Name: Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprenda mapeamento óptico de potenciais de ação em corações de ratos perfundidos por Langendorff usando o corante di-8-ANEPPS. Esta técnica de alta resolução permite estudar a propagação da atividade elétrica cardíaca em tempo real.

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Este trabalho é suportado por verbas de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde (HL068915; HL088206) e contribuições para o Fundo de Condução Cardíaca do Hospital Infantil de Boston.

Parte 1: Prepare soluções eo sistema de coração isolado perfundido <ol><li> Na manhã do experimento, 4,0 L de Krebs-Henseleit está preparado como descrito anteriormente [5, 6]. </li><li> 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (BDM) é dissolvido em 1,0 L de Krebs-Henseleit decantado do perfusato preparada no passo 1.1. </li><li> Um adicional de 150 mL de Krebs-Henseleit é removido do perfusato preparada no passo 1.1 e misturado com 5 Mol / L di-8-ANEPPS (diluído a partir de um estoque 10 mMol / L dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO)). </li><li> Estas três soluções são transferidos para com camisa de água de vidro reservatórios (Radnoti), onde são pré-aquecido a 41,0 ° C e oxigenada com um borbulhador submersa (Radnoti) com 0,2 m filtrada 95% O 2, 5% do gás CO 2. Soluções a partir de 3 reservatórios de ações são bombeados para o sistema de Langendorff parede com Masterflex ™ L / S bombas peristálticas e de baixa absorção de tubo de silicone (Cole-Parmer). </li><li> Antes da montagem, o sistema de Langendorff vidro (Radnoti) é meticulosamente lavados com E-Toxa-CLEAN reagente (Sigma-Aldrich) e bem enxaguadas com 0,1 M / L HCl, 100% de etanol, e água destilada. </li><li> O não-recirculação Langendorff aparelho foi construído para entregar 70 mm Hg a pressão constante de 3 reservatórios separados oxigenados, que são separados a partir do coração com bobinas de jaqueta de água de aquecimento e armadilhas bolha (Radnoti) [7]. As 3 linhas de perfusão independente convergem acima do coração, duas torneiras de 3 vias, permitindo-nos controlar com precisão a entrega das soluções preparadas em passos 1,1-1,3. Jaqueta de água de vidro é ligado em série com Masterflex tubulação BPT Pharmed (Cole-Parmer) e aquecida a 39 ° C com água destilada usando dois circuladores E100 (Lauda). Perda de calor através do tubo de silicone de platina curado (Cole-Parmer) que conecta os reservatórios de pressão de cabeça para as bobinas de aquecimento e armadilhas bolha resultou em um 37 ° C perfusato atingindo o coração. </li></ol> Parte 2: Colheita do coração de rato e set-up de perfusão Langendorff <ol><li> Para induzir a anestesia geral profunda em ratos Lewis 200-250 g, 100 mg cetamina / kg e 10 Xilazina mg / kg é injetado na cavidade intraperitoneal. Para esta mistura, acrescentamos 500 Heparina U / kg para evitar a coagulação do sangue e isquemia miocárdica durante o procedimento de remoção. </li><li> Para fácil acesso ao coração e grandes vasos, parede anterior do tórax é removido. Depois disso, o tecido circundante é cuidadosamente dissecados e do saco pericárdico aberto. </li><li> Após a identificação da veia cava inferior, esta embarcação é ligada com seda 5-0 (Ethicon) eo bloco coração-pulmão inteiro é explantado. Tecido é colocado imediatamente em solução gelada Krebs-Henseleit contida em um copo de 50 mL no gelo. </li><li> A aorta ascendente é rapidamente identificado e dissecado do tecido circundante. Uma cânula de tamanho apropriado (Harvard Apparatus) é inserido na aorta, tendo o cuidado de evitar a interrupção da perfusão obrigatória das artérias coronárias através da inserção da cânula muito longe na raiz da aorta. A cânula é fixada à aorta ascendente com seda 5-0 (Ethicon). </li><li> O coração de rato é então colocada sobre o aparelho Langendorff sem a introdução de bolhas de ar na cânula. Perfusão coronária retrógrada vascular é agora estabelecida