Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene
9 de março de 2009
Este vídeo mostra como morfolino ou mRNA podem ser injetadas em embriões de peixe-zebra na fase de uma célula para diminuir ou aumentar o nível de produtos de genes específicos durante o desenvolvimento subseqüente.
Peixes-zebra machos e fêmeas são acasalados em uma gaiola de reprodução na qual os ovos fertilizados caem para o fundo, onde podem ser facilmente coletados. Em seguida, os ovos são alinhados contra uma lâmina de microscópio em uma placa de Petri. Depois, a agulha de injeção carregada é cortada e as configurações de injeção são ajustadas, de modo que o volume injetado tenha o tamanho desejado ao ser medido com um micrômetro.
Por fim, os ovos são injetados um a um ao longo da linha. Olá, sou Jonathan Rosen do laboratório de John MA, do Departamento de Cardiologia do Hospital Infantil de Boston. E eu sou Michael Sweeney, também do laboratório VY.
Hoje vamos demonstrar como o mRNA ou o morpholino pode ser injetado em embriões de peixe-zebra. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os efeitos da inibição ou superexpressão de produtos gênicos específicos. Então, vamos começar.
Para começar, precisamos preparar os peixes e os tanques de reprodução com divisórias colocadas na noite anterior à injeção, a fim de aumentar a produção total de ovos. Os peixes podem ser dispostos na proporção de duas fêmeas para um macho, se desejado. Na manhã seguinte, após a iluminação do ambiente ser ligada, retire as divisórias de vários tanques e permita cerca de 20 minutos de acasalamento sem perturbações. Usando um coador, colete os ovos das gaiolas de reprodução e enxágue-os com água para ovos antes de despejá-los em uma placa de Petri.
Com água de ovo, os peixes podem ser reagrupados em tanques maiores para produzir rodadas adicionais de ovos para injeção. Ajuste o momento da coleta dos ovos para permitir o máximo número possível de ovos ser produzido, sem deixá-los ultrapassar a fase de célula única. Por fim, coloque uma lâmina de microscópio na tampa invertida de uma placa de Petri de 100 milímetros.
Use uma pipeta de transferência para alinhar os ovos ao longo da borda da lâmina, formando uma única coluna, e, em seguida, remova o excesso de água dos ovos pressionando uma toalha de papel Kim contra o lado oposto aos ovos. Em seguida, prepararemos as microagulhas de injeção utilizando um puxador de micropipetas. Puxaremos uma capilar de vidro com diâmetro externo de um milímetro em duas agulhas e armazenaremos essas agulhas em uma placa de Petri de 150 milímetros. Colocando-as sobre rampas de massa de modelar, as agulhas podem ser puxadas com antecedência.
Utilizamos as seguintes configurações. Aqueça 6 45 polos 60 velocidade 80. Carregue a extremidade larga da agulha com três microlitros do material de injeção utilizando uma pipeta micro loader.
Agite o bolo em direção à ponta da agulha até que reste poucas ou nenhuma bolha. Em seguida, vamos ligar a fonte de ar e o microinjetor. Insira a agulha no microinjetor e certifique-se de que haja um selamento firme dentro da carcaça.
Verifique se o micromanipulador está em uma posição adequada para permitir uma ampla gama de movimento e ajuste. Posicione a ponta da agulha no plano de visão do microscópio. Eleve bem acima do platô e foque na região mais fina da ponta.
Use um par de pinças afiadas para cortar a agulha em um ponto que a deixe estreita o suficiente para perfurar a cório e a gema, mas ainda capaz de liberar gotas de tamanho consistente. Para calcular o volume de cada injeção, usaremos uma gota de óleo mineral sobre um micrômetro, inseriremos a agulha no óleo e acionaremos o pedal com o pé para injetar uma gota da solução no óleo. Observe o tamanho da gota enquanto ajusta a ponta da agulha e a pressão de injeção, conforme necessário, ao injetar no óleo.
Uma esfera com diâmetro de 0,1 milímetro contém 500 picolitros de material de injeção. Geralmente, utilizam-se volumes de injeção de 500 picolitros ou um nanolitro. Os volumes ideais de injeção preencherão aproximadamente 10% do volume do óvulo.
