Name: Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish. (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Aprenda a técnica de microinjeção em embriões de zebrafish para sobrexpressão de mRNA e knockdown de genes usando oligonucleotídeos morpholino. Este método robusto permite estudar funções genéticas em biologia do desenvolvimento.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelo NIH e fundação PKD a ZS. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com Yale Recursos Animais Center (YARC) e Animal Care Institucional e Use Committee (IACUC) orientações.

Parte 1: Preparação de micropipetas, e placas de câmara de microinjeção <ol><li> Fabricar micropipetas por aquecimento e puxar os tubos de vidro de borosilicato capilar (Precision Mundial Instruments, Inc., 1B100-4) em um dispositivo extrator micropipeta (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown P-97). Armazenar em uma placa de Petri em cima de pequena quantidade de barro ou fita adesiva. </li><li> Despeje de agarose 1,5% (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) em placas 1x médio E3 moldado com depressões em forma de cunha que servirá como um método fácil para segurar os embriões durante a injeção (conforme descrito em &quot;O Livro dos Zebrafish&quot;) 1. Deixe placas câmara de ágar solidificar antes de usar e armazenar a 4 º C. </li></ol> Parte 2: Preparação do RNA Uma abordagem poderosa para estudos de função do gene é transcrito microinject in vitro RNA tampado em embriões de peixe-zebra. RNA tampado se comporta de forma semelhante ao mRNAs eucarióticos encontrados in vivo devido à presença da analógica CAP. Pesquisadores zebrafish rotineiramente utilizam este método para superexpressão ou misexpress seu gene de interesse. Nesta demonstração, iremos microinject uma transcrição EGFP-marcados e uso ao vivo todo embrião-GFP-expressão como uma leitura visível para uma injeção de sucesso. <ol><li> Realizar uma reação de transcrição in vitro CAP RNA em sua transcrição de interesse. Em nosso laboratório, nós rotineiramente inserir um cDNA de interesse em um vetor + pCS2 e executar uma reação de síntese in vitro de grandes quantidades de RNA capped usando o mMessage mMachine SP6 kit (Ambion, Inc., AM1340). </li><li> Purificar a amostra de RNA, executando-o através do kit Mini RNeasy (Qiagen, Inc., 74104) ou pelo fenol: clorofórmio e precipitação extração de isopropanol. </li><li> Cuidadosamente determinar a concentração de RNA a preparação e armazenar a -80 º C até que esteja pronto para uso. </li><li> No dia da injeção, descongelar a amostra de RNA vórtice, de ânimo leve e spin down brevemente. </li><li> Prepare uma solução de trabalho com água estéril e uma concentração final de 0,025 - 0,050% de vermelho de fenol (Sigma-Aldrich Co., P0290). Vermelho de fenol serve como um marcador visível para a injeção da solução para o embrião. Neste artigo, vamos preparar uma solução de trabalho de 100 mRNA EGFP ng / uL com 0,050% de vermelho de fenol. </li><li> Manter amostra de trabalho sobre o gelo e ações retorno RNA a -80 ° C. </li><li> Prosseguir para a Parte 4, quando prontos para injetar essa amostra. </li></ol> Parte 3: Preparação de morfolino Oligonucleotídeos antisense morfolino são amplamente utilizados para modificar a expressão gênica, bloqueando tradução de uma proteína-alvo ou modificando pré-mRNA splicing 2,3. Morpholinos no zebrafish servir como uma ferramenta poderosa de genética reversa por derrubar a função do gene. Neste artigo, vamos microinject um oligo morfolino voltado para o sítio de iniciação de translação de PKD2 (5&#39;-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 &#39;). Baseado no trabalho previamente estabelecido, esperamos que os embriões injetados para fenotipicamente imitar PKD2 4 peixes mutantes. <ol><li> Rotineiramente ordem 300 nmol de um oligo morfolino projetado especificamente para um gene de interesse a partir de Ferramentas Gene, LLC (Philomath, OR). </li><li> Adicione 100 uL de água estéril para fazer uma solução estoque 3 mM. Solução de alíquotas e armazenar a -20 ° C até que esteja pronto para uso. </li><li> No dia da injeção, aquecer a solução morfolino a 65 ° C por 5 minutos. Pressão legal sobre o gelo imediatamente e girar rapidamente. Esta etapa desnatura qualquer estruturas secundárias na oligo e garante que a solução é completamente solubilizado. </li><li> Prepare uma solução de trabalho, diluindo a solução morfolino em água estéril e uma concentração final de 0,025 - 0,050% de vermelho de fenol. Nesta demonstração, iremos preparar uma solução de trabalho de 0,50 mM PKD2 morfolino com 0,050% de vermelho de fenol. </li><li> Continuar trabalhando solução à temperatura ambiente. </li><li> Prosseguir para a Parte 4, quando prontos para injetar essa amostra .