Name: Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte I: Digestão e Coleta de tecido pancreático (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Aprenda o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas para transplante usando método automatizado de perfusão com colagenase. Este protocolo demonstra digestão e coleta de tecido pancreático com alta qualidade.

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Apoiada por um financiamento da Universidade de Illinois em Chicago, assim como Cell Resource Islet Centro NIH subvenção (RFA-RR 05-003), a Fundação Christopher, a Fundação Efroymson, ea Fundação Tellabs.

1. Facilidade de instalação <ol><li> Isolamento de ilhotas humana é um procedimento sensível ao tempo que envolve o trabalho em equipe e, portanto, quatro pessoas são necessários para realizar este procedimento. A equipe é liderada pelo cirurgião, que disseca e cannulates pâncreas. </li><li> O isolamento das ilhotas começa o minuto a equipe entra na instalação de isolamento de ilhotas UIC. Membros da equipe assegurar que toda a instrumentação necessária, como a centrífuga, é verificada e ligado. Também certifique-se de higienizar todos os capuzes e superfícies. </li><li> Duas pessoas irá definir a tabela de canulação, máquina de lama, circuito digestão, unidade de perfusão, máquina de purificação COBE, e mesas cirúrgicas. </li><li> Simultaneamente, dois outros membros da equipe irá preparar os meios de comunicação que é necessária durante o isolamento. </li><li> Em seguida, os tubos de bacteriologia (garrafas, tubos, forma e saco), tubos de amostragem (pré-carregada com lavagem), e tubos e placas de avaliação estão preparados. </li><li> Prepare o tubo de purificação definido da seguinte forma: O primeiro tubo vazio e marcou a 150 ml, tubos de 2-12 preenchido com 200 ml de M199 meio suplementado com humanos (solução de lavagem) e albumina marcados em 230 ml e, finalmente, um tubo de 50 ml cônico preenchido com 50 ml de solução de lavagem. Uma vez que estas etapas de preparação estão completas estamos prontos para começar a preparar e irrigando o pâncreas. </li></ol> 2. Preparação pâncreas e perfusão <ol><li> Para começar a preparação e perfusão do pâncreas, um operador remove o órgão a partir de embalagens utilizando técnica estéril. O cirurgião fará a transferência do pâncreas para a mesa de descontaminação. </li><li> O cirurgião vai encher uma seringa de 60 ml com a solução original pâncreas preservação e entregá-lo a um operador, que irá usá-lo para preencher preparado &quot;Procurement&quot; garrafas de bacteriologia. </li><li> Depois de uma inspeção visual para determinar se o órgão é adequado para o isolamento das ilhotas (Se o pâncreas for danificado durante a colheita ou anatomicamente anormal, não pode ser utilizado para o isolamento das ilhotas), o cirurgião vai pedir um operador para preparar colagenase. Lembre-se que esse tempo re-suspensão varia entre as marcas e lotes diferentes de enzimas. </li><li> Quando o cirurgião está pronto, traga as soluções de descontaminação (Betadine, Fungizone / Cefazolina e HBSS) para a tabela de descontaminação e despeje-os em recipientes apropriados. Cirurgião realiza a descontaminação de lavagem pâncreas por um minuto do pâncreas em cada um a solução de descontaminação. O pâncreas é então colocada em um pequeno frasco