Name: Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprenda a técnica de microinjeção em embriões de zebrafish no estágio de uma célula para manipular a expressão gênica. Este método permite estudar funções de genes em biologia do desenvolvimento e neurociência.

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Reconhecemos os membros do laboratório de Mably e Storer Narie por sua assistência técnica, e da American Heart Association (NCRP Scientist Desenvolvimento Grant 0635363N) e do National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) para financiamento.

Parte 1: A produção de ovos e cobrança <ol><li> A noite antes da injeção, os peixes criados em tanques de criação com divisórias no lugar. Para aumentar a produção total de ovos, peixes pode ser configurado em uma proporção de duas fêmeas para um macho, se desejar. </li><li> Na manhã seguinte, depois de as luzes da sala ligar, puxe os divisores de vários tanques e permitir a cerca de 20 minutos de tempo de acasalamento imperturbável. </li><li> Usando um filtro, recolher os ovos das gaiolas de criação e enxaguar com água de ovo. Despeje os ovos em uma placa de Petri com água do ovo e remova ovos não fertilizados e detritos com uma pipeta. Os peixes podem ser reagrupados em tanques maiores para produzir rodadas adicionais de ovos para injeção. Ajustar o tempo de coleta de ovos para permitir número máximo de ovos a ser produzida sem deixá-los passar o estágio unicelular. </li><li> Coloque uma lâmina de microscópio invertido na tampa de uma placa de Petri de 100mm. Use uma pipeta para alinhar os ovos contra a lateral da lâmina formando uma única coluna. Retirar a água em excesso do ovo a partir do slide pressionando uma Kimwipe contra o lado oposto os ovos. (Figura 1A) </li></ol> Parte 2: Agulha puxando, carregamento e preparação <ol><li> Com um puxador de micropipeta, puxe um copo OD 1,0 milímetros capilar em duas agulhas e armazenar em uma placa de Petri 150 milímetros colocando sobre rampas bolinha de borracha. Agulhas pode ser puxado com antecedência. </li><li> Agulha de protelar o com 3 mL de material de injecção utilizando uma pipeta microloader. Agitar o bolo em direção à ponta da agulha até que haja poucas ou nenhuma bolha restantes. </li><li> Ligue a fonte de ar e microinjetor. Inserir a agulha no microinjetor e garantir uma perfeita vedação dentro da caixa. Verifique se o micromanipulador está em uma posição adequada para permitir uma ampla gama de movimentos e de ajuste. Traga a ponta da agulha no plano de visão do microscópio de alta fora do palco, e concentrar-se na região mais fina da ponta. Use uma pinça afiada para beliscar fora a agulha em um ponto que deixa a agulha fina o suficiente para furar o córion e gema, mas ainda capaz de fornecer um tamanho consistente talão. Uma gota de óleo mineral em um micrômetro pode ser usado para calcular o volume de cada injeção. Quando injetado no petróleo, um cordão com um diâmetro de 0,1 mm contém 500 pL de material de injeção (figura 1B); volumes de injeção de 500 pL ou 1nL são normalmente utilizados. Pressione o pedal e monitorar o tamanho do grânulo ao aparar a agulha e ajustando a pressão de injeção, conforme necessário. Volumes de injeção ideal vai preencher cerca de 10% do volume de ovos. A qualidade da ponta da agulha é crucial para ambos, a facilidade da injeção ea qualidade e consistência dos resultados. </li></ol> Parte 3: Injeção <ol><li> Garantir os embriões não se desenvolveram após o estágio de quatro células. Idealmente, os embriões devem estar no estágio de uma célula. </li><li> Abaixe a agulha em direção à coluna de ovos, segurando o prato no lugar com a mão oposta. </li><li> Pierce superfície do córion e introduzir a gema de um só golpe suave enquanto assiste a qualquer esmagamento ou rompimento do saco vitelino. Injetar o material de injecção a gema (figura 1C). Evite injetar bolhas de ar ou esticar a gema ou como pode ser letal para o embrião. Trabalhando para baixo da linha, ajustar a pressão conforme necessário para manter um tamanho consistente talão e, usando uma ponteira, remover os ovos não fertilizados que parecem ou são destruídas durante o processo de injeção. </li><li> Depois de completar uma coluna de ovos, use um jato suave de água do ovo para mover os ovos injetado em uma placa de Petri limpa. Repita conforme necessário. Manter vários embriões uninjected como controle. No final do dia, remova embriões mortos e gravar o número de embriões injetados. Substitua a água dos ovos no prato periodicamente para reduzir a chance de infecção. </li></ol> Parte 4: Os resultados representativos Dependendo do que está sendo injetado, os embriões podem sobreviver a uma taxa inferior do que seus irmãos uninjected. Felizmente, é fácil para injetar um grande número deles, então isso raramente é um problema. É normal que morphants para expor o desenvolvimento ligeiramente atrasado. Para ilustrar os resultados da microinjeção, utilizamos esse protocolo para manipular os níveis da proteína Coração de Vidro (Heg). Heg é uma proteína transmembrana necessário para o desenvolvimento normal do coração. Na sua ausência, os embriões se desenvolvem corações com extensões entrada gigante e câmaras 1. Injetamos dois morpholinos anteriormente não descritas contra HEG, heg_e3i3_egfr1 e heg_e4i4_egfr2, em uma concentração de 500 mM. Menos 2 dias após a fertilização, os controles irmão uninjected aparecem normal, como esperado (Figura 2A e B). Embriões injetados com heg_e3i3_egfr1 têm edema cerebral (figura 2C). Embora os corações da maioria destes morphants ter alterado a morfologia, suas câmaras são normalmente de tamanho (figura 2D). Embriões injetadoscom heg_e4i4_egfr2 apresentam defeitos cardíacos variável. Alguns parecem normais, enquanto outros têm folhetos grande influxo e átrios moderadamente aumentado (Figura 2E e F). O mutante HEG, conforme relatado anteriormente 1, tem uma via de entrada extremamente alargada e do átrio (Figura 2G e H). Também injetou embriões tipo selvagem com 400 mRNA ng / mL transcrito de full-length HEG cDNA. Enquanto os controles uninjected desenvolver normalmente (figura 3A e B), embriões injetados com HEG mRNA exibem um espectro de fenótipos que vão desde a aparência do tipo selvagem para ciclopia grave, encurtamento do eixo do corpo principal, necrose da cabeça e do corpo, e defeitos da linha média (figura 3C e D). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> Figura 1. Embriões a ser injetado estão alinhados contra uma lâmina de microscópio numa placa de Petri (A). Volume de injeção é determinada pela injeção em óleo mineral colocado em um micrômetro. Um volume de injeção de 500 pL, que é comumente usado, tem um diâmetro de 0,1 mm (B). Imediatamente após a injeção, o morfolino ou mRNA é visível como uma mancha pontuam na gema (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> Figura 2. Em 2 dias após a fertilização, os embriões não têm defeitos uninjected bruto (A) ou fenótipo coração (B). Embriões injetados com a heg_e3i3_egfr1 morfolino têm edema cerebral (C, seta), mas as câmaras cardíacas de tamanho normal (D). Alguns embriões injetados com a heg_e4i4_egfr2 morfolino têm extensões entrada alargada e átrios (E, F). HEG mutantes têm extensões entrada severamente alargada e átrios (G, H). (A), (C), (E) e (G) são 4x imagens DIC; (B), (D), (F) e (H) são 20x imagens DIC. um átrio = it = via de entrada. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> Figura 3. Às 24 horas após a fertilização, os embriões uninjected ter um corpo longo e reto, sem necrose ou defeitos da linha média (A) e dois olhos bem definidos com um tubo neural entre eles (B). Alguns embriões injetados com mRNA HEG, em contrapartida, exibem um eixo do corpo encurtado, necrose, somitos deformado (C), e ciclopia (D). (A) e (C) são 4x imagens DIC; (B) e (D) são 20x imagens DIC.