---- </li></ol> Parte 4: Preencher o micropipeta com sua solução de trabalho <ol><li> Corte a extremidade distal de uma micropipeta com uma pinça ou uma lâmina de barbear cirúrgico para criar uma abertura que é apenas visível sob um microscópio de dissecação (Nikon Instruments, Inc., SM2645) com ampliação de 50X. </li><li> Coloque 2 uL de sua solução de trabalho como uma gota em uma lamela. </li><li> Anexar a parte traseira de uma micropipeta para uma seringa de 5 mL equipado com tubos em uma agulha hipodérmica e ligeiramente submergir a ponta distal da micropipeta em sua gota de solução de trabalho. Tome cuidado para não quebrar a ponta da micropipeta. </li><li> Sifão da solução de trabalho através da extremidade distal do micropipeta puxando o êmbolo da seringa. </li></ol> Parte 5: Calibrando o volume de injeção micropipeta <ol><li> Coloque uma gota de óleo mineral (American Bioanalytical, Inc., AB00921-00025) em um micrómetro (Fisher, 12-561-SM1). </li><li> Ligue a alimentação e suprimento de ar para a pressão de pulso micro injector aparelho (World Precision Instruments Inc., PV830). </li><li> Anexar a micropipeta ao titular micropipeta do aparelho injector micro. O injetor de micro é pressão regulada e descargas são ativados pressionando o pedal. </li><li> Sob o microscópio de dissecção, teste o volume de injeção usando o injector micro para colocar uma gota de sua solução de trabalho para o óleo micrômetro. Medir o diâmetro da gota, enquanto flutua como uma esfera em cima do petróleo. </li><li> Ajustar a duração ea pressão de injeção de calibrar cuidadosamente o seu volume de injeção. Este passo ajuda na reprodutibilidade do experimento microinjeção. Nesta demonstração, todas as microinjeções será feito com um diâmetro queda de 0,15 mm (cerca de 1,76 nL em volume). </li><li> Uma vez que seu volume de injeção foi calibrado, utilize o &quot;Hold&quot; botão no injector micro para evitar vazamento e enchimento da micropipeta. </li></ol> Parte 6: Preparando embriões fertilizados zebrafish para microinjeção <ol><li> Zebrafish aleatoriamente mate em primeiras horas de cada manhã. Coletar embriões no estágio 1-célula e colocá-los em 1x médio E3. </li><li> Usando uma pipeta de transferência de 3 mL (Becton Dickinson para laboratórios, 357.524), organizar os embriões ao longo das calhas em forma de cunha na câmara de placas de microinjeção. </li><li> Remova a mídia de modo que os embriões são superficialmente submersos e não inundadas. Este passo ajuda na resolução dos embriões para o fundo dos vales, bem como na penetração do córion pela micropipeta. </li></ol> Parte 7: microinjeção através do córion <ol><li> Manipular os embriões com a micropipeta, para que o citoplasma do embrião estágio 1-célula é visível ao microscópio de dissecação. Tome cuidado para não quebrar a ponta da micropipeta. </li><li> Penetrar no córion e depois a gema com a micropipeta, a fim de injetar o embrião. Nesta demonstração, que será o primeiro microinjecting na gema diretamente abaixo da célula, e permitir o fluxo citoplasmático e difusão para trazer a solução de trabalho na célula. Este fluxo é visível devido ao vermelho de fenol adicionado à solução de trabalho. </li><li> Vamos também demonstrar injecção directa no citoplasma da célula. Microinjeção direta na célula é mais robusto, mas demorada como a orientação adequada do embrião e da técnica de microinjeção é necessária. Como a membrana celular é mais rigoroso que a membrana da gema, muitas vezes é mais rápido para entrar na micropipeta através da gema para alcançar o citoplasma da célula. Orientar o pólo animal para o fundo do poço e trabalhar com as mãos firmes podem ajudar a este método de injeção. </li><li> Após a microinjeção, os embriões lugar em uma placa de Petri com meio de E3 e incube-os em 28,5 ° C para o desenvolvimento normal. </li><li> Mais próximas horas e dias de desenvolvimento embrionário, observe os embriões para o seu fenótipos de interesse. </li></ol> Parte 8: Resultados Representante EGFP superexpressão mRNA: Para verificar o sucesso da microinjeção, vamos monitorar a expressão da GFP em embriões em desenvolvimento no início escudo estágio (~ 6 hpf) por microscopia de fluorescência em todo embrião vivo (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII). Expressão da construção é mais forte durante os eventos iniciais do desenvolvimento embrionário e, muitas vezes, diminui durante o desenvolvimento como o RNA injetado capped é gradualmente degradada e depende da estabilidade da proteína expressa. PKD2 translacional-blocking morfolino: Com base nos resultados publicados anteriormente, esperamos que a PKD2 morphants para imitar a curvatura do eixo dorsal do corpo como os encontrados no peixe-zebra PKD2 mutante e cistos renais presentes em cerca de 2-3 dpf 4. <img src="/files/ftp_upload/1113/1113fig1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1: resultados Representante da microinjeção de EGFP mRNA e agosto PKD2 morfolino. (A) embriões TAB receberam microinjeções na fase 1-célula com 0,17 ng de mRNA EGFP e visualizados em um dpf para in vivo expressão GFP. (B, c) embriões TAB receberam microinjeções na fase 1-célula com ~ 1,7 nl de um PKD2 translacional morfolino bloqueio de 0,50 mM e marcou para a curvatura do corpo dorsal, 4 dpf.

