Name: Fabricação de Miogênica Constrói engenharia de tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Aprenda a fabricar construtos de tecido à base de colágeno contendo mioblastos esqueléticos para engenharia de tecidos cardíacos. Este método demonstra a criação de condutos elétricos atrioventriculares para reparo de bloqueio cardíaco completo.

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Este trabalho é suportado por verbas de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde (HL068915; HL088206), o Prêmio Pesquisador Nova do Fundo de Investigação Thrasher, e contribuições para o Fundo de Condução Cardíaca do Hospital Infantil de Boston.

Parte 1: Montar construir moldes de fundição <ol><li> Use uma lâmina de barbear para cortar pela metade tubos de silicone (VWR) e corte-o em três pedaços cm de comprimento. </li><li> Coloque uma gota de implante de silicone RTV-grade adesiva (Rhodia) no interior de cada extremidade do tubo. </li><li> Colocar rapidamente um pequeno pedaço (1 cm x 1 cm) de poliéster malha (McMaster-Carr) na queda adesivo de silicone e alinhá-lo com a extremidade do tubo. Isso irá proporcionar uma superfície ligeiramente elevada e plana para fixação construir. Repita o procedimento para a outra extremidade. </li><li> Permitir que o molde para secar em temperatura ambiente por 3 dias. É útil para fazer 20-30 moldes ao mesmo tempo, uma vez que estas são essencialmente descartáveis. </li><li> Uma vez que o adesivo é completamente seco, armazene esses moldes num copo cheio de etanol 70% até que sejam necessários. Este passo ajudará a esterilizar os moldes eo produto final é mostrado na Figura 1. </li></ol> Parte 2: Preparação para o isolamento de células mioblastos <ol><li> Diluir 1 mg laminina (Sigma) em 250 mL 0,22 M esterilizada por filtração, tampão fosfato (PBS) contendo 1% de penicilina / estreptomicina (Invitrogen) e Fungizone 1% (Invitrogen). </li><li> Casaco 150 milímetros placas de cultura de tecidos (BD Falcon) com 4 mL da solução diluída de laminina passo 1.1 e incubar a 37 º C por pelo menos 4 horas antes do plaqueamento os mioblastos esqueléticos primários. </li><li> Tornar o meio de mioblastos, misturando F-10 Ham Mistura de nutrientes (Sigma) com FBS 20% (Atlanta Biologicals), 5 ng / L Fator de crescimento básico de fibroblastos (Promega), 1% Penicilina / Estreptomicina (Invitrogen), e Fungizone 1% ( Invitrogen). </li><li> Preparar a solução de digestão do músculo esquelético, dissolvendo 1 g de ~ 295 U / mg de colagenase 2 (Worthington) em 100 mL 2,4 U / mL Dispase-2 (Roche). Adicionar 0,037 g CaCl 2 e misture bem. Filtro de esterilizar o tampão de digestão usando um disco de 0,2 mM de filtro montado em uma seringa de 10 mL e alíquotas armazenar a -20 ° C. Coloque a quantidade necessária para a digestão do tecido a 37 ° C, juntamente com a mídia mioblastos. </li></ol> Parte 3: isolamento mioblastos de músculo esquelético <ol><li> Utilizando uma pinça e uma tesoura pequena, retire músculos paravertebrais de ratos mortos neonatal Lewis por corte nas costas ao longo da medula espinhal, retirar as camadas da pele e fáscia e, em seguida, extirpando os músculos. </li><li> Em uma capa de cultura de tecidos, coloque os músculos excisadas em um tubo de 50 ml (BD Falcon) preenchida com 40 mL de solução de sal 1X Hanks Balanced (HBSS) (Invitrogen) no gelo. Permita que as tiras do músculo em repouso para a parte inferior do tubo e retire cuidadosamente a maior parte dos restos de líquido e sangue por sucção a vácuo com uma pipeta Pasteur estéril em uma capa de cultura (Baker). </li><li> Despeje as peças muscular colhidas em uma placa de cultura 150 mm e remover o máximo do líquido restante possível com sucção. Usando duas lâminas de barbear única gumes mince o tecido para uma pasta grossa. Despeje pré-aquecido solução digestão sobre a pasta e transferir a mistura para um tubo mL fresco 50 usando uma pipeta 10 mL. Durante a digestão enzimática, o tecido é ocasionalmente triturado (sem bolhas) com uma pipeta de 10 mL provido em um