esterilizado no qual ele vai ser pesado. Depois que o peso é inserido no registro do lote, o pâncreas é colocado no pan canulação com algumas solução de preservação. </li><li> O cirurgião irá expor e parcialmente inciso o duto principal e canular cada metade do pâncreas com uma cânula. A cânula será fixada por sutura. Para perfundir o pâncreas, primeiro movê-lo para a unidade de perfusão e despeje a solução enzimática para a bacia. Tempo de perfusão total é de cerca de 10 minutos, a 80 mmHg por 5 minutos, então a 180 mmHg por 5 minutos. Pâncreas distendido após a perfusão. </li><li> Mover o pâncreas perfundido para o pan canulação, onde o tecido adiposo é cortado a partir do pâncreas com cuidado. Em seguida, corte do pâncreas em 10-12 pedaços e transferência para Ricordi Câmara para a digestão. </li></ol> 3. Digestão do pâncreas <ol><li> Para começar a etapa de digestão, o pâncreas a transferência da Câmara Ricordi vazia, adicione um frasco de 2,5 ml de Pulmozyme, colocar na tela (evitar grande parte do bloco de tecido da câmara), perto da câmara, e encher o sistema. </li><li> Começar a bombear a solução por 5 minutos. Suavemente de rock da câmara para uniformemente dispersar solução quente por toda parte. Após cinco minutos, agite a câmara para a fase de digestão todo. Manter a temperatura a 37 ˚ C. </li><li> Rock na câmara suavemente até a temperatura atinge 37 °, em seguida, agitar a câmara. Tomar uma amostra a cada dois minutos e detectar se ilhotas livres são encontrados sob o escopo. Registrar as informações de avaliação de ilhotas na tabela a digestão do registro do lote. Continuar a acompanhar o percentual de ilhotas até que haja 50% deles flutuando livres e isolados na solução. </li></ol> 4. Coleta de tecido <ol><li> Uma vez que 50% das ilhotas são encontrados livres nas amostras, a digestão é interrompida pela adição de solução de diluição RPMI frio no circuito. Tecido é recolhido em tubos de 500 ml cônico pré-cheias com 30 ml de Albumina Humana. Uma vez que os tubos são giradas, aspiração de fora o sobrenadante e lavar o pellet com solução de lavagem a frio. Girar os tubos cônicos a 1100 RPM (rotações por minuto) por 1 minuto, 4 ˚ C. </li><li> Combine todos os tubos com exigibilidade suspensa tecido pancreático digerido em uma única de 500 ml. Quando um tubo está cheio de tecido lavado, spin e repita o processo de lavagem até que todo o tecido foi lavado várias vezes. Girar o tubo e transfira o tecido em um único tubo de 250 ml. Traga o volume até 250 ml comM199 solução de lavagem suplementado com HA e se preparar para a amostragem. </li><li> Tomar uma amostra de 1 ml com uma pipeta e adicionar a um tubo cônico de 15 ml pré-cheia com 9 ml de solução de lavagem. Em seguida, misture suavemente invertendo o tubo cônico de 15 ml e deste, amostra para fora 1ml diretamente em um prato grade de contagem. Contar as células, e calcular o número de células usando um fator de diluição de 2500 (10x250). </li><li> Girar o tubo de 250 ml e adicionar 150 ml de UW (University of Wisconsin) Solução que costumo usar para preservação de órgãos. Quando UW é adicionado, misture a suspensão de células, cuidadosamente, com a pipeta. Registrar e comunicar ao operador de purificação a hora de início na UW. Deixe o tubo (s) no gelo e agite ocasionalmente. Agora as ilhotas podem ser purificado ainda mais. </li></ol>