A qualidade da ponta da agulha é crucial tanto para a facilidade da injeção quanto para a qualidade e consistência dos resultados. Agora é a hora de injetar, iniciando o procedimento de injeção. Certifique-se de que os embriões não tenham desenvolvido além da fase de quatro células.
O embrião deve estar idealmente na fase de uma única célula. Em seguida, abaixe a agulha em direção à coluna de ovos, perfure a superfície do córion e penetre na gema com um único movimento suave, observando atentamente. Caso haja esmagamento ou rasgo do saco vitelino, injete o material de injeção diretamente na gema.
Evite injetar bolhas de ar e fique atento a embriões que estejam visivelmente danificados pela injeção ao avançar ao longo da fileira. Ajuste a pressão conforme necessário para manter um tamanho consistente da gota e, utilizando uma ponteira de pipeta, remova os ovos que pareçam não fertilizados ou que tenham sido destruídos durante o processo de injeção. Após concluir uma coluna de ovos, use um fluxo suave de água para ovos para transferir os ovos injetados para uma placa de Petri limpa e repita o procedimento conforme necessário.
Mantenha vários embriões não injetados como controle. Mais tarde, durante o primeiro dia, remova os embriões mortos e registre o número de embriões injetados. Substitua a água dos ovos no recipiente periodicamente para reduzir a chance de infecção.
Observe que, dependendo do que está sendo injetado, os embriões podem sobreviver a uma taxa menor do que seus irmãos não injetados. Felizmente, é fácil injetar um grande número deles, de modo que isso raramente é um problema. Agora mostraremos alguns resultados representativos tanto da injeção de morfolinos quanto de mRNA.
O controle não injetado com 48 horas pós-fertilização apresenta aparência normal, conforme esperado. No entanto, embriões injetados com o morpholino HG E três i três eeg FFR um, que inibe isoformas de HG contendo a primeira das duas repetições semelhantes a eeg f, exibem edema cerebral e injeção no coração. O Mr.NA também produziu um fenótipo evidente com 24 horas pós-fertilização.
As cabeças dos controles não injetados pareciam normais. Inversamente, alguns dos embriões injetados com o M NNA exibem opia. Acabamos de mostrar como a injeção de morpholinos ou mRNA durante o estágio de uma célula pode aumentar ou diminuir a expressão de genes específicos durante o desenvolvimento posterior. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar também disso.
Uma alta concentração de mRNA ou morfolino pode causar letalidade inespecífica nos embriões com o morfolino. Cada um deve ser testado empiricamente, mas geralmente concentrações entre 200 e 500 micromolares reduzem especificamente a atividade gênica sem causar letalidade geral. É isso.
Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
Visão Geral
Este vídeo demonstra a injeção de morpholino ou mRNA em embriões de peixe-zebra no estágio de uma célula para manipular a expressão gênica durante o desenvolvimento.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Manipulação Genética
Contexto
- Peixes-zebra são comumente utilizados como organismo modelo em biologia do desenvolvimento.
- Técnicas de injeção permitem o estudo da função e regulação gênica.
- A manipulação da expressão gênica pode revelar insights sobre processos de desenvolvimento.
- O manuseio cuidadoso de embriões é crucial para experimentos bem-sucedidos.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar a técnica de injeção de mRNA ou morpholino em embriões de peixe-zebra.
- Observar os efeitos do silenciamento gênico ou superexpressão sobre o desenvolvimento.
- Fornecer um protocolo para pesquisadores interessados em manipulação genética.
Métodos Utilizados
- Criação de peixes-zebra e coleta de ovos fertilizados.
- Preparação de agulhas de microinjeção e carregamento com o material injetável.
- Microinjeção de embriões no estágio de uma única célula com precisão.
- Monitoramento do desenvolvimento embrionário e registro dos resultados.
Resultados Principais
- Os embriões injetados exibiram fenótipos específicos com base no material utilizado.
- Os embriões controle desenvolveram-se normalmente, enquanto os injetados apresentaram resultados variados.
- A injeção de morpholino levou a edema cerebral observável em alguns casos.
- As injeções de mRNA resultaram em alterações distintas no desenvolvimento.