<ol><li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li>
</ol>

Um dos pontos fortes do sistema de modelo peixe-zebra é a facilidade com que produtos de genes específicos podem ser adicionados ou eliminados do embrião por microinjeção. Para ubiquitously superexpressam uma proteína particular, a codificação de mRNA é injetado na gema na fase 1-célula. Durante o desenvolvimento posterior do embrião, o RNA é distribuído por todo o organismo e traduzido. Por outro lado, para eliminar uma determinada proteína, morpholinos são usados. Morpholinos são oligonucleotídeos sintéticos projetados com a complementaridade de RNAs antisense específico. Como mRNAs, morpholinos são injetados na gema na fase 1-célula. Dentro do embrião que se ligam RNAs seu alvo, prevenindo tradução. A principal modificação que precisa ser feita para cada morfolino ou mRNA é a concentração de material injetado. Uma concentração demasiado elevada de qualquer morfolino ou mRNA pode causar toxicidade não-específica, enquanto cada morfolino deve ser testado empiricamente para determinar a concentração ideal, normalmente morfolino concentrações entre 200 e 500 mM mM derrubar a atividade do gene de forma eficaz, sem causar defeitos não-específica. O tamanho exato da abertura da agulha não é crucial. Dentro de uma gama de tamanhos de agulha, pressão de injeção e tempo de injeção pode ser ajustado para produzir um bolo de o volume correto. Morpholinos têm muitas aplicações, incluindo a dissecção funcional de domínios dentro de uma proteína. Quando se destinar a meta específica exon-intron cruzamentos, morpholinos impedirá splicing ocorra lá. Nós examinamos os efeitos de duas morpholinos que se ligam exon-intron junções na pré-mRNA de HEG. O heg_e3i3_egfr1 morfolino liga a junção entre exon 3 e intron 3, impedindo a maquinaria de splicing do exon 3 incorporando em transcrições maduro. O heg_e4i4_egfr2 morfolino semelhante remove exon 4. Ambos os exons 3 e 4 codificam domínios contendo EGF-like repete. Alguns embriões injetados com heg_e4i4_egfr2 moderadamente fenocópia o mutante; novos experimentos serão necessários para entender o papel do exon 4 Heg no desenvolvimento do coração. Surpreendentemente, os embriões injetados com heg_e3i3_egfr1 têm edema cerebral, uma característica não observada em mutantes HEG. Isto pode ser devido à capacidade de morpholinos para ligar transcrições materna que não seria afetada em mutantes zigóticos.