fio Pipetar-Aid (Drummond). Mais uma vez, permitir que o tecido para resolver e remover o excesso de líquido. </li><li> Colocar o tubo em uma plataforma de balanço e digerir a 37 º C por cerca de 30 min. </li><li> Uma vez que o músculo é liquefeito, passar a solução através de um filtro de células 70 mM (BD Falcon) e centrifugar a temperatura ambiente por 10 min a 600 xg (Beckman GP). Com uma pipeta Pasteur e sucção, remover o máximo de líquido possível e ressuspender o sedimento com 10 ml de meio de mioblastos quente. </li><li> Pré-plate as células em um prato de 150 milímetros de cultura de tecidos revestidos por 15 minutos para ajudar a remover fibroblastos. </li><li> Transferência das células que ainda não anexado ao cultureware laminina-revestido e diluir para que haja uma placa para cada 1 a 2 filhotes de ratos. Coloque a placa em um conjunto incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol> Parte 4: Fundição construções da engenharia de tecidos (5 mL) <ol><li> Após 1 a 2 dias, retire 10 da 150 milímetros mioblastos placas de cultura de tecidos da incubadora, lave-os duas vezes com 37 ° C 1X PBS, e adicionar 4 mL de morno 0,05% Tripsina-EDTA para cada prato. Retornar as placas para a incubadora por 5 min. </li><li> Colher os mioblastos destacada das placas no bairro cultura e recolher o líquido em um tubo de 50 mL (BD Falcon). Use 10 mL de meio de mioblastos para lavar todos os pratos e combinar isso com as células no tubo de ensaio. Agregar as células em temperatura ambiente por 10 min a 600 xg (Beckman GP) e remova o excesso de líquido, tal como descrito no passo 3.5. </li><li> Ressuspender as células mioblastos em 1,6 mL de meio de mioblastos e colocar no gelo. </li><li> Usando pinça, retire cuidadosamente quatro moldes construir a partir do passo 1.5 e lave-os duas vezes com PBS 1X. Sucção a vácuo off todos os vestígios de PBS com uma pipeta Pasteur, antes de colocar cada molde em um cu bem 6-tecidoLTURE placa (BD Falcon). </li><li> Reúna os outros reagentes necessários para a preparação de construir (F10 Ham 10X é, antibióticos, colágeno tipo 1 [3,9 mg / mL] [6] e Matrigel ™) sobre o gelo e manter meios de comunicação mioblastos a 37 º C. Combine 500 mL 10X Ham F10, 100 mL penicilina / estreptomicina, 100 Fungizone mL, 1,6 mL de colágeno, e 750 ™ Matrigel mL em tubo cônico de 15 mL. Misturar a solução por 10 segundos usando um Mini-Vortexer (VWR) definida para 10 e colocar no gelo. </li><li> Em seguida, adicione 80 mL de NaHCO 3 ea suspensão mioblastos a partir do passo 3.3 para a mistura a partir do passo 3.5. Vortex toda a mistura por 10 segundos e retornar o tubo para o balde de gelo para um poucos minutos para limpar a solução de bolhas. </li><li> Cuidadosamente elenco a mistura nos moldes antes que comece a solidificar usando uma pipeta 10 mL. Cada molde irá realizar cerca de 1 mL do líquido viscoso. Tente evitar a introdução de bolhas de ar durante este procedimento. </li><li> Transferir cuidadosamente a placa contendo as construções elenco para a incubadora. Depois de ~ 30 min, retire as construções solidificadas da incubadora e adicione cuidadosamente médio mioblastos a cada poço para cobrir o tecido construir. Devolver a placa para a incubadora (Figura 2). </li></ol> Parte 5: Os resultados representativos Quando este protocolo é executado corretamente, o construto de tecido contendo mioblastos está pronto para implantação em vivo (ou seja, quando removido do molde) ou para mais nas análises in vitro após 2 dias. <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure1.jpg" alt="" /> Figura 1. Exemplos de concluídos moldes construir (veja o Passo 1.5). <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure2.jpg" alt="" width="400" height="321" /> Figura 2. A solidificou mioblastos contendo tecido construir [1]. <img src="/files/ftp_upload/1137/Figure3.jpg" alt="" /> Figura 3. H &amp; E cortes corados de um tecido mioblastos contendo construir. &quot;A&quot; mostra uma seção longitudinal e &quot;B&quot; mostra um corte transversal.