com a quente, oxigenada solução de Krebs-Henseleit a partir da pressão de cabeça descrito no passo 1.6. </li><li> Tecido extra, incluindo os pulmões, é removido eo coração é perfundidos por 20 minutos para permitir a recuperação da função e estabilizar o ritmo. Durante este tempo, uma sonda de temperatura muito fino termopar (Cole-Parmer) é introduzido na cavidade do ventrículo esquerdo e suturado no lugar com Prolene 5-0 sutura (Ethicon). A sonda é ligada a um termo-controlador (Digi-Sense) para garantir a temperatura do coração é mantida a 37 ° C, ajustando as configurações das bombas de circulação de água. Movimento de perfusato pingando do ápice cardíaco é minimizado pela colocação de um pedaço de gaze no receptáculo de efluentes. </li></ol> Parte 3: coração de carga com corante potenciométrica e adquirir sinais eletrográficos e óptica <ol><li> Di-8-ANEPPS (Invitrogen) é carregado para o coração, alternando para a linha de perfusão que contém a mistura de Krebs-Henseleit com o corante fluorescente usando uma torneira. Além disso, uma cânula de 18G é colocado no átrio esquerdo e / ou para a direita e de 50 mL de solução corante adicional é administrado lentamente em cada uma destas câmaras, porque eles não são suficientemente perfundidos com corante introduzido através das artérias coronárias. </li><li> Durante o procedimento de carga, três derivações (Harvard Apparatus) são delicadamente colocados sobre a superfície do coração que não está enfrentando a ótica utilizada para o mapeamento. Eletrodo N o 1 está posicionado na parte posterior apical do ventrículo esquerdo, o N 2 no átrio esquerdo, e N <su> p&gt; O 3 como um eletrodo de referência na raiz da aorta (Figura 1). Os sinais eletrocardiográficos atriais e ventriculares são posteriormente amplificada, digitalizada e exibida ao lado de sinais ópticos usando o software (redshirt Imaging) (Figura 2). Um osciloscópio (Tektronix modelo TDS 1002) também é usado para visualizar a superfície ECG s em tempo real e assegurar a estimulação adequada. </su></li><li> ECG amplificador (Hugo Sachs Elektronik) configurações: filtro passa-alto: 0,1 Hz Filtro passa-baixa: 150 Hz </li><li> A câmera CMOS (redshirt Imaging) e macroscópio é posicionado usando os ajustes XYZ modo que a superfície do coração está em foco e centrado no quadro de aquisição. A câmara óptica e são montados em uma mesa de isolamento de vibração (Minus K Technology) para minimizar as freqüências de ressonância. Ao mesmo tempo, um eletrodo de marcapasso coaxial (Harvard Apparatus) controlada com um isolado, S48 unidade de estimulação elétrica (Grass), é colocado no átrio direito eo coração está acelerado a 300 batimentos por minuto (Figura 1). </li><li> Estimulação elétrica (Grass) configurações: Taxa: 5 pulsos por segundo Delay: 0,2 ms Duração: 2 ms Volts: 6-12 V Modo: Repetir Pulso: Single </li><li> Para gravações óptico que falta artefatos de movimento de contração, o coração precisa ser desacoplado eletromecânica. Fazemos isso de novo comutação de linhas de perfusão de Krebs-Henseleit solução que contém 11 mmol / L BDM. Entre as aquisições, o coração é puro perfundidos com Krebs-Henseleit para ajudar a preservar a viabilidade da preparação. </li><li> Os parâmetros de gravação são definidos usando o software (Imaging redshirt) com as configurações de aquisição seguintes: Configuração: 2.000 Hz; 128x128 matriz de pixels Intervalo de quadro: 0,5 ms Ganho câmera Amplificador: 5x On-Chip Gain: 8x-12Me bem- Obturador: 500 ms de atraso Número de Frames: 4000 Duração: 2000 ms </li><li> Todas as luzes da sala e equipamentos estão desligados ou blindado para eliminar o ruído de fundo durante a gravação. A luz LED ilumina o coração só durante a gravação óptica para reduzir a foto-branqueamento e toxicidade de corantes. O obturador fonte de luz é controlada com um pulso de 5 V entregue através do painel de controle por meio de uma D-to-Uma placa no computador (Imaging redshirt). </li></ol> Parte 4: Analisar as informações de aquisição utilizando Software Imaging redshirt <ol><li> Após a aquisição, os dados são processados ​​utilizando-se diferentes configurações do filtro. Em geral, usar as configurações padrão, exceto quando se ajusta a Banda Stop / Passe filtro, que é definido com o limite à esquerda em 44,0 e no limite direito a 98,0. Depois as informações gravadas são processados ​​e um filme é gerado (Imaging redshirt). </li><li> Dados de uma aquisição corresponde à ativação local elétrica em 16.384 sites na superfície do coração durante um período de 2 segundos. O software permite que estes sinais locais para ser diretamente comparados entre si e com as gravações atriais e ventriculares eletrográfico. Dados são então visualizados através do mapeamento de ativação elétrica local a cor e tornando esta informação como uma animação mostrando a ativação espaço-temporal elétrica na superfície cardíaca. Para criar tal uma animação, usamos o software para: <ul><li> temporal e / ou filtrar os dados espacialmente </li><li> selecionar um tempo de início e término para a animação </li><li> sinais ópticos para mapa de cores com base na intensidade da luz de descanso de cada pixel </li><li> sobrepor os dados de cor resultante com uma imagem do coração </li><li> gerar a animação </li></ul></li></ol> Parte 5: Os resultados representativos Se a preparação do coração perfundido estava imóvel durante a gravação, o sinais ópticos mostram um pico distinto para cada pixel envolvido em uma mudança da intensidade de emissão de di-8-ANEPPS. Os filmes correspondentes (Figuras 3 e 4) demonstram uma frente de onda de excitação propagação em toda a superfície epicárdica do coração, assim como as gravações simultaneamente adquiridas eletrocardiográfico (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="Diagrama de configuração cardíaca de Langendorff para estudo de estimulação cardíaca, destacando os componentes numerados." data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Uma fotografia de uma preparação de coração Langendorff-perfundidos representando as posições do eletrodo de marcapasso em átrio direito e do ECG, como descrito no passo 3.2. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="Diagrama de processo biológico com sinais; análise de dados dos resultados da microscopia de fluorescência." border="0" data-altupdatedat="1754907201000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Representante sinais ópticos e gravações eletrocardiográfico de um coração de rato perfundido Lewis. Um painel mostra uma imagem da superfície epicárdica utilizado para geração de imagens ópticas. A posição dos pixels selecionados para demonstrar as mudanças na emissão de fluorescência ao longo do tempo no Painel B são indicadas por setas coloridas. Sinais eletrográficos são mostrados no painel C com a linha vermelha que indica a ativação atrial ea linha de luz azul correspondente ao sinal ventricular. Por favorve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "&gt; clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li>
<li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li>
<li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling%3A+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li>
<li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li>
<li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Institutional Animal Care e do Comitê Use do Hospital Infantil de Boston.

Remoção do coração de ratos anestesiados deve ser realizada rapidamente para evitar a isquemia miocárdica. Se isquemia ou insuficiente perfusão coronária ocorre, o coração provavelmente irá desenvolver arritmias e pode tornar-se infartado. Além disso, esses corações irá mostrar emissão de fluorescência insuficiente para gravações informativo e análises subseqüentes. Antes de colocar o corante, as células do miocárdio têm de ser adequadamente perfundidos com Krebs-Henseleit para estabelecer e manter um ambiente eletrolít...

