Monitoramento hormônios vegetais Durante Respostas ao Estresse

Este procedimento inicia-se com a homogeneização do material vegetal utilizando esferas de cerâmica e extração subsequente com metano de dicloro para obter a fase orgânica. Após a centrifugação, as amostras são secas ao ar e preparadas para extração em fase vapor. Após a eluição dos filtros da extração em fase vapor, pode-se prosseguir com a análise de hormônios vegetais utilizando espectrometria de massas e cromatografia gasosa.

Olá, sou Marie Engelberg do Laboratório JU Engelberg do Departamento de Biologia da Universidade do Texas aqui em San Antonio, e eu sou Ju Engelberg. Hoje vamos mostrar um procedimento simples para a quantificação simultânea de hormônios vegetais importantes. Utilizamos esse método rotineiramente para monitorar alterações nesses hormônios em plantas submetidas à técnica de recompensa com insetos.

Também podemos monitorar alterações na composição de ácidos graxos. Então, vamos começar. Para a extração, você precisa primeiro preparar frascos com tampa de rosca de dois mililitros.

Para fazer isso, adicione 400 microlitros de solução de extração e 10 microlitros do respectivo padrão interno a 10 nanogramas por microlitro a um frasco. Em seguida, congele os frascos em nitrogênio líquido. Após o congelamento, adicione as esferas cerâmicas aos frascos.

Enquanto os frascos ainda estiverem posicionados em nitrogênio líquido, adicione o material vegetal entre 50 e 200 miligramas. Tenha em mente que o peso do material vegetal adicionado precisa ser estimado antes do processamento adicional para permitir a quantificação exata posterior, que é baseada no peso fresco. Certifique-se de que todo o nitrogênio líquido tenha evaporado antes de fechar firmemente o frasco com uma tampa.

Certifique-se de que a tampa possui uma vedação de borracha para evitar derramamentos de solventes e compostos extraídos durante a homogeneização. Homogeneíze o tecido em um homogeneizador rápido ou moinho de esferas PSUs. Utilize o homogeneizador a uma velocidade de 6.000 para PSUs durante 30 segundos.

Uma vez homogeneizado, retire os frascos do homogeneizador individualmente e abra cuidadosamente a tampa para adicionar um mililitro de diclorometano a cada amostra, feche novamente os frascos firmemente e homogeneíze por 10 a 15 segundos a 6.000, após a homogeneização, transfira os frascos para uma centrífuga de bancada e separe a fase orgânica da fase aquosa a 10.000 vezes G durante 60 segundos. Após a separação das fases, transfira a camada verde inferior dos frascos individuais para um frasco de vidro limpo de quatro mililitros.

Esta é a fase orgânica contendo os hormônios e os padrões internos. Evite a transferência de água ou da fase superior; remova o solvente com fluxo de ar por meio de um manifold por cerca de 10 a 25 minutos. A duração dependerá da amostra.

Verifique com uma ponta de fluxo de ar para observar cuidadosamente se as amostras estão secas. Certifique-se de não secar em excesso as amostras, pois isso pode causar perda de compostos. Uma vez que as amostras estejam secas, podemos iniciar a metilação dos compostos contendo ácido carboxílico nas nossas amostras.

Primeiro, adicione 100 microlitros de uma mistura de éter etílico e metanol na proporção de nove para um, volume por volume, a cada vial. Em seguida, adicione quatro microlitros de uma solução de diazometano trimetil Cyl 2 M em hexano. Feche imediatamente os viais com uma tampa rosqueável de topo aberto equipada com septo de silicone revestido com teflon e agite suavemente os viais, incubando-os à temperatura ambiente por 25 a 30 minutos.

Ligue um bloco de aquecimento e ajuste-o à temperatura desejada de coleta. A volatilidade dos compostos metilados variará conforme seu tamanho e número de grupos polares. As temperaturas podem variar entre 80 e 200 graus; após uma incubação de 30 minutos, interrompa a reação de metilação adicionando quatro microlitros de uma solução de ácido acético dois molar em hexano a cada vial.