<ol><li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Blau, H. M., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human muscle cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).</li>
<li>Powell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+human+bioartificial+muscles+expressing+a+foreign+recombinant+protein+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).</li>
<li>Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Gallop, P. M., Seifter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Properties+of+Soluble+Collagens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and Properties of Soluble Collagens.</a> Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).</li>
</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Institutional Animal Care e do Comitê Use do Hospital Infantil de Boston.

Os moldes em que a construção de tecido serão lançados podem ser feitas em qualquer formato e tamanho, no entanto, é preciso haver pelo menos dois pontos de fixação. Caso contrário, a matriz e as células formam uma estrutura esférica e as células morrem. No protocolo, descrevemos o uso de uma malha de poliéster para esta finalidade, mas também temos utilizado com sucesso malha de aço inoxidável. Obviamente, moldes maiores exigirá mais células e um maior volume de outros ingredientes. Ao fazer os moldes, é importante par...

<table><tbody><tr><td>Tubo de silicone</td><td>VWR international</td><td>60985-724</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo de silicone</td><td>Rhodia Silicones</td><td>MED ADH 4300 RTV</td><td></td></tr><tr><td>Malha de poliéster</td><td>McMaster-Carr</td><td>93185T17</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Meio Nutriente F-10 HAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6908</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Dispase-2</td><td>Roche Group</td><td>10295825001</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase 2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>46H8863</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos básico</td><td>Promega Corp.</td><td>G5071</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos de 150 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05% (1X)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hanks 1X</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 7,5%</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células de 70 &amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Frasco cônico de 50 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Frasco cônico de 15 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de 0,2 &amp;mu;m</td><td>Nalge Nunc international</td><td>194-2520</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de miogênica constrói engenharia de tecidos

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Apesar do facto de pacemakers eletrônicos são salva-vidas dispositivos médicos, o seu desempenho a longo prazo em pacientes pediátricos pode ser problemático, devido a restrições impostas pelo pequeno tamanho de uma criança e seu crescimento inevitável. Conseqüentemente, há uma necessidade genuína para terapias inovadoras projetadas especificamente para pacientes pediátricos com distúrbios do ritmo cardíaco. Propomos que uma alternativa condutora biológica consiste de uma matriz à base de colágeno contendo autologously células derivadas poderiam se adaptar melhor ao crescimento, reduzir a necessidade de cirurgias recorrentes, e melhorar significativamente a qualidade de vida para esses pacientes. No presente estudo, descrevemos um procedimento para a incorporação de culturas de células primárias de mioblastos esqueléticos dentro de uma matriz de hidrogel para moldar uma estrutura de tecido cirurgicamente implantável, que servirá como um conduíte elétrico entre as câmaras superior e inferior do coração. Em última instância, nós antecipamos usando este tipo de engenharia de tecidos para restaurar a condução elétrica atrioventricular em crianças com bloqueio cardíaco completo. Em vista disso, isolamos mioblastos de músculo esquelético de ratos Lewis neonatal e placa-los para laminina revestido pratos de cultura de tecidos usando uma versão modificada de protocolos estabelecidos<sup&gt; [2, 3]</sup&gt;. Depois de 1-2 dias, as células cultivadas são coletados e misturados com os antibióticos, o colágeno tipo 1, Matrigel ™, e NaHCO<sub&gt; 3</sub&gt;. O resultado é uma solução viscosa uniforme que pode ser convertido em um molde de quase qualquer formato e tamanho<sup&gt; [1, 4, 5]</sup&gt;. Para construções nosso tecido, que empregam colágeno tipo 1 isolado da pele de cordeiro fetal usando procedimentos padrão<sup&gt; [6]</sup&gt;. Uma vez que o tecido tem solidificado a 37 ° C, cultura da mídia é cuidadosamente adicionada à placa até que a construção está submerso. A engenharia de tecidos é permitido então condensar ainda mais através de desidratação por mais 2 dias, altura em que ele está pronto para<em&gt; In vitro</em&gt; Avaliação ou cirúrgico-implantação.

Aqui, demonstramos a fabricação de colágeno baseado em construções de tecido contendo os mioblastos esqueléticos. Essas construções 3-D de engenharia podem ser usados ​​para substituir ou reparar tecidos<em&gt; In vivo</em&gt;. Para os nossos propósitos, nós projetamos estes como um canal atrioventricular elétrica para a reparação de bloqueio cardíaco completo<sup&gt; [1]</sup&gt;.

Fabricação de Miogênica Constrói engenharia de tecidos

Apesar de os marcapassos eletrônicos serem dispositivos médicos vitais, o seu desempenho a longo prazo em pacientes pediátricos pode ser problemático devido a...

Este procedimento começa com a coleta de tecido muscular esquelético de Lewis Wraths neonatais. A partir desse tecido, isolamos células mioblastas. Esses mioblastos são cultivados em placas de cultura de tecidos por dois dias e, em seguida, coletados e misturados a uma mistura de matriz tecidual à base de colágeno.Essa mistura é cuidadosamente pipetada para dentro de um molde submerso em meio de cultura e incubada a 37 graus Celsius. Olá, sou Christina Pesach do laboratório de Douglas Cowan, do Departamento de Anestesiologia do Hospital Infantil, Boston, e da Escola Médica de Harvard. Hoje mostraremos a vocês um procedimento para criar tecido engenheirado miogênico.Utilizamos este procedimento para fabricar um tecido projetado para inserção no coração. Nosso objetivo é criar uma conexão elétrica entre as câmaras superiores e inferiores do coração como uma terapia alternativa à implantação de marcapasso cardíaco em crianças com bloqueio cardíaco completo. Então, vamos começar.No construto, o molde de fundição é utilizado para fornecer uma forma ao construto tecidual à base de colágeno que será cirurgicamente implantado. Neste vídeo, o processo de criação de construtos teciduais enge

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Métodos para a preparação de um gel matriz injetável a partir de tecido decelularizado e injetá-lo em rato...

Biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para Engenharia de Tecidos do Miocárdio

Tecido muscular de engenharia tem um grande potencial na medicina regenerativa, como modelo de doença e também como uma fonte alternativa para a carne. Aqui descreve-se a engenharia de uma construção de músculo, neste caso, a partir de células progenitoras, mioblastos de rato e a estimulação por pulsos eléctricos.

Os tecidos músculo esquelético de engenharia a partir de células progenitoras mioblastos murinos e Aplicação da estimulação elétrica

A geração de alinhados tecido do miocárdio é um requisito fundamental para a adaptação dos avanços recentes em biologia de células-tronco para fins clinicamente úteis. Descrevemos aqui uma abordagem impressão microcontact para o controlo preciso da forma e função celular. Usando populações altamente purificadas de células-tronco embrionárias derivadas progenitores cardíacos, nós, então, gerar tecido funcional anisotrópica do miocárdio.

Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact

Este modelo de sistema começa a partir de um gel de fibrina miofibroblastos povoada que pode ser usado para estudar colagénio endógeno (re) organização em tempo real de uma forma não destrutiva. O modelo de sistema é muito sintonizável, como ele pode ser usado com diferentes fontes de células, aditivos médio, e pode ser facilmente adaptada às necessidades específicas.

Engenharia baseada em fibrina construções de tecido de miofibroblastos e de aplicação de restrições e tensão para induzir a organização das células e colágeno (Re)

Para a criação de estruturas altamente organizadas de tecidos complexos, deve-se montar vários tipos de materiais e células em um composto integrado.  Este projeto combinatório incorpora folhas de células em camadas específicas de órgãos com dois materiais distintos derivados biologicamente contendo uma forte base de matriz fibrosa e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos.

Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

Neste trabalho, apresentamos uma técnica para a fabricação rápida de tecidos vasculares vivos por cultura direta de colágeno, células musculares lisas e células endoteliais. Além disso, um novo protocolo para a caracterização mecânica de tecidos vasculares projetados é descrito.

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Até o momento, os defeitos de tecido espesso são normalmente reconstruídos com a aplicação de retalhos de tecido autólogo ou tecidos projetados. Neste protocolo, apresentamos um novo método de engenharia de retalho de tecido vascularizado com pedículo autólogo, para servir como substituto dos retalhos autólogos.

Projetado retalho do músculo vascularizada

Este protocolo descreve uma plataforma para a fabricação de anéis de tecido Self montado em tamanhos variáveis, usando um molde de plástico personalizado 3D-impresso. PDMS negativos são curados em molde 3D-impresso; Então a agarose é convertido nos negativos PDMS curados. As células são semeadas em poços de agarose resultante onde eles agregam em anéis de tecido.

Fabricação de poços de Agarose personalizado para a propagação de células e tecido anel Self-assembly usando moldes 3D-impresso

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para produzir matrizes de microtissues musculares esqueléticos humanos 3D e minimamente invasivos a jusante em ensaios de função situ, incluindo força contraítil e análises de manuseio de cálcio.

Avaliação de métricas funcionais da saúde muscular esquelética em microtissues musculares esqueléticas humanas

Este protocolo fornece métodos para gerar tecidos cardíacos e musculares esqueléticos modificados em 3D e descreve seu uso em modalidades de triagem pré-clínica de medicamentos. Os métodos descritos utilizam um sistema de detecção magnética para facilitar a avaliação simultânea de 24 tecidos em paralelo.

Teste pré-clínico de drogas em tecidos musculares escaláveis de engenharia 3D

Um método reprodutível é apresentado para gerar tecidos miocárdicos 3D combinando scaffolds de escrita eletrospinning (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogéis de fibrina com cardiomiócitos e fibroblastos derivados de hiPSC. Essa técnica oferece controle preciso sobre a arquitetura do andaime e pode ser aplicada em testes pré-clínicos de medicamentos e modelagem de doenças cardíacas.

Geração de tecido miocárdico humano 3D usando escrita eletrogiratória por fusão de andaimes de policaprolactona e células cardíacas derivadas de hiPSC

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