<table><tbody><tr><td>CardioCMOS-SM128f</td><td>Equipamento</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software CardioPlex</td><td>Equipamento</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte de Luz LED LUXEON 460-490 nm </td><td>Equipamento</td><td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td><td>LXHL-PB02</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de ECG Tipo 689 Hugo Sachs Elektronik</td><td>Equipamento</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730149</td><td></td></tr><tr><td>Espelho Dicroico 505 nm</td><td>Equipamento</td><td>Semrock</td><td>FF505-SDi01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Emissão Passa-Alta 605 nm</td><td>Equipamento</td><td>SciMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THT Sideways</td><td>Equipamento</td><td>SciMedia</td><td>25 BM-8</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de Junta Esférica Miniatura</td><td>Equipamento</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0177</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Eletrodos de Estimulação Pequeno</td><td>Equipamento</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0160</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de Isolamento de Vibrações BM-6 de Bancada</td><td>Equipamento</td><td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td><td>25 BM-6</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodo Monopolar de ECG</td><td>Equipamento</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 73-0200</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Rolo SCI 400</td><td>Equipamento</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>401U/D1</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Rolo MasterFlex Easy Load II</td><td>Equipamento</td><td>Cole-Parmer</td><td>Modelo 77201-60</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Marprene #14</td><td>Equipamento</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>902.0016.016</td><td></td></tr><tr><td>Tubo MasterFlex</td><td>Equipamento</td><td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td><td>06485-25</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador de Pulso Quadrado S48</td><td>Equipamento</td><td>Grass Technologies</td><td>Modelo S48</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Isolamento com Transformador RF SIU5</td><td>Equipamento</td><td>Grass Technologies</td><td>Modelo SIU5</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório com Jaqueta de Água de 5 Litros</td><td>Equipamento</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-5</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório com Jaqueta de Água de 2 Litros</td><td>Equipamento</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-2</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório com Jaqueta de Água de 0,5 Litro</td><td>Equipamento</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-0</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório com Jaqueta de Água de 0,25 Litro</td><td>Equipamento</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>120142-025</td><td></td></tr><tr><td>Bobina de Aquecimento de 10 ml</td><td>Equipamento</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>Armadilha de Bolhas com Complacência</td><td>Equipamento</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>Cânula com Desconexão Luer</td><td>Equipamento</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-1444</td><td></td></tr><tr><td>Chave de três vias, FLL para MLT, sem tampas de porta</td><td>Equipamento</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BS4 72-2630</td><td></td></tr><tr><td>Termômetro com Termopar</td><td>Equipamento</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-91100-40</td><td></td></tr><tr><td>Microsonda Flexível Ultrafina da Série IT </td><td>Equipamento</td><td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td><td>IT-24P</td><td></td></tr><tr><td>Osciloscópio Tektronix TDS 1002</td><td>Equipamento</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TDS 1002B</td><td></td></tr><tr><td>Monoxima de 2,3-butanodiona </td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Ketamina</td><td>Reagente</td><td>Hospira Inc.</td><td>RL-0065</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Reagente</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>LB15705A</td><td></td></tr><tr><td>E-TOXA-CLEAN&amp;#174;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9029</td><td></td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>D-3167</td><td></td></tr></tbody></table>