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+isolation+for+allotransplantation%3A+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li>
<li>Fridell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li>
<li>Potdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transplant%22%5BJournal%5D)">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li>
<li>Salehi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+islet+isolation+from+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).</li>
<li>Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+and+isolation+variables+predicting+human+islet+isolation+success%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor and isolation variables predicting human islet isolation success.</a> Transplantation. 85, 950-955 (2008).</li>
<li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+islet+of+Langerhans+isolation+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields.</a> Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).</li>
</ol>

Há uma variedade de fatores que afetam o resultado de isolamento 9,10. Entre eles, a digestão do tecido pancreático desempenha um papel proeminente. Baseado em nossa experiência humana de isolamento de ilhotas própria, resumimos seguintes pontos críticos, o que poderia influenciar o rendimento de ilhotas e qualidade. <ol><li> O tempo de digestão é diferente quando diferentes tipos de enzimas são utilizadas. </li><li> Assim que 40-50% das ilhotas completamente separado do tecido acinar, a digestão deve ser imediatame...

<table><tbody><tr><td>Máquina de Slush de Gelo</td><td>equipamento</td><td>Taylor Company</td><td>K4036546</td><td>fazer gelo estéril</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>equipamento</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>424803</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia Invertida MZ6 TLBD4.1</td><td>equipamento</td><td>Leica Microsystems</td><td>4103</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura Celular com Grade de 2 mm</td><td>equipamento</td><td>Nalge Nunc international</td><td>174926</td><td>contagem de ilhotas</td></tr><tr><td>Banho-Maria Digital EX7</td><td>equipamento</td><td>NesLab</td><td>105361058</td><td></td></tr><tr><td>Termômetro</td><td>equipamento</td><td>IBI:IR</td><td>60444</td><td></td></tr><tr><td>Balança MonoBloc AB 104-S</td><td>equipamento</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119430864</td><td>medir o peso do pâncreas</td></tr><tr><td>Controlador de Velocidade MasterFlex II</td><td>equipamento</td><td>Cole-Parmer</td><td>J00006445</td><td>ajustar a velocidade de fluxo durante a digestão</td></tr><tr><td>Digital Sight DS L1</td><td>equipamento</td><td>Nikon Instruments</td><td>217267</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Perfusão</td><td>equipamento</td><td>Custom Made</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Cooler para unidade de perfusão</td><td>equipamento</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013P</td><td></td></tr><tr><td>Câmara Ricordi</td><td>equipamento</td><td>University of Miami</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Solução de diluição RPMI</td><td>reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99783024</td><td></td></tr><tr><td>Solução da Universidade de Wisconsin (UW)</td><td>reagente</td><td>DURAMED</td><td>1000-46-06</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Tamponada de Hank&amp;rsquo;s (HBSS)</td><td>reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-597-CM</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Humana 25%</td><td>reagente</td><td>GRIFOLS</td><td>NDC 61953-0002-2</td><td></td></tr><tr><td>Meio M199 (solução de lavagem)</td><td>reagente</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>99-784-CM</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase NB1 grau GMP</td><td>reagente</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002937</td><td></td></tr><tr><td>Protease Neutra NB1 grau GMP</td><td>reagente</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>N0002936</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>reagente</td><td>Cardinal Health</td><td>29906-004</td><td></td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>reagente</td><td>West-Ward Pharmaceutical</td><td>NDC 0143-9924-90</td><td></td></tr><tr><td>Ditizona</td><td>reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento islet humana pancreatic: parte i: digestão e coleta de tecido pancreático

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Gestão da diabetes tipo 1 é onerosa, tanto para o indivíduo ea sociedade, custando mais de 100 bilhões de dólares anualmente. Apesar do uso generalizado de monitoramento de glicose e insulina novas formulações, muitas pessoas ainda desenvolvem devastadoras complicações secundárias. Transplante de ilhotas pancreáticas pode restaurar controle quase normais de glicose em pacientes diabéticos<sup&gt; 1</sup&gt;, Sem o risco de graves episódios de hipoglicemia que estão associados com a terapia insulínica intensiva. Fornecimento de massa de ilhotas suficiente é importante para o transplante de ilhotas bem sucedido. No entanto, características dos doadores, a colheita de órgãos e preservação afetar o resultado de isolamento<sup&gt; 2</sup&gt;. Na Universidade de Illinois em Chicago (UIC), temos desenvolvido um protocolo de isolamento bem sucedido com um gradiente de purificação melhorou<sup&gt; 3</sup&gt;. O programa foi iniciado em janeiro de 2004, e mais de 300 isolamentos foram realizados até novembro de 2008. O pancreata foram enviados em soluções frias de conservação (UW, University of Wisconsin ou HTK, histidina-triptofano Ketoglutarate)<sup&gt; 07/04</sup&gt; Para o Laboratório de Isolamento Celular na UIC para isolamento de ilhotas. Ilhotas pancreáticas foram isolados utilizando o método de UIC, que é uma versão modificada do método originalmente descrito por Ricordi<em&gt; Et al</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. Resumidamente, após a limpeza do pâncreas do tecido circundante, foi perfundido com solução enzimática (Serva Colagenase + Neutro Protease ou enzima Sigma V). O pâncreas distendido foi então transferido para a câmara de digestão Ricordi, conectado a um sistema modificado de tubulação, fechada a circulação, e aquecido a 37 ° C. Durante a digestão, a câmara foi agitada suavemente. As amostras foram tomadas de forma contínua para monitorar o progresso digestão. Uma vez livre ilhotas foram detectadas ao microscópio, a digestão foi parado por lavagem a frio (4 ° C) RPMI solução de diluição (Mediatech, Herndon, VA) para o sistema de circulação para diluir a enzima. Depois de ser coletados e lavados em M199 meio suplementado com albumina humana, o tecido foi amostrado para a purificação de pré-contagem e incubadas com solução de UW antes de purificação. Processo de purificação serão descritos na Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos.

Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte I: a digestão e coleta de tecido pancreático), utilizando um método modificado automatizado.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte I: Digestão e Coleta de tecido pancreático

O manejo do diabetes tipo 1 é oneroso, tanto para o indivíduo quanto para a sociedade, custando mais de 100 bilhões de dólares anualmente. Apesar do uso generalizado de...

Este procedimento começa com a obtenção de tecido pancreático de doador normal. Após uma breve etapa de escarificação, o pâncreas distendido é cortado em pedaços uniformes e transferido para a câmara de digestão. O pâncreas é canulado e uma solução de colagenase é infundida através da cânula por uma máquina de perfusão automatizada.Por fim, o tecido pancreático é coletado em tubos cónicos de grande volume e, posteriormente, purificado para transplante de ilhotas, o que será demonstrado em um vídeo subsequente. Olá, sou American Chief do Laboratório do Programa de Ilhotas Humanas do Departamento de Pesquisa da Universidade de Illinois em Chicago. Olá, meu nome é Barbara Barbero e também faço parte do Programa de Ilhotas Humanas.Hoje vamos mostrar um procedimento para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas. Utilizamos este procedimento em nossa instalação para obter ilhotas humanas de alta qualidade para uso clínico. Vamos começar.O isolamento de ilhotas humanas é um procedimento sensível ao tempo que envolve trabalho em equipe, sendo necessários quatro indivíduos para realizá-lo. A equipe é liderada pelo cirurgião, que realiza a dissecação e a cânula do pâncreas. O isolamento de ilhotas começa no minuto em que a equipe entra na instalação de isolamento de ilhotas da UIC.Os membros da equipe garantem que toda a instrumentação necessária, como a centrífuga, seja verificada e ligada. Também se asseguram de higienizar todas as capelas e superfícies. Duas pessoas montarão a mesa de cânulação, a digestão com máquina de gelo, a perfusão do circuito, a máquina de purificação de unidades cope e as mesas cirúrgicas.Simultaneamente, dois outros membros da equipe prepararão o meio necessário durante o isolamento. Em seguida, são preparados os tubos de bacteriologia, tubos de coleta e tubos e placas de avaliação. Prepare o conjunto de tubos de purificação da seguinte forma: o primeiro tubo vazio e marcado em 150 mililitros.Tubos de dois a 12 preenchidos com 200 mililitros de meio M1 99. Meio suplementado com albumina humana ou solução de lavagem e marcado em 230 mililitros. E, finalmente, um tubo cônico de 50 mililitros preenchido com 50 mililitros de solução de lavagem.Uma vez concluídas essas etapas de preparação, estamos prontos para iniciar a preparação e a perfusão do pâncreas. Para começar a preparação e a perfusão do pâncreas, um operador retira o órgão da embalagem. Utilizando técnica estéril, o cirurgião transferirá o pâncreas para a mesa de descontaminação.O cirurgião encherá uma seringa de 60 cc com a solução original de preservação do pâncreas e a entregará a um operador, que a usará para preencher frascos de bacteriologia de coleta preparados. Após uma inspeção visual para determinar se o órgão é adequado para o isolamento de ilhotas, o cirurgião pedirá a um operador que prepare a colagenase no dia. Preparar é um ato completo.Se o pâncreas estiver danificado durante a obtenção ou apresentar anatomia anormal, não poderá ser utilizado para o isolamento de ilhotas. Lembre-se de que o tempo de suspensão em Resus varia entre diferentes marcas e lotes de enzimas. Quando o cirurgião estiver pronto, leve as soluções de descontaminação até a mesa de descontaminação e despeje-as nos recipientes apropriados.O cirurgião irá descontaminar o pâncreas lavando-o por um minuto. Em cada uma das soluções de descontaminação, o pâncreas é então colocado em um pequeno frasco estéril no qual será pesado. Após o peso ser inserido no registro do lote, o pâncreas é colocado na bandeja de cânulação.Com alguma solução de preservação, o cirurgião expõe e faz uma incisão parcial no ducto principal e canula cada metade do pâncreas com uma cânula fixada por sutura para perfundir o pâncreas. Primeiro, transfira-o para a unidade de perfusão e despeje a solução enzimática na bacia. O tempo total de perfusão é de aproximadamente 10 minutos a 80 milímetros de mercúrio durante cinco minutos.Em seguida, a 180 milímetros