<table><tbody><tr><td>Microinjetor</td><td>Ferramenta</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI 100</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Ferramenta</td><td>Narishige International</td><td>MN 153</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de Agulhas</td><td>Ferramenta</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P 97</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de Vidro</td><td>Ferramenta</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100 F6</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Microloader</td><td>Ferramenta</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para Agulhas</td><td>Ferramenta</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH310</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjeção de embriões zebrafish para analisar a função do gene

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Uma das vantagens de estudar zebrafish é a facilidade e velocidade de manipular os níveis de proteínas no embrião. Morpholinos, que são oligonucleotídeos sintéticos com complementaridade antisense para RNAs alvo, podem ser adicionados para o embrião para reduzir a expressão de um produto gene particular. Por outro lado, mRNA processados ​​podem ser adicionados para o embrião para aumentar os níveis de um produto gene. O veículo para a adição ou mRNA ou morfolino a um embrião é microinjeção. Microinjeção é eficiente e rápida, permitindo a injeção de centenas de embriões por hora. Este vídeo mostra todos os passos envolvidos na microinjeção. Resumidamente, os ovos são recolhidos imediatamente após terem sido definidos e alinhados contra uma lâmina de microscópio numa placa de Petri. Em seguida, uma agulha de ponta fina carregado com material de injecção é conectado a um microinjetor e uma fonte de ar, e os controles microinjetor são ajustados para produzir um volume de injeção desejável. Finalmente, a agulha é mergulhado em gema do embrião e do morfolino ou mRNA é expulso.

Este vídeo mostra como morfolino ou mRNA podem ser injetadas em embriões de peixe-zebra na fase de uma célula para diminuir ou aumentar o nível de produtos de genes específicos durante o desenvolvimento subseqüente.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

Uma das vantagens de estudar o peixe-zebra é a facilidade e a rapidez na manipulação dos níveis proteicos no embrião. Os morfolinos, que são sintéticos...

