dispense uma gota de cinco microlitros da solução injetável na tira de pararam. Em seguida, obtenha uma agulha de injeção puxando uma micropipeta Drummond de 6,6 microlitros com o extrator injetável mais Matt Calibre a agulha de injeção fazendo marcas de pontos na agulha a cada 0,5 milímetros, o que corresponde a um volume de 50 nanolitros. Coloque o microinjetor no modo de aspiração e encha a agulha com solução injetável para injeção citoplasmática.

Insira a ponta da agulha em um cite no hemisfério vegetal, muito próximo ao hemisfério animal em um ângulo de aproximadamente 45 graus. Em seguida, gire a configuração do micro injetor para micro injetar e micro injetar cada cita com 50 nanolitros de substrato de importação. Fique de olho nas marcas de pontos na agulha para monitorar a quantidade de substrato que foi injetada quando as injeções estiverem completas.

Transfira os citos para uma placa de Petri de 35 milímetros cheia de MBS. Incube os citos em temperatura ambiente pelo tempo desejado. Escolha pontos de tempo que permitam a observação do substrato de importação associado a complexos nucleares pobres ou NPCs.

Normalmente, usamos pontos de tempo entre 10 e 30 minutos para proteínas e vírus que são transportados ativamente para o NPC. Esses pontos de tempo também dependem do local da injeção e do tamanho da proteína do vírus. Quando a incubação estiver completa, transfira os citos para um frasco de vidro de quatro mililitros contendo 2% de glutaraldeído em MBS e fixe durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte, lave os citos três vezes com MBS, agora estamos prontos para dissecar os citos.

Transfira os citos para uma pequena placa de Petri cheia de tampão com baixo teor de sal. Usando um microscópio de dissecação e uma pinça de dissecação, remova o poste de vegetais de cada oócito. É útil estabilizar o oócito com um par de pinças enquanto o outro par é usado como uma tesoura para remover o pólo vegetal, esta etapa de dissecção torna muito mais fácil encontrar o núcleo ao aparar e seccionar as amostras para microscopia eletrônica.

Neste ponto, a presença de uma coloração azul no citosol indica uma microinjeção bem-sucedida de descarte de citos que não foram microinjetados com sucesso. Em seguida, fixe os citos dissecados novamente com 2% de glutaraldeído em LSB por uma hora em temperatura ambiente após a fixação, lave os citos dissecados três vezes com LSB. Uma vez que os citos são lavados, estamos prontos para preparar os oócitos injetados para incorporação e seccionamento fino.

Transfira os oócitos dissecados para uma lâmina de depressão, aspire o máximo possível do líquido e, em seguida, aja rapidamente para que não sequem. Cubra os citos dissecados com 2% de baixo ponto de fusão enquanto o aros ainda está macio. Use uma ponta de pipeta para separar os citos uns dos outros e para garantir que cada cite esteja voltado para cima ou para baixo, mas não para os lados.

Deixe os agros solidificarem por cerca de 10 minutos. Assim que o agros solidificar, use uma lâmina de barbear para cortar o aros em pequenos pedaços, cada um contendo um cite dissecado. Em seguida, coloque os citos embebidos em aros em um frasco de vidro de quatro mililitros e, usando um poste misturador rotativo, fixe-os com tetróxido de ósmio a 1% em LSB por uma hora em temperatura ambiente.

Após a fixação por uma hora, lave a amostra três vezes em LSB, se necessário. Armazene a amostra a quatro graus Celsius durante a noite e continue o protocolo no dia seguinte. Desidrate sequencialmente as amostras em etanol a 50%, 70% e 90% por 20 minutos cada, depois desidrate duas vezes em etanol a 100% por 15 minutos cada.

Por fim, desidrate as amostras com 100% de acetona por 15 minutos após a conclusão das etapas de desidratação. Infiltre as amostras com uma mistura um-para-um de epon, flua e acetona por uma hora, seguida de infiltração com uma mistura de dois para um de epon e acetona por duas horas e, finalmente, em epon puro por pelo menos seis horas. Quando a etapa final de infiltração estiver concluída, coloque as amostras em moldes de incorporação planos preenchidos com epon puro e fresco.

Oriente os citos de modo que o lado do núcleo mais próximo do local da injeção seja seccionado. Primeiro. Neste caso, o lado dos citos que foi dissecado será seccionado. Primeiro, esta etapa otimiza a chance de visualizar a importação do substrato escolhido.

Uma vez que os citos estejam devidamente orientados, polimerize o epon por dois dias a 60 graus Celsius. Após a etapa de polimerização, obtenha seções de 50 nanômetros de espessura das amostras embebidas em epóxi usando um ultramicrótomo. Colete as seções em uma grade de amostras de cobre, core as amostras e visualize-as sob um microscópio eletrônico de transmissão.

Se o protocolo for bem-sucedido, o envelope nuclear e os NPCs devem ser claramente visíveis em micrografias. Dependendo do substrato injetado e da quantidade de tempo entre a injeção e a fixação, o substrato deve ser visível na face citoplasmática do NPC no NPC ou na face nuclear do NPC. Este resultado representativo mostra uma seção transversal do envelope nuclear com citoplasma adjacente e núcleo de um cito zenap que foi injetado com capsídeos do vírus vao.

As pontas das setas A-C-M-N-P-V apontam para NPCs e um acoplamento do capsídeo na face citoplasmática de um NPC é indicado por uma seta branca. Em contraste, esta figura mostra uma seção transversal do envelope nuclear com citoplasma e núcleo adjacentes de um oócito zenap que foi injetado com o vírus parvo de camundongos. Usando essa técnica, descobrimos que o MVM induz rupturas do envelope nuclear.

Os colchetes indicam quebras no envelope nuclear. As pontas das setas apontam para NPCs e os capsídeos MVM putativos associados ao envelope nuclear são indicados por setas brancas. Acabamos de mostrar como microinjetar e dissecar citos de xap levu.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar que diferentes lotes de colagenase variam. Portanto, teste sua colagenase cuidadosamente para determinar o momento ideal para a desfolha. Além disso, após a etapa de desfolha e lavagem MBS, os citos podem ser armazenados a quatro graus Celsius por até uma semana antes da microinjeção.

Por fim, sempre mantenha o glúteo todo escondido no gelo e nunca deixe a osis secar. Eles devem estar totalmente submersos durante todas as etapas de desidratação e infiltração. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.