Isso é feito para evitar reações secundárias indesejadas. Os filtros utilizados para a extração da fase vapor são feitos à mão. São fabricados a partir de tubos de teflon.

De um lado, insere-se um tubo de vidro bem ajustado com cerca de quatro centímetros de comprimento. Você pode ver os dois discos de malha de aço inoxidável, que contêm cerca de 20 a 30 miligramas de agente absorvente. Lave os filtros que serão usados para a coleta dos hormônios vegetais metilados e voláteis utilizando 200 microlitros de metanol.

Em seguida, lave os filtros duas vezes com 200 microlitros de diclorometano. Deixe secar ao ar para remover o solvente restante dos filtros. Os filtros agora podem ser utilizados para a captura de hormônios voláteis por extração em fase vapor.

Após 30 minutos de incubação das amostras, as septas de borracha das tampas dos frascos de quatro mililitros são cortadas com um bisturi. Agora, o material extraído está pronto para ser coletado a fim de recuperar os hormônios vegetais por extração em fase vapor. Os filtros limpos são conectados a linhas de vácuo individuais com uma vazão de aproximadamente 800 mililitros por minuto.

Os filtros são então inseridos no frasco através das septas cortadas. Uma ponta de pipeta pequena também é inserida para atuar como entrada de ar. Durante esta parte inicial do procedimento, os frascos com os filtros inseridos devem ser mantidos em posição vertical para evitar que qualquer líquido dentro do frasco entre em contato com a ponta do filtro, o que contaminaria o filtro.

Em seguida, segure manualmente os frascos no CG-EM até que todo o líquido seja evaporado através do filtro. Então, coloque os frascos com os filtros acoplados sobre o bloco de aquecimento e colete os compostos evaporados por calor durante três minutos. Após esta etapa final de extração na fase vapor, coloque os frascos com os filtros ainda acoplados em um suporte e deixe esfriar.

Prepare frascos de GC de 1,5 mililitro equipados com inserções quando os filtros atingirem a temperatura ambiente. Novamente, adicione com uma alça 150 microlitros de diclorometano aos frascos. Após expelir o solvente remanescente do filtro, os frascos são tampados e podem agora ser analisados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas.

Para análise, utilize um cromatógrafo a gás equipado com um injetor do tipo split-splitless acoplado a um espectrômetro de massas operado em modo de ionização química; após a injeção, os compostos são separados em uma coluna HP-1 MS mantida a 40 graus Celsius por um minuto. A temperatura é programada com aumento de 15 graus Celsius por minuto até 250 graus Celsius, mantida por 10 minutos, com hélio como gás de arraste em fluxo constante de 0,7 mililitros por minuto. Para a análise baseada em espectrometria de massas, tanto um espectrômetro de massas com quadrupolo quanto com armadilha iônica podem ser utilizados como gás de CI.

Pode-se usar isobutano ou metanol. No entanto, em cada caso, os fragmentos da reação de ionização devem ser verificados antes da criação dos programas de contagem de íons selecionados. Utilizamos um sistema cromatográfico a gás modelo GC 3,900 acoplado a um espectrômetro de massas Saturn MS 2200, com metanol como reagente de ionização química.

Consulte nosso protocolo escrito para obter uma descrição do nosso programa. Certifique-se de que todos os compostos sejam identificados por comparação com padrões autênticos comercialmente disponíveis. A quantificação de JA, SA e ABA é realizada correlacionando a área do pico dos íons extraídos com a área do pico dos íons extraídos do respectivo padrão interno e também com base no peso fresco do material vegetal utilizado.

Após extrair os dados dos arquivos GCM S e realizar alguns cálculos, descobrimos que o ethin induziu acúmulos consideráveis de ácido salicílico, ácido monico e também ácido abscísico em comparação com os controles não tratados. Os dados para cada hormônio individual foram obtidos de uma única corrida e demonstram a capacidade deste método para análise multiplexa de hormônios. Acabamos de mostrar um procedimento simples, mas eficaz, para extrair e quantificar hormônios vegetais importantes e outros compostos sinalizadores.

É fácil de realizar e a maioria das ferramentas que você viu pode ser facilmente fabricada com materiais de laboratório comuns. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.