de mercúrio durante cinco minutos, o pâncreas parecerá distendido. Após a perfusão, transfira o pâncreas perfundido para a bandeja de cânulação, onde o tecido adiposo é cuidadosamente removido do pâncreas. Em seguida, corte o pâncreas em 10 a 12 pedaços e transfira-o para a câmara de digestão.Para iniciar a etapa de digestão, transfira o pâncreas para a câmara de registro vazia. Adicione um frasco de um mililitro e meio de pulmozima colocado na tela, tomando cuidado para não obstruir a câmara, feche a câmara e complete o sistema. Inicie a bombagem da solução por cinco minutos.Balançar suavemente a câmara para dispersar uniformemente a solução morna por toda a região. Após cinco minutos, agitar suavemente a câmara durante toda a fase de digestão. Manter a temperatura a 37 graus Celsius.Colete uma amostra a cada dois minutos e verifique, sob microscópio, se há olhinhos livres; registre as informações de avaliação dos olhinhos na tabela de digestão do registro do lote. Continue monitorando a porcentagem de olhinhos até que 50% deles estejam flutuando livres e isolados na solução. Assim que for constatado que 50% dos olhinhos estão livres nas amostras, interrompa a digestão adicionando solução diluente RPMI fria.O tecido do circuito é coletado em tubos cónicos de 500 mililitros pré-preenchidos com 30 mililitros de albumina humana. Centrifugue os tubos cónicos a 1100 RPM durante um minuto a quatro graus Celsius.Após a centrifugação dos tubos, aspire o sobrenadante e lave o pellet. Com a solução de lavagem fria, reúna todos os tubos de coleta suspensos com tecido pancreático digerido em um único cônico de 500 mililitros. Quando um tubo estiver cheio de tecido lavado, centrifugue e repita o processo de lavagem até que todo o tecido tenha sido lavado várias vezes.Centrifugue este tubo e transfira o tecido para um único tubo cônico de 250 mililitros. Complete o volume para 250 mililitros com solução de lavagem M1 99, suplementada com albumina humana, e prepare para a coleta de amostra. Colete uma amostra de um mililitro com uma pipeta e adicione a um tubo cônico de 15 mililitros previamente preenchido com nove mililitros de solução de lavagem.Em seguida, misture suavemente invertendo o tubo cônico de 15 mililitros. E a partir dessa amostra, transfira um mililitro diretamente para uma câmara de contagem. Conte as células e calcule o número de células.Usando um fator de diluição de 2, centrifugue o tubo cônico de 250 mililitros e adicione 150 mililitros de uw. Solução da Universidade de Wisconsin. Quando a UW for adicionada, homogeneíze completamente a suspensão celular usando o pipetador e registre, comunicando ao operador de purificação.O tempo inicial em uw. Deixe os tubos no gelo e agite ocasionalmente. Agora, as argolas podem ser purificadas adicionalmente nesta etapa; uma amostra de tecido pancreático não purificado é coletada para contagem.Quando a solução de dione é adicionada à amostra, apenas a população de ilhotas será corada em vermelho. Em seguida, sua qualidade e quantidade podem ser avaliadas. Acabamos de demonstrar um procedimento para o isolamento de um grande número de ilhotas pancreáticas humanas de qualidade, o que é importante para o transplante bem-sucedido de ilhotas.Com base em nossa experiência, assim que 40 a 50% dos ilhotes humanos estiverem livres do tecido circundante, é necessário interromper a digestão o mais rápido possível diluindo e também resfriando a mistura de digestão. Também é importante manipular o tecido com cuidado durante a coleta, lavagem e mistura. Recomendamos utilizar o método de purificação University of Chicago, que resulta em uma recuperação superior de ilhotes humanos altamente puros.Este método também reduziu significativamente o tempo de isolamento, o que minimizará os danos associados à isquemia no olhete. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte II: purificação e cultura de ilhotas humanas) utilizando um método modificado automatizado.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos

O fornecimento de diabéticos tipo 2 ilhotas para pesquisa é insuficiente. Aqui nós compartilhamos nosso protocolo para isolar ilhotas de pacientes submetidos à pancreatectomia parcial. Esta abordagem representa um local único para a obtenção de ilhotas de diabéticos tipo 2 e clinicamente combinado não-diabéticos em número adequado para estudos básicos e clínicos.