mapeamento óptica de corações perfundidos langendorff-rat

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Mapeamento óptico da superfície cardíaca com sensíveis à voltagem corantes fluorescentes tornou-se uma ferramenta importante para investigar excitação elétrica em modelos experimentais que variam em escala de culturas de células de todo o órgãos<sup&gt; [1, 2]</sup&gt;. Usando state-of-the-art sistemas de imagem óptico, geração e propagação de potenciais de ação durante o ritmo cardíaco normal ou durante a iniciação e manutenção de arritmias podem ser visualizadas instantaneamente<sup&gt; [1]</sup&gt;. O mais recente disponível comercialmente sistemas podem fornecer informações em alta resolução espaço-temporal excessivamente e foram baseadas nas custom-built equipamento inicialmente desenvolvido para superar os obstáculos impostos por mais convencionais métodos eletrofisiológicos<sup&gt; [1]</sup&gt;. Avanços em alta resolução e alta velocidade complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) câmeras e intensamente brilhante, diodos emissores de luz (LEDs), bem como corantes sensíveis à voltagem, ótica, e filtros de ter começado a fazer a aquisição do sinal elétrico práticas para biólogos celulares cardiovascular que estão mais acostumados a trabalhar com microscópios. Apesar da nova geração de câmeras CMOS pode adquirir 10.000 frames por segundo em uma matriz de pixels 16.384, dependendo do tipo de preparação das amostras, há muito estabelecido tecnologias de aquisição de fluorescência como matrizes de diodos, sistemas de varredura a laser, e resfriado dispositivo carregado acoplado (CCD câmeras) ainda tem algumas vantagens distintas em relação à gama dinâmica, relação sinal-ruído e eficiência quântica<sup&gt; [1, 3]</sup&gt;. No presente estudo, corações de ratos Lewis foram perfundidos<em&gt; Ex vivo</em&gt; Com um perfusato cristalóide (Krebs-Henseleit) a 37 ° C em um aparelho de Langendorff modificado. Depois de um período de estabilização de 20 minutos, os corações foram perfundidos com intermitentemente 11 mmol / L monoxime 2,3 butanedione para eliminar a contração associada movimento durante a aquisição da imagem. Para o mapeamento óptico, nós corações carregadas com a sonda de fast-resposta potenciométrica di-8-ANEPPS<sup&gt; [4]</sup&gt; (5 mmol / L) e brevemente iluminada a preparação com 475 ± 15 nm luz de excitação. Durante um período de 2 típicas segundo de iluminação,&gt; luz emitida por 605 nm a preparação cardíaca foi fotografada com uma câmera CMOS de alta velocidade conectado a um macroscópio horizontal. Para esta demonstração, os corações foram passeado a 300 batimentos por minuto com um eletrodo coaxial conectado a uma unidade de estimulação elétrica isolada. Gravações simultâneas bipolar eletrocardiográficos foram adquiridos e analisados ​​juntamente com os sinais de tensão utilizando software prontamente disponíveis. Desta forma, os potenciais de ação sobre a superfície de corações de ratos perfundidos Langendorff-pode ser visualizado e registrado com sinais eletrográficos.

Este artigo descreve uma técnica de alta resolução temporal e espacial, visualmente, movimento de ação potencial imagem sobre a superfície de corações de ratos perfundidos Langendorff-utilizando um corante potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

O mapeamento óptico da superfície cardíaca com corantes fluorescentes sensíveis à voltagem tornou-se uma ferramenta importante para investigar a excitação elétrica em...

