Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

Este procedimento começa com a preparação de mRNA de capa transcrita morfo e in vitro. Uma micropipeta é preenchida sifonando a solução contendo morfo e o volume de injeção é então calibrado usando um micrômetro de um estágio de célula. Os embriões de peixe-zebra são então coletados e dispostos em uma câmara de microinjeção para microinjeções de gema.

A solução de trabalho é injetada na gema logo abaixo da célula e os movimentos citoplasmáticos são usados para transportar a solução para microinjeções celulares. Injetar a solução no citoplasma da célula após as injeções. Incubar os embriões a 28,5 graus Celsius em E três meios e pontuar para fenótipos de interesse nos estágios subsequentes.

Olá, sou Shiloh Yuen do laboratório, filho do Dr. Sasha e do Departamento de Genética da Escola de Medicina da Universidade de Yale. Hoje demonstraremos uma técnica robusta de microinjeção para realizar estudos de superexpressão de mRNA e knockdown do gene do morfo oligonucleotídeo em peixe-zebra. Utilizamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar o papel do S cilium nas doenças renais císticas.

Então vamos começar. Uma abordagem poderosa para estudos de função gênica é microinjetar RNA tampado transcrito in vitro em embriões de peixe-zebra. Nesta demonstração, vamos microinjetar uma transcrição marcada com EGFP e usar a expressão de GFP de embrião inteiro vivo como uma leitura visível para uma injeção bem-sucedida.

Primeiro, realizaremos uma reação de transcrição de RNA cap in vitro em sua transcrição de interesse. Em nosso laboratório, inserimos rotineiramente A-C-D-N-A de interesse em um vetor PC two plus e realizamos uma reação de síntese in vitro de grandes quantidades de RNA tampado usando o kit M message M machine SP six. Em seguida, purificaremos a amostra de RNA passando-a pelo mini kit RN easy ou por extração de clorofórmio de fenol e precipitação de isopropanol.

Determine cuidadosamente a concentração da preparação de RNA e armazene-a a menos 80 graus Celsius até que esteja pronta para uso no dia da injeção. Descongele o vórtice de amostra de RNA levemente e gire para baixo brevemente. Agora prepare uma solução de trabalho com água estéril e uma concentração final de 0,025 a 0,05% de vermelho de fenol, o vermelho de fenol serve como um marcador visível para a injeção da solução no embrião.

Aqui vamos preparar uma solução de trabalho de 100 nanogramas por mRNA EGFP de microlitro com vermelho de fenol a 0,05%. Por fim, mantenha a amostra de trabalho no gelo e retorne o estoque de RNA a 80 graus Celsius negativos. Prossiga para a preparação do morfo quando estiver pronto para injetar esta amostra.

Os oligonucleotídeos antisense de Morino são amplamente utilizados para modificar a expressão gênica, bloqueando a tradução de uma proteína alvo ou modificando o NA prem. Os morphos de emenda no peixe-zebra servem como uma poderosa ferramenta de genética reversa, derrubando a função do gene. Aqui vamos micro injetar um oligo morfo direcionado ao local de iniciação translacional do pkd dois. Usamos rotineiramente 300 M de um oligo morfográfico, projetado especificamente para um gene de interesse obtido da Gene Tools LLC.

Em seguida, adicionamos 100 microlitros de água estéril para fazer uma solução estoque de três milimolares e, em seguida, alíquota da solução e armazenamos a menos 20 graus Celsius até que esteja pronta para uso no dia da injeção. Aquecemos a solução morino a 65 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, estalamos, resfriamos a solução no gelo imediatamente e giramos brevemente, esta etapa desnatura quaisquer estruturas secundárias no oligo e garante que a solução seja completamente solubilizada.

Em seguida, prepararemos uma solução de trabalho diluindo a solução Morpho em água estéril e uma concentração final de 0,025 a 0,05% de vermelho pinal. Nesta demonstração, estaremos preparando uma solução de trabalho de PKD 0,5 milimolar dois morino com vermelho de fenol 0,05%. Mantenha a solução de trabalho à temperatura ambiente e proceda ao enchimento da micropipeta quando estiver pronto para injetar esta amostra.

Para começar, precisaremos fabricar micropipetas para serem usadas nas injeções. Isso é feito aquecendo e puxando tubos capilares de vidro de silicato BOS em um dispositivo polar de micropipeta. Uma vez que as agulhas são puxadas, elas são mantidas em uma placa de Petri em cima de uma pequena quantidade de argila ou fita adesiva.

Em seguida, prepararemos placas de câmara de microinjeção despejando 1,5% de aros em uma XE três placas médias moldadas com calhas em forma de cunha. Isso servirá como um método fácil para segurar os embriões durante a injeção. As placas da câmara agrícola são então solidificadas e armazenadas a quatro graus Celsius até que estejam prontas para serem usadas.

