Fabricação de Miogênica Constrói engenharia de tecidos

Este procedimento começa com a coleta de tecido muscular esquelético de Lewis Wraths neonatais. A partir desse tecido, isolamos células mioblastas. Esses mioblastos são cultivados em placas de cultura de tecidos por dois dias e, em seguida, coletados e misturados a uma mistura de matriz tecidual à base de colágeno.

Essa mistura é cuidadosamente pipetada para dentro de um molde submerso em meio de cultura e incubada a 37 graus Celsius. Olá, sou Christina Pesach do laboratório de Douglas Cowan, do Departamento de Anestesiologia do Hospital Infantil, Boston, e da Escola Médica de Harvard. Hoje mostraremos a vocês um procedimento para criar tecido engenheirado miogênico.

Utilizamos este procedimento para fabricar um tecido projetado para inserção no coração. Nosso objetivo é criar uma conexão elétrica entre as câmaras superiores e inferiores do coração como uma terapia alternativa à implantação de marcapasso cardíaco em crianças com bloqueio cardíaco completo. Então, vamos começar.

No construto, o molde de fundição é utilizado para fornecer uma forma ao construto tecidual à base de colágeno que será cirurgicamente implantado. Neste vídeo, o processo de criação de construtos teciduais engenheirizados contendo mioblastos esqueléticos é descrito em um vídeo complementar. A implantação cardíaca do tecido celularizado produzido neste protocolo é demonstrada.

Um molde de tecido pode ser confeccionado em praticamente qualquer formato ou tamanho para atender aos requisitos fisiológicos de qualquer coração para o qual o tecido seja projetado. Nesta demonstração, o molde formará um fragmento de tecido que pode ser cortado para se encaixar no sulco AV de um coração de rato adulto. Comece a construir o molde utilizando uma lâmina de barbear para cortar o tubo de silicone em pedaços de três centímetros de comprimento e, em seguida, divida cada pedaço ao meio no sentido longitudinal.

Corte um pequeno pedaço de malha de poliéster. Em seguida, coloque uma gota de adesivo de silicone RTV de grau implantável na parte interna da extremidade do tubo. Tente manter a quantidade de adesivo depositada no mínimo, pois ele é levemente tóxico para células cultivadas.

Coloque rapidamente um pequeno pedaço de malha de poliéster sobre a gota de adesivo de silicone e alinhe-o com a extremidade do tubo. Isso proporcionará uma superfície levemente elevada e plana para a fixação do constructo. Repita o processo para a outra extremidade do tubo.

Deixe o molde secar à temperatura ambiente por três dias. É útil produzir de 20 a 30 moldes de cada vez, pois esses são essencialmente descartáveis. Uma vez que o adesivo esteja completamente seco, para ajudar na esterilização dos moldes, armazene-os em um recipiente contendo etanol 70% até que sejam necessários, com os moldes já preparados.

Em seguida, verifique se todas as soluções necessárias também estão prontas para uso para o isolamento celular. Prepare uma solução diluída de laminina com um miligrama de laminina em 250 mililitros de PBS esterilizado por filtração em filtro de 0,2 mícron, contendo antibióticos e um fungicida.

Em seguida, recubra placas de cultura de tecidos de 150 milímetros com quatro mililitros da solução diluída de laminina e incube-as a 37 graus Celsius por pelo menos quatro horas antes do uso. Duas outras soluções também devem ser preparadas: o meio de mioblastos e a solução de digestão do músculo esquelético.

Consulte a parte textual do protocolo para suas formulações. Filtre. Estilize o tampão de digestão utilizando um disco de filtro de 0,2 mícron acoplado a uma seringa de 10 mililitros. Aliquotas do tampão de digestão podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius.

Estime que você precisará de cinco mililitros de tampão de digestão por ninhada de rato Lewis. Incube a quantidade necessária de tampão de digestão de tecido e 10 mililitros de meio de mioblastos a 37 graus Celsius. E prossiga com a dissecação dos filhotes de rato.

Primeiro, obtenha pelo menos uma ninhada de ratos Lewis neonatos sacrificados utilizando pinça e tesoura pequena. Remova os músculos paravertebrais de ratos Lewis neonatos mortos cortando ao longo da coluna vertebral, puxando para trás as camadas de pele e fáscia e, em seguida, excisando os músculos. Coloque os músculos excisados em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 40 mililitros de H-B-S-S 1X em gelo.

Deixe as tiras musculares sedimentarem no fundo do tubo e remova cuidadosamente a maior parte do líquido e resíduos sanguíneos por sucção a vácuo com uma pipeta Pasteur estéril em uma cultura. Em seguida, despeje os fragmentos musculares colhidos em uma placa de cultura de 150 milímetros e aspire o máximo possível do líquido remanescente. Usando duas lâminas de barbear de corte simples, pique o tecido até formar uma pasta espessa.