Olá, sou Yon Ziv do laboratório do Dr. Cohen do Departamento de Anestesiologia do Hospital Infantil e da Faculdade de Medicina Howard. Hoje mostraremos um procedimento de mapeamento óptico em corações vermelhos perfundidos com solução de Langendorff. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a propagação da atividade elétrica na superfície cardíaca.Então vamos começar. Na manhã do experimento, prepare quatro litros de solução de Krebs Henselight. Após preparar a solução, remova partículas não dissolvidas com um filtro de 200 mícrons utilizando filtração a vácuo.Primeiro, utilize um litro da solução preparada de Krebs Henzel lite para dissolver 11 milimoles de BDM. Em seguida, tome outros 100 mililitros de Krebs Henzel lite e misture 10 milimolar de D oito NFS em DMSO até uma concentração final de cinco micromolar de D oito annex na solução. Os reservatórios de vidro com jaqueta de água, o borbulhador e o material de vidro utilizados aqui são todos da red.Naughty.Transfira as duas soluções para os reservatórios pré-aquecidos a 41 graus Celsius. Oxygene as soluções com gás filtrado em 0,2 mícron usando uma bomba de borbulhamento submersa; conduza as soluções dos três reservatórios de estoque através do sistema Ling Endorf montado na parede, com bombas peristálticas e tubos de silicone de baixa absorção, para a colheita do coração de rato. Primeiramente, injete intraperitonealmente um rato Lewis de 200 a 250 gramas com cetamina e xilazina para induzir anestesia geral profunda e com heparina para prevenir a coagulação sanguínea e a isquemia miocárdica durante a eutanásia.Uma vez que o rato esteja completamente anestesiado e não responda a um aperto no dedo do pé, prossiga com a remoção do coração. Inicie a cirurgia removendo primeiro a parede torácica anterior para acessar facilmente o coração e os grandes vasos. Em seguida, dissecar cuidadosamente o tecido circundante e abrir a bainha pericárdica.Após identificar a veia cava inferior, ligue este vaso com cinco suturas de polipropileno 5-0 e expor o bloco cardiorrespiratório inteiro. Coloque imediatamente o tecido em solução leve de Krebs-Henseleit gelada num béquer de 50 mililitros sobre gelo, identifique rapidamente a aorta ascendente e dissecione-a do tecido circundante. Insira uma cânula de tamanho apropriado na aorta.Tendo o cuidado de evitar inserir a cânula muito profundamente na raiz da aorta e interromper a perfusão obrigatória das artérias coronárias. Fixe a cânula à aorta ascendente. Em seguida, coloque o coração de rato no aparelho Ling Endorf sem introduzir bolhas de ar na cânula.A perfusão vascular coronariana retrógrada agora está estabelecida com a solução de Krebs Hensel lite aquecida e oxigenada. A partir da câmara de pressão do aparelho Ling Endorf, remova agora os tecidos adicionais, incluindo os pulmões, após a limpeza, e perfunda o coração por 20 minutos para permitir a recuperação da função e a estabilização do ritmo enquanto o coração está sendo perfundido. Introduza uma sonda termopar muito fina na cavidade do ventrículo esquerdo.Suture o cateter no lugar com cinco pontos de prolene 5-0 e ajuste as configurações das bombas do circuito de água para manter a temperatura do coração a 37 graus Celsius. Minimize o movimento provocado pelo perfusato que goteja do ápice cardíaco. Colocando um pedaço de gaze no recipiente de efluentes, o coração está agora pronto para ser carregado com corante potenciométrico, a fim de obter sinais eletrográficos e ópticos, carregando o corante potenciométrico di-8-ANEPPS no coração.Alterne para a linha de perfusão que contém Krebs, portanto luz misturada com corante fluorescente. Como os átrios não são suficientemente perfundidos com o corante introduzido pelas artérias coronárias, uma cânula de 18 gauge é colocada no átrio esquerdo e/ou direito. E adicionais 50 mililitros de solução de corante são administrados lentamente em cada uma dessas câmaras.Durante o procedimento de posicionamento, coloque suavemente três eletrodos de ECG sobre a superfície do coração, do lado oposto às ópticas utilizadas para mapeamento. O primeiro eletrodo é posicionado na porção apical posterior do ventrículo esquerdo.O segundo é colocado sobre o átrio esquerdo e o terceiro atua como eletrodo de referência na raiz da aorta. Os sinais eletrográficos atriais e ventriculares são subsequentemente amplificados, digitalizados e exibidos como sinais ópticos