Channelrhodopsin2 Estimulação Mediated de Potenciais Synaptic em Drosophila Junções Neuromusculares

Este procedimento começa com o crescimento da drosófila. Terceiro, larvas de ínstar com o genótipo apropriado em alimentos contendo todo o retinol trans. Cada larva é presa na cabeça e na cauda.

Em seguida, FLA plana. O cérebro e os nervos posteriores são então cortados para interromper a atividade motora rítmica. Em seguida, a fonte de luz LED azul com caixa de controle é ajustada e focada na preparação.

Finalmente, use um eletrodo afiado para empalar o músculo seis. Em seguida, forneça pulsos de luz com uma fonte de tensão. Olá, sou Nicholas Marstein, do laboratório da Dra. Leslie Griffith, do Departamento de Biologia da Brandeis University.

Olá, sou Stefan Pulver, também do Griffith Lab. Hoje mostraremos o procedimento para evocar potenciais sinápticos com raiz do canal ausente dois na junção neuromuscular da larva de drosófila. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar fisiologia sináptica e drosófila.

Também o usamos para ensinar aos alunos fisiologia sináptica e laboratórios de ensino. Então vamos começar. Para começar com este protocolo, mantenha o canal UAS redsin dois e ok, 3 7, 1 gal quatro linhas de mosca em frascos separados contendo mídia de mosca padrão.

Colete virgens do, ok, 3 7, 1 gal, quatro linhas de mosca e machos do canal UAS redsin. Duas linhas. Em seguida, faça um meio de mosca misturado com um milimolar, todo trans retinol ou um TR.To faça isso derreter o meio de mosca regular no micro-ondas por aproximadamente um minuto.

Depois de derretido, deixe o meio esfriar por cerca de 30 a 60 segundos e, em seguida, adicione 100 microlitros de 100 milimolares a TR em 100% de etanol para cada 10 mililitros de meio de mosca. Quando os frascos contendo um meio TR estiverem prontos, coloque os machos e fêmeas coletados em cada frasco. Coloque os frascos em uma área escura a 22 a 25 graus Celsius para permitir que as moscas acasalem e ponham ovos, espere de quatro a cinco dias até que a larva da terceira estrela seja visível.

Neste ponto, você pode descartar as moscas adultas. Agora estamos prontos para prosseguir com a montagem do equipamento de eletrofisiologia. Conecte qualquer ocular de osciloscópio de dissecação a uma fonte de luz LED azul com um dissipador de calor.

Use um poste e clamp para prender uma base magnética à ocular e à fonte de luz LED. Coloque a base magnética na mesa de ar do equipamento de eletrofisiologia. Em seguida, conecte a fonte de luz a um circuito de controle e, em seguida, conecte o circuito de controle a uma fonte de tensão externa.

Usamos a saída de tensão do sistema de aquisição de dados de eletrofisiologia do laboratório de energia feito por instrumentos ad. Uma vez conectado à fonte de tensão, dê pulsos de um a cinco volts ao circuito de controle para ativar a luz azul, ajuste a base magnética e a fonte de luz até que o feixe de luz azul seja focado na área a ser ocupada pela dissecção larval. Depois de fazer os devidos ajustes, estamos prontos para passar para a dissecção larval.

Para começar com a dissecação, coloque seis pinos de 0,1 milímetro no chão de um prato forrado de sogar. Remova um terço das larvas estrela do meio alimentar e coloque-o em qualquer placa de Petri de plástico. Lave as larvas com soro fisiológico para remover qualquer alimento que esteja preso às larvas.

Em seguida, coloque as larvas no prato de dissecação perto dos pinos puxados e encha o prato até a metade com solução salina. Agora oriente as larvas para que você possa ver dois tubos prateados correndo ao longo da superfície dorsal do animal. Esses tubos prateados são a traqueia.

Insira um pino grande diretamente na cauda entre os tubos traqueais. Segure as larvas e coloque um segundo alfinete grande em sua cabeça. Certifique-se de esticar o corpo longitudinalmente quando o pino for inserido.

Use uma tesoura para fazer uma pequena incisão perto da cauda. Continue a incisão ao longo do corpo. Certifique-se de que as pontas da tesoura estejam levantadas para evitar cortar os nervos ventrais e/ou os músculos da parede corporal.

Coloque quatro alfinetes nos quatro cantos dos animais. Agora abra a seção intermediária. Coloque os alfinetes no prato de dissecação para filetar o animal.

Além disso, prenda a preparação para que seja ensinada com pinças e tesouras. Remova os órgãos digestivos, a traqueia e os corpos gordurosos do animal. Enxágue a preparação com solução salina.

Após o enxágue, localize os lobos frontais e o gânglio ventral da preparação usando uma microtesoura. Corte cuidadosamente o gânglio ventral logo atrás dos lobos frontais. Quando a dissecção estiver concluída, prossiga com a estimulação da luz azul e o registro muscular.

Para realizar a gravação muscular, puxe um eletrodo de resistência de 10 a 20 mega ohms. Usando um extrator de eletrodo eletrônico, preencha o eletrodo puxado com KCL de três molares. Coloque o eletrodo cheio no suporte do eletrodo.

Agora coloque a preparação larval sob um microscópio de dissecação na plataforma. Ajuste a luz azul para que a preparação dissecada fique centralizada no feixe de luz. Identifique o músculo seis ou M seis em qualquer segmento da parede corporal da larva usando um micromanipulador, insira cuidadosamente o eletrodo em M seis e observe a hiperpolarização rápida do músculo.

Os potenciais de membrana em repouso devem estar em qualquer lugar de 30 milivolts negativos a 70 milivolts negativos. Assim que o eletrodo estiver inserido corretamente, forneça pulsos de tensão de 20 a 100 milissegundos ao circuito de controle. Aumente incrementalmente a tensão fornecida ao circuito de controle.

Observe os potenciais de junção exci na célula muscular. Aqui está um resultado representativo que mostra um potencial de junção exci evocado por pulsos de luz curtos. A amplitude do potencial de junção exci mostrada aqui é a amplitude somada de dois neurônios motores que são conhecidos por comer.

M seis. Intensidades mais baixas ou durações mais curtas de luz podem expor o potencial de junção excitatória de menor amplitude de um único neurônio motor. Acabamos de mostrar como realizar a via do canal sem estimulação mediada por dois potenciais sinápticos na junção neuromuscular oph.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de não danificar a parede corporal da preparação durante a dissecção. Também é importante lembrar que, embora uma preparação possa ser superexcitada logo após uma dissecação, ela se acalmará com o tempo e permitirá boas gravações. Ao empalar os músculos, tome cuidado para não ir abaixo da primeira camada de músculos na parede do corpo.

Quando seu eletrodo está preso na parede do corpo. Às vezes, você pode obter potenciais hiperpolarizados, mas não estar realmente em uma célula muscular. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.