Peixes-zebra machos e fêmeas são acasalados em uma gaiola de reprodução na qual os ovos fertilizados caem para o fundo, onde podem ser facilmente coletados. Em seguida, os ovos são alinhados contra uma lâmina de microscópio em uma placa de Petri. Depois, a agulha de injeção carregada é cortada e as configurações de injeção são ajustadas, de modo que o volume injetado tenha o tamanho desejado ao ser medido com um micrômetro.Por fim, os ovos são injetados um a um ao longo da linha. Olá, sou Jonathan Rosen do laboratório de John MA, do Departamento de Cardiologia do Hospital Infantil de Boston. E eu sou Michael Sweeney, também do laboratório VY.Hoje vamos demonstrar como o mRNA ou o morpholino pode ser injetado em embriões de peixe-zebra. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os efeitos da inibição ou superexpressão de produtos gênicos específicos. Então, vamos começar.Para começar, precisamos preparar os peixes e os tanques de reprodução com divisórias colocadas na noite anterior à injeção, a fim de aumentar a produção total de ovos. Os peixes podem ser dispostos na proporção de duas fêmeas para um macho, se desejado. Na manhã seguinte, após a iluminação do ambiente ser ligada, retire as divisórias de vários tanques e permita cerca de 20 minutos de acasalamento sem perturbações. Usando um coador, colete os ovos das gaiolas de reprodução e enxágue-os com água para ovos antes de despejá-los em uma placa de Petri.Com água de ovo, os peixes podem ser reagrupados em tanques maiores para produzir rodadas adicionais de ovos para injeção. Ajuste o momento da coleta dos ovos para permitir o máximo número possível de ovos ser produzido, sem deixá-los ultrapassar a fase de célula única. Por fim, coloque uma lâmina de microscópio na tampa invertida de uma placa de Petri de 100 milímetros.Use uma pipeta de transferência para alinhar os ovos ao longo da borda da lâmina, formando uma única coluna, e, em seguida, remova o excesso de água dos ovos pressionando uma toalha de papel Kim contra o lado oposto aos ovos. Em seguida, prepararemos as microagulhas de injeção utilizando um puxador de micropipetas. Puxaremos uma capilar de vidro com diâmetro externo de um milímetro em duas agulhas e armazenaremos essas agulhas em uma placa de Petri de 150 milímetros. Colocando-as sobre rampas de massa de modelar, as agulhas podem ser puxadas com antecedência.Utilizamos as seguintes configurações. Aqueça 6 45 polos 60 velocidade 80. Carregue a extremidade larga da agulha com três microlitros do material de injeção utilizando uma pipeta micro loader.Agite o bolo em direção à ponta da agulha até que reste poucas ou nenhuma bolha. Em seguida, vamos ligar a fonte de ar e o microinjetor. Insira a agulha no microinjetor e certifique-se de que haja um selamento firme dentro da carcaça.Verifique se o micromanipulador está em uma posição adequada para permitir uma ampla gama de movimento e ajuste. Posicione a ponta da agulha no plano de visão do microscópio. Eleve bem acima do platô e foque na região mais fina da ponta.Use um par de pin&ccedil;as afiadas para cortar a agulha em um ponto que a deixe estreita o suficiente para perfurar a c&oacute;rio e a gema, mas ainda capaz de liberar gotas de tamanho consistente. Para calcular o volume de cada inje&ccedil;&atilde;o, usaremos uma gota de &oacute;leo mineral sobre um micr&ocirc;metro, inseriremos a agulha no &oacute;leo e acionaremos o pedal com o p&eacute; para injetar uma gota da solu&ccedil;&atilde;o no &oacute;leo. Observe o tamanho da gota enquanto ajusta a ponta da agulha e a press&atilde;o de inje&ccedil;&atilde;o, conforme necess&aacute;rio, ao injetar no &oacute;leo.Uma esfera com diâmetro de 0,1 milímetro contém 500 picolitros de material de injeção. Geralmente, utilizam-se volumes de injeção de 500 picolitros ou um nanolitro. Os volumes ideais de injeção preencherão aproximadamente 10% do volume do óvulo.A qualidade da ponta da agulha é crucial tanto para a facilidade da injeção quanto para a qualidade e consistência dos resultados. Agora é a hora de injetar, iniciando o procedimento de injeção. Certifique-se de que os embriões não tenham desenvolvido além da fase de quatro células.O embrião deve estar idealmente na fase de uma única célula. Em seguida, abaixe a agulha em direção à coluna de ovos, perfure a superfície do córion e penetre na gema com um único movimento suave, observando atentamente. Caso haja esmagamento ou rasgo do saco vitelino, injete o material de injeção diretamente na gema.Evite injetar bolhas de ar e fique atento a embriões que estejam visivelmente danificados pela injeção ao avançar ao longo da fileira. Ajuste a pressão conforme necessário para manter um tamanho consistente da gota e, utilizando uma ponteira de pipeta, remova os ovos que pareçam não fertilizados ou que tenham sido destruídos durante o processo de injeção. Após concluir uma coluna de ovos, use um fluxo suave de água para ovos para transferir os ovos injetados para uma placa de Petri limpa e repita o procedimento conforme necessário.Mantenha vários embriões não injetados como controle. Mais tarde, durante o primeiro dia, remova os embriões mortos e registre o número de embriões injetados. Substitua a água dos ovos no recipiente periodicamente para reduzir a chance de infecção.Observe que, dependendo do que está sendo injetado, os embriões podem sobreviver a uma taxa menor do que seus irmãos não injetados. Felizmente, é fácil injetar um grande número deles, de modo que isso raramente é um problema. Agora mostraremos alguns resultados representativos tanto da injeção de morfolinos quanto de mRNA.O controle não injetado com 48 horas pós-fertilização apresenta aparência normal, conforme esperado. No entanto, embriões injetados com o morpholino HG E três i três eeg FFR um, que inibe isoformas de HG contendo a primeira das duas repetições semelhantes a eeg f, exibem edema cerebral e injeção no coração. O Mr.NA também produziu um fenótipo evidente com 24 horas pós-fertilização.As cabeças dos controles não injetados pareciam normais. Inversamente, alguns dos embriões injetados com o M NNA exibem opia. Acabamos de mostrar como a injeção de morpholinos ou mRNA durante o estágio de uma célula pode aumentar ou diminuir a expressão de genes específicos durante o desenvolvimento posterior. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar também disso.Uma alta concentração de mRNA ou morfolino pode causar letalidade inespecífica nos embriões com o morfolino. Cada um deve ser testado empiricamente, mas geralmente concentrações entre 200 e 500 micromolares reduzem especificamente a atividade gênica sem causar letalidade geral. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

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