Para começar a encher a micropipeta. Corte a ponta distal com uma pinça ou uma lâmina de barbear cirúrgica para criar uma abertura que seja visível sob um microscópio de dissecação com ampliação de 50x. Em seguida, coloque dois microlitros de sua solução de trabalho.

Como uma gota em uma lamínula, conecte a parte de trás de uma micropipeta a uma seringa de cinco mililitros equipada com um tubo em uma agulha hipodérmica e submerja levemente a ponta distal da micropipeta em sua gota de solução de trabalho. Tome cuidado para não quebrar a ponta da micropipeta. Sifone a solução de trabalho através da extremidade distal da micropipeta puxando o êmbolo da seringa.

Em seguida, calibraremos o volume de injeção da micropipeta. Coloque uma gota de óleo mineral em uma lâmina micrométrica e ligue a energia e o suprimento de ar para o aparelho microinjetor de pulso de pressão. Em seguida, conecte a micropipeta ao suporte da micropipeta do aparelho microinjetor.

O microinjetor é regulado por pressão e as descargas são ativadas pressionando o pedal sob o microscópio de dissecação. Teste o volume de injeção usando o microinjetor para colocar uma gota de sua solução de trabalho no óleo do micrômetro. Meça o diâmetro da gota enquanto ela flutua como uma esfera em cima do óleo.

Ajuste a duração e a pressão da injeção para calibrar cuidadosamente o volume da injeção. Esta etapa auxilia na reprodutibilidade do experimento de microinjeção. Nesta demonstração, todas as micro injeções serão feitas com um diâmetro de gota de 0,15 milímetros.

Finalmente, uma vez calibrado o volume de injeção, use o botão de retenção no microinjetor para evitar o enchimento e vazamento da micropipeta. Agora é hora de preparar os embriões de peixe-zebra. O peixe-zebra acasalará aleatoriamente, nas primeiras horas de cada manhã para iniciar a preparação, coletará embriões no estágio de uma célula e os colocará em um meio XE três.

Usando uma pipeta de transferência de três mililitros, organize os embriões ao longo das calhas em forma de cunha nas placas da câmara de microinjeção. Remova o meio para que os embriões fiquem rasos, submersos e não inundados. Esta etapa auxilia na sedimentação dos embriões no fundo das calhas, bem como na penetração do córion pela micropipeta.

Agora vamos começar as injeções. Primeiro, vamos manipular os embriões com a micropipeta para que o citoplasma do embrião em estágio de uma célula seja visível ao microscópio de dissecação. Tome cuidado para não quebrar a ponta da micropipeta, penetre no córion e depois na gema com a micropipeta para injetar no embrião.

Nesta demonstração, seremos os primeiros a microinjetar na gema diretamente abaixo da célula e permitir que a citoplasmática e a difusão tragam a solução de trabalho para dentro da célula. Este fluxo é visível devido ao vermelho de fenol adicionado à solução de trabalho. Por se tratar de um embrião unicelular, ele pode ser injetado à mão livre ou com um manipulador.

Também demonstraremos a injeção direta no citoplasma da célula. A microinjeção direta na célula é mais robusta, mas demorada, pois é necessária uma orientação adequada do embrião e a técnica de microinjeção. Como a membrana celular é mais rigorosa do que a membrana vitelina, muitas vezes é mais rápido entrar na micropipeta através da gema para chegar à célula.

O citoplasma orientando o pólo do animal em direção ao fundo do cocho e trabalhando com mãos firmes pode ajudar neste método de injeção. Após a microinjeção, coloque os embriões em uma placa de Petri com meio E três e incube-os a 28,5 graus Celsius para um desenvolvimento normal. Nas próximas horas e dias de desenvolvimento embrionário, observe os embriões em busca de fenótipos de interesse.

Para verificar o sucesso da microinjeção, monitoraremos a expressão de GFP nos embriões em desenvolvimento começando no estágio de escudo por microscopia de fluorescência de embrião inteiro in vivo a expressão da construção é mais forte durante os eventos iniciais do desenvolvimento embrionário e muitas vezes diminui durante o desenvolvimento. Como o RNA tampado injetado é gradualmente degradado e depende da estabilidade da proteína expressa. Com base nos resultados publicados anteriormente, esperamos que a morfina PKD dois imite a curvatura do eixo dorsal do corpo, conforme encontrado no peixe-zebra PKD dois mutantes e apresente cistos renais aproximadamente dois a três dias após a fertilização.

Acabamos de mostrar uma técnica robusta de microinjeção para realizar estudos de superexpressão de mRNA e nocaute do gene do morfo oligonucleotídeo em peixe-zebra ao fazer este procedimento, lembre-se de que isso é importante. Injete com a mão firme. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.