Isolamento de Ilhotas Humanos de pacientes parcialmente pancreatectomizado

As ilhotas pancreáticas, também chamadas de ilhotas de Langerhans, são um aglomerado de células endócrinas que produzem hormônios para a regulação da glicose e outras funções biológicas importantes. Este protocolo explica um método para isolar ilhotas pancreáticas pela primeira vez perfundindo colagenase via ampola de Vater para digerir o tecido pancreático exócrino e uma centrifugação simplificada com gradiente de densidade para purificar as ilhotas de camundongos.

Isolamento de ilhotas pancreáticas por meio de perfusão de colagenase: um método enzimático para isolar células de ilhotas pancreáticas

desafios críticos para o campo de pesquisa do diabetes estão a compreender os mecanismos moleculares que regulam a replicação de células β dos ilhéus e desenvolver métodos para estimular a regeneração de células-β. Aqui um método de alto teor de rastreio para identificar e avaliar a actividade de promoção da replicação de células β de moléculas pequenas é apresentada.

A-alta conteúdo<em&gt; In Vitro</em&gt; Replicação plataforma de descoberta de células-β das ilhotas pancreáticas

Nós descrevemos um protocolo aqui para isolar ilhotas intactas de ratos recém-nascidos. Pâncreas foi parcialmente digerido com colagenase, seguido por lavagem e colheita manual. 20 - 80 agrupamentos de ilhéus podem ser obtidos por pâncreas de ratinhos recém-nascidos, que são adequados para vários estudos da ilhota.

Isolamento eficaz de ilhotas funcionais a partir de ratinho neonato Pâncreas

Este protocolo da isolação da ilhotas descreveu uma rota nova da injeção do colagenase para digerir o tecido exócrina e um procedimento simplificado do inclinação para purificar os ilhotas dos ratos. Envolve a digestão enzimática, separação de gradiente/purificação, e Islet mão-picking. O isolamento bem-sucedido pode produzir 250 – 350 de alta qualidade e ilhotas totalmente funcionais por mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Aqui, nós apresentamos um protocolo para gerar de alta qualidade, dados do transcriptoma em grande escala das únicas pilhas das ilhotas pancreatic humanas isoladas usando uma tecnologia de sequenciamento microfluídico do RNA da único-pilha da gota-baseada.

Sequenciamento de RNA de célula única e análise de ilhotas pancreáticas humanas

As células metaplásicas pancreáticas são precursoras de células malignas que dão origem a tumores pancreáticos. No entanto, isolar células pancreáticas viáveis intactas é um desafio. Apresentamos aqui um método eficiente para dissociação do tecido pancreático. As células podem então ser usadas para sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) ou para co-cultivo bidimensional ou tridimensional.

Dissecção do tecido pancreático para isolar células únicas viáveis

Este estudo desenvolveu um método simplificado para extrair eficientemente ilhéus primários funcionais e células acinares do pâncreas do camundongo, oferecendo uma ferramenta valiosa para estudar a comunicação intercelular na patogênese do Diabetes Induzido por Pancreatite Aguda.

Um método simples e rápido para isolamento simultâneo de ilhotas primárias e células acinares pancreáticas primárias de camundongos

Este protocolo descreve um método padronizado para colheita cirúrgica, digestão enzimática e purificação por gradiente de densidade de ilhéus pancreáticos de rato Lewis, permitindo preparações de alto rendimento e alta pureza para uso direto em transplantes ou estudos in vitro .

Isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas a partir de ratos Lewis usando digestão enzimática e separação por gradiente de densidade

Aprenda o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas para transplante usando método automatizado de perfusão com colagenase. Este protocolo demonstra digestão e coleta de tecido pancreático com alta qualidade.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte I: Digestão e Coleta de tecido pancreático

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