A pasta muscular será digerida em uma solução de digestão previamente aquecida. Despeje parte da solução de digestão sobre a pasta muscular e transfira a mistura de solução e pasta muscular para um tubo novo de 50 mililitros. Usando uma pipeta de 10 mililitros, geralmente para digestão eficiente dos músculos de três litros de ratos Lewis, utilizamos de 10 a 15 mililitros de solução.

Coloque o tubo em uma plataforma oscilante e realize a digestão a 37 graus Celsius por cerca de 30 minutos. Durante a digestão enzimática, o tecido é ocasionalmente trid sem formação de bolhas. Com uma pipeta de 10 mililitros acoplada a uma pipeta sem fio.

Uma vez que o músculo esteja liquefeito, passe a solução através de um filtro celular de 70 mícrons. Em seguida, centrifugue as células filtradas à temperatura ambiente por 10 minutos a 600 G; com uma pipeta de Pasteur e sucção, aspire o máximo possível do líquido e re-suspenda o pellet em 10 mililitros de meio para mioblastos morno. Incube as células em uma placa de cultura de tecidos não revestida de 150 milímetros por 15 minutos para auxiliar na remoção de quaisquer fibroblastos, já que eles se aderem mais rapidamente que os mioblastos.

Coloque a placa em um incubador umidificado ajustado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Retire a placa do incubador e transfira as células que ainda não se aderiram ao cultivo revestido com Lamin. Incube-as e dilua-as em meio de mioblastos de forma que haja uma placa para cada um a dois filhotes de rato.

Se as células forem semeadas em densidade excessiva, elas se diferenciarão em tubos miotubulares. Por fim, deixe as células crescerem em um ambiente umidificado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após um a dois dias de incubação, as células estarão prontas para serem moldadas em construtos teciduais.

Após um a dois dias de incubação, retire quatro das placas de cultura de tecidos de 150 milímetros de mioblastos do incubador. Não espere mais de 48 horas, ou os fibroblastos irão dominar a população de mioblastos. Aspire o meio das células.

Em seguida, lave as células duas vezes com um XPBS aquecido a 37 graus Celsius para destacar os mioblastos da placa e adicione quatro mililitros de solução aquecida de tripsina-EDTA 0,05% a cada placa, retornando as placas ao incubador por cinco minutos. Recolha os mioblastos na cabine de cultura e colete o líquido em um tubo de 50 mililitros. Utilize 10 mililitros de meio para mioblastos para lavar todas as placas e combine este meio com as células no tubo de centrífuga.

Centrifugue as células à temperatura ambiente por 10 minutos a 600 G e aspire o excesso de líquido tanto quanto possível. Agora, ressuspenda os mioblastos em 1,4 mililitros de meio para mioblastos e coloque-os no gelo. Usando pinças cuidadosamente, remova um molde de construção do banho de etanol e enxágue-o duas vezes por imersão em PBS 1X, aspirando todos os vestígios de PBS com uma pipeta de Pasteur antes de colocar o molde em um poço vazio de uma placa de cultura de tecidos de seis poços.

Neste momento, uma solução deve ser formulada. Colete os seguintes reagentes sobre gelo. 10 x hams F 10 fungo zona penicilina estreptomicina.

Células de colágeno tipo um ressuspendidas em meio de mioblastos, bicarbonato de sódio e gel. Combine os reagentes de acordo com o protocolo escrito. Vortexie a mistura por 20 segundos; ela ficará rosa.

Observe que as variedades de colágeno tipo um disponíveis comercialmente têm um efeito variável sobre a mistura, solidificação e consistência. No produto final. Retorne o tubo para o balde de gelo por alguns minutos para eliminar as bolhas da solução.

É que o colágeno tipo I não é irradiado, caso contrário não irá gelatinizar. Aqui utilizamos um produto derivado da pele de ovelha. Antes que a mistura solidifique, despeje cuidadosamente a mistura dentro do molde na placa de cultura.

Cada molde conterá aproximadamente um mililitro do líquido viscoso. Tente evitar a introdução de bolhas de ar durante este procedimento. Transfira cuidadosamente a placa contendo os moldes do constructo para a estufa a 37 graus Celsius.

À medida que a mistura solidifica, ela muda de cor de rosa escuro para rosa claro, enquanto o molde solidifica; aqueça um pouco do meio de mioblastos a 37 graus Celsius. Após cerca de meia hora de incubação, submerja cuidadosamente cada constructo tecidual no meio de mioblastos aquecido e retorne a placa ao incubador. Quando este protocolo é executado corretamente, o constructo tecidual contendo mioblastos está pronto para implante in vivo ou para análises adicionais.

Após dois dias de incubação, acabamos de mostrar como fabricar um constructo engenharizado de tecido miogênico. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter todos os reagentes necessários para a solução do constructo em gelo, para evitar a solidificação prematura. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.