utilizando o software. Um osciloscópio também é utilizado para visualizar os ECGs de superfície em tempo real e garantir um pacing adequado.Configure o amplificador de ECG em 0,1 hertz para o filtro passa-alta e em 150 hertz para o filtro passa-baixa. Posicione a câmera de CMOs utilizando os ajustes X, Y e Z. Coloque um pedaço de vidro, posicionado no plano focal da câmera, sobre a superfície do coração, de modo que a área de interesse esteja focada e centralizada no quadro de aquisição. A câmera e a óptica são montadas sobre uma mesa de isolamento de vibração para minimizar as frequências ressonantes.Ao mesmo tempo, posicione um eletrodo de marcação coaxial no átrio direito, controlado por um estimulador elétrico isolado S 48. Isso fará com que o coração marque a 300 batimentos por minuto; configure a estimulação elétrica da seguinte forma.A taxa deve ser de cinco pulsos por segundo, um atraso de 0,2 milissegundos, uma duração de estimulação de dois milissegundos com uma intensidade de seis a 12 volts e o modo configurado para repetição e pulso único. Para gravações ópticas que não apresentem artefatos de movimento provocados pela contração, o coração precisa ser desacoplado eletromecanicamente. Faça isso novamente, trocando as linhas de perfusão para solução de Krebs Hensel contendo 11 milimolar de BDM.Entre as aquisições. Perfundir o coração com solução de Krebs-Henseleit não modificada para ajudar a preservar a viabilidade do preparado. Configurar os parâmetros de gravação do software para 2000 hertz com uma matriz de 128 por 128 pixels.O intervalo entre quadros deve ser definido como 0,5 milissegundos e os ganhos devem ser ajustados para cinco x no amplificador da câmera e oito x no ganho integrado. O ganho integrado também deve ser definido como 12. Configure no software de controle da câmera um atraso do obturador de 500 milissegundos e grave 4.000 quadros com duração de 2000 milissegundos.Desligue ou cubra todas as luzes da sala e dos equipamentos para eliminar o ruído de fundo durante a gravação; a luz LED ilumina o coração apenas durante a gravação óptica. Para reduzir o fotodesbotamento e a toxicidade do corante, controle o obturador da fonte de luz com um pulso de cinco volts entregue através do painel de controle por meio de uma placa D dois A no computador após a aquisição. Processe os dados utilizando diferentes configurações de filtro.As configurações padrão são geralmente utilizadas, exceto ao ajustar o filtro rejeita-faixa, que é definido com o limite esquerdo em 44,0 e o limite direito em 98,0. Posteriormente, as informações registradas são processadas e usadas para gerar um vídeo. Os dados de uma aquisição correspondem à ativação elétrica local em 16.384 sítios na superfície cardíaca ao longo de um período de dois segundos.O software permite que esses sinais locais sejam diretamente comparados entre si e com os dados dos registros eletrográficos atriais e ventriculares, mapeando a ativação elétrica local em cores e exibindo essas informações como uma animação que mostra a ativação elétrica espaço-temporal na superfície cardíaca. Para criar tal animação, primeiro utilize o software para filtrar os dados temporal e/ou espacialmente. Em seguida, selecione um tempo inicial e um tempo final para a animação.Terceiro, mapeie os sinais ópticos em cores com base na intensidade luminosa de repouso de cada pixel. Quarto, sobreponha os dados de cor resultantes com uma imagem do coração e, finalmente, gere a animação se o preparo do coração perfundido permaneceu imóvel durante a gravação. Os sinais ópticos mostram um pico distinto para cada pixel envolvido na alteração da intensidade de emissão do D eight anep. Esses filmes de imagem em tempo real demonstram uma frente de excitação propagando-se pela superfície epicárdica do coração, bem como os registros eletrográficos simultaneamente adquiridos.Acabamos de demonstrar uma técnica de alta resolução para obter imagens ópticas do movimento do potencial de ação na superfície do Coração Vermelho Alanor Perfundido. Ao realizar este procedimento, é importante remover rapidamente o coração do animal vermelho anestesiado. Para evitar isquemia miocárdica, as células miocárdicas precisam ser adequadamente perfundidas e o coração deve ser completamente carregado com corante sensível à água.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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