<ol><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.++A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th, University of Oregon. (2000).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+zebrafish+fgf8+pre-mRNA+splicing+with+morpholino+oligos%3A+a+quantifiable+method+for+gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown.</a> Genesis. 30, 154-156 (2001).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+cilia+genes+as+a+principal+cause+of+cystic+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney.</a> Development. 131, 4085-4093 (2004).</li>
<li>Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication%2C+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103, 403-412 (1988).</li>
<li>Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109, 577-584 (1990).</li>
<li>Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+germ-line+transmission+of+plasmid+DNA+sequences+injected+into+fertilized+zebrafish+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).</li>
<li>Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo.</a> Development. 120, 1791-1798 (1994).</li>
<li>Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+early+cells+to+the+fate+map+of+the+zebrafish+gastrula%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula.</a> Science. 265, 517-520 (1994).</li>
<li>Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+germ-line+chimeras+in+zebrafish+by+cell+transplants+from+genetically+pigmented+to+albino+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).</li>
<li>Long, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA-1+expression+pattern+can+be+recapitulated+in+living+transgenic+zebrafish+using+GFP+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene.</a> Development. 124, 4105-4111 (1997).</li>
<li>Murphey, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+screening+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecule screening in the zebrafish.</a> Methods. 39, 255-261 (2006).</li>
</ol>

Microinjeção em embriões de peixe-zebra é uma técnica bem estabelecida e robusta para explorar o papel de um gene em particular no desenvolvimento. As aplicações incluem superexpressão, misexpression e ensaios knockdown do seu gene de interesse, bem como análise epistáticas entre genes múltiplos. Microinjeção em peixes-zebra tem sido amplamente utilizada para a geração de animais transgênicos, células e mapeamento de destino no início de embriões blástula 5,6,7,8,9. Além disso, a aplicação desta técnica serve...

Todos os outros materiais são listados no protocolo.

microinjeção de mrna e oligonucleotídeos anti-senso morpholino em embriões zebrafish.

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Uma ferramenta essencial para investigar o papel de um gene durante o desenvolvimento é a capacidade de executar knockdown do gene, superexpressão e estudos misexpression. Em peixes-zebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;), Microinjeção de RNA, DNA, proteínas, oligonucleotídeos antisense e outras moléculas pequenas para o desenvolvimento do embrião fornece aos pesquisadores um ensaio rápido e robusto para explorar a função do gene<em&gt; In vivo</em&gt;. Neste vídeo-artigo, vamos demonstrar como preparar e microinject<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA sintetizado EGFP e uma translação de bloqueio de morfolino oligo contra<em&gt; PKD2</em&gt;, Um gene associado à doença renal policística autossômica dominante (ADPKD), em 1 de células de embriões zebrafish palco. Vamos então analisar o sucesso do mRNA e microinjeções morfolino verificando expressão GFP e análise de fenótipo. Amplas aplicações desta técnica incluem a geração de animais transgênicos e células germinativas quimeras, célula-destino de mapeamento e seleção genética. Aqui nós descrevemos um protocolo para a superexpressão de EGFP e knockdown de<em&gt; PKD2</em&gt; Por mRNA e injeção de oligonucleotídeos morfolino.

Microinjeção é um método bem estabelecido e eficaz para a introdução de substâncias estranhas em embriões de peixe-zebra fertilizado. Aqui, nós demonstramos uma técnica de microinjeção robusta para a realização de superexpressão do mRNA, e oligonucleotídeos morfolino estudos gene knockdown no zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

Uma ferramenta essencial para investigar o papel de um gene durante o desenvolvimento é a capacidade de realizar o knockdown gênico, a superexpressão e a malsexpressão...