Conclusões
- A técnica altera efetivamente a expressão gênica em embriões de peixe-zebra.
- A otimização cuidadosa dos parâmetros de injeção é essencial para o sucesso.
- Os resultados destacam o potencial deste método para o estudo da função gênica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microinjeção em embriões de peixe-zebra permite a modulação rápida e escalonável da expressão gênica para a validação precoce de alvos na descoberta de fármacos. A técnica possibilita triagens fenotípicas de alto rendimento ao permitir o silenciamento ou superexpressão precisos de genes específicos para avaliar as consequências funcionais em um sistema vertebrado. Essa abordagem oferece valor de desvio de risco mecanicista ao associar perturbações genéticas a fenótipos desenvolvimentais observáveis, informando a confiança no alvo e decisões de triagem de portfólio.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio de silenciamento gênico direcionado ou superexpressão para esclarecer a participação de vias.
- Valor Operacional: Apoia a geração rápida de modelos de perda de função e ganho de função para reduzir riscos dos alvos antes do desenvolvimento de ensaios.
- Valor Preditivo: Facilita a redução de riscos biológicos ao associar a modulação genética a desfechos fenotípicos em um sistema vertebrado relevante para a doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz embriões padronizados e geneticamente modulados adequados para leituras fenotípicas subsequentes em campanhas de triagem.
- Valor Operacional: Permite a preparação de centenas de embriões injetados por hora, apoiando formatos de ensaio escaláveis e reprodutíveis.
- Valor Traducional: Gera fenótipos quantitativos e observáveis (por exemplo, alterações morfológicas) que servem como pontos finais robustos para triagem de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Proporciona continuidade da descoberta da função gênica à validação pré-clínica, modelando variantes gênicas humanas em um contexto vertebrado.
- Valor Operacional: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao identificar fenótipos que se correlacionam com a eficácia ou toxicidade da modulação do alvo.
- Confiabilidade Preditiva: Ajuda a priorizar alvos com base na gravidade e especificidade fenotípica observadas após injeção, reduzindo falsos positivos na identificação de candidatos promissores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial da descoberta, apoiando a validação de alvos por meio de perturbação genética e permitindo a transição para triagem fenotípica e identificação de compostos líderes quando apoiado por resultados observáveis e dependentes da dose.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses ao permitir a modulação precisa da expressão gênica para avaliar a necessidade e suficiência do alvo em vias de desenvolvimento.
- Triagem: Gera sistemas biológicos prontos para ensaios com fundos genéticos padronizados para avaliação consistente de compostos.
- Análises: Permite pontuação fenotípica quantitativa (por exemplo, frequência de defeitos morfológicos) para comparar condições e avaliar efeitos genéticos ou farmacológicos.
- Pesquisa Translacional: Conecta a manipulação genética a fenótipos de desenvolvimento que modelam mecanismos de doenças humanas, apoiando a validação alinhada a biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para interrogatório iterativo de alvos em múltiplos genes e vias em projetos de portfólio.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio de perturbação genética direta em um modelo vertebrado.
- Valor Operacional: Oferece alta reprodutibilidade e escalabilidade, com capacidade de injetar centenas de embriões por hora utilizando protocolos padronizados de microinjeção.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avanço ou interrupção ao fornecer evidências fenotípicas precoces de modulação do alvo, reduzindo investimentos em alvos inviáveis.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco ao associar fenótipos específicos de genes a desfechos do desenvolvimento, orientando a alocação de capital na seleção de alvos.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manejo de zebrafish, manipulação de embriões e técnica de microinjeção para garantir viabilidade e consistência.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo microinjetores, fontes de ar, micrômetros e puxadores de agulhas, para controle preciso de volume.
- Necessita padronização do volume de injeção, qualidade das agulhas e estadiamento dos embriões entre operadores e locais para resultados reproduzíveis.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método em diferentes backgrounds genéticos ou modelos de doença, a fim de manter a relevância fenotípica.
- Inclui limitações práticas, como a sensibilidade dos embriões ao trauma da injeção e efeitos fora do alvo dependentes da concentração, exigindo otimização empírica por alvo.