Este procedimento começa com a preparação do mRNA com capuz transcrito in vitro e morfo. Uma micropipeta é preenchida por sucção com a solução contendo morfo e, em seguida, o volume de injeção é calibrado utilizando um micrômetro em embriões na fase de uma célula. Em seguida, embriões de peixe-zebra são coletados e organizados em uma câmara de microinjeção para injeções microscópicas no vitelo.A solução de trabalho é injetada na gema logo abaixo da célula, e os movimentos citoplasmáticos são utilizados para transportar a solução para microinjeções celulares. Injete a solução no citoplasma celular após as injeções. Incube os embriões a 28,5 graus Celsius em meio E3 e avalie os fenótipos de interesse em estágios subsequentes.Olá, sou Shiloh Yuen do laboratório, filho do Dr. Sasha e do Departamento de Genética da Escola de Medicina da Universidade de Yale. Hoje demonstraremos uma técnica robusta de microinjeção para realizar estudos de superexpressão de mRNA e silenciamento gênico com oligonucleotídeos morfolinos em peixe-zebra. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o papel do S cílio nas doenças renais císticas.Então vamos começar. Uma abordagem poderosa para

microinjection-mrna-morpholino-antisense-oligonucleotides-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo mostra como morfolino ou mRNA podem ser injetadas em embriões de peixe-zebra na fase de uma célula para diminuir ou aumentar o nível de produtos de genes específicos durante o desenvolvimento subseqüente.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

Um método para entregar morpholinos diretamente no otocyst zebrafish em 24hpf tem sido desenvolvido. Usando microinjeção de morpholinos no lúmen da vesícula ótica e eletroporação para efeito de penetração, fomos capazes de contornar o efeito de morpholinos sobre o cérebro e obter efeitos específicos para o ouvido interno.

Entrega direta da MIF Morpholinos Into the Otocyst Zebrafish por injeção e Eletroporação afeta o desenvolvimento da orelha interna

Um método para condicionalmente knockdown expressão de uma proteína alvo na retina zebrafish adulto é descrito, que envolve a injeção intravítrea injeção morpholinos antisense e electroporating-los na retina. A proteína resultante é derrubado por vários dias, o que permite testar o papel da proteína na regeneração ou retina intacta.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

O protocolo descreve o knockdown direcionado da expressão gênica em peixe-zebra por injeção de morfolino na cauda.

Injeção de morfolino: um método para derrubar a expressão gênica alvo para estudar a função em peixe-zebra

Este vídeo descreve uma técnica de microinjeção de embriões para entregar compostos no saco vitelino de peixe-zebra.

Microinjeção de embriões: uma técnica para entregar um composto na gema do peixe-zebra

Aqui, apresentamos uma abordagem sistemática para o desenvolvimento fisiologicamente relevante, sensível e...

In Vivo Modelagem do Morbid Genoma Humano utilizando Danio rerio

Neste artigo, é demonstrar um método para a manipulação da expressão de genes nas células dos ventrículos do telencéfalo peixe-zebra adultos utilizando oligonucleótidos anti-sentido morfolino. Apresenta-se este método como um protocolo eficiente e rápida, que pode ser utilizado para estudos funcionais no cérebro adulto vertebrado.

Micromanipulação de expressão gênica no cérebro adulto Zebrafish Usando microinjeção Cerebroventricular de Morpholino Oligonucleotides

Um método de genética reversa adaptável para peixe-zebra para avaliar a função do gene em fases posteriores do desenvolvimento e homeostase fisiológica, como a regeneração do tecido usando injeções intraventricular de morpholinos gene-específicos.

Reverter Genética Abordagem Morfolino Usando Injeção Cardíaca Ventricular para transf múltiplos tecidos de difícil alvo do Zebrafish Zergling

Neste vídeo, Nijole Jasinskiene demonstra a metodologia utilizada para gerar transgênicos mosquitos Aedes aegypti, que são vetores da dengue. As técnicas para preparar corretamente agulhas microinjeção, os embriões desidratantes, e realizando microinjeção são demonstradas.

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

Aqui nós descrevemos um método para a montagem de embriões zebrafish de longo prazo de imagem, de dois fótons de imagem e tecidos de danos técnicas e lapso de tempo de imagem confocal.

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Aprenda a técnica de microinjeção em embriões de zebrafish para sobrexpressão de mRNA e knockdown de genes usando oligonucleotídeos morpholino. Este método robusto permite estudar funções genéticas em biologia do desenvolvimento.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

Explorar mais vídeos