Imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso na Primária Cultivadas neurônios do hipocampo

A imagem de células vivas é particularmente útil ao estudar a dinâmica do tráfego de organelas. Este vídeo destacará um procedimento utilizado para imagens de grânulos de núcleo denso em neurônios hipocampais cultivados. Primeiramente, os complexos de transfeção são obtidos pela mistura do meio D-N-A-M-E-M e o reagente de transfeção lipectomia.

Como os neurônios do hipocampo são cultivados em lamínulas invertidas voltadas para uma monocamada de células gliais, essas lamínulas devem ser viradas para expor os neurônios ao reagente de transfeção. Após permitir tempo suficiente para a expressão das proteínas de vesículas de núcleo denso marcadas com GFP, uma câmara de imagem é montada. A aquisição de imagens de ICALs de núcleo denso em neurônios cultivados pode ser realizada utilizando microscopia de fluorescência de campo amplo.

Este protocolo é flexível e pode ser adaptado para imagens de outras organelas, como mitocôndrias, endossomos e peroxissomos. Olá, sou Michael Silverman e bem-vindos ao meu laboratório de neurociência celular na Universidade Simon Fraser. Estamos interessados em como as organelas se movem nas células nervosas.

Para abordar esta questão, marcamos organelas da membrana do neurônio, especificamente vesículas de núcleo denso em neurônios hipocampais cultivados. E para mostrar como fazemos isso, vou passar a palavra a David. Olá, sou David do laboratório Silverman.

Hoje vou mostrar um procedimento para imagem de células vivas de vesículas de núcleo denso e neurônios cultivados utilizando microscopia de campo amplo. Vamos começar. Na maioria dos experimentos, utilizamos placas de neurônios hipocampais de rato cultivados com uma densidade celular de 250.000 células por placa de seis centímetros, sendo rotuladas duas tubos de 1,5 mililitro, um para o plasmídeo de DNA e outro para o reagente de transfeção.

Em uma cabine de fluxo laminar, para combinar um micrograma de DNA plasmidial com cem microlitros de MEM em um único tubo à temperatura ambiente, certifique-se de usar MEM que não contenha quaisquer suplementos. Combine seis microlitros de lip com cem microlitros de MEM no outro tubo. A mesma quantidade pode ser utilizada para transfeção dupla, embora a proporção lip-DNA seja reduzida pela metade nesses casos.

Para preservar a vida útil do reagente lipídico, mantenha-o sempre refrigerado ou em um refrigerador de bancada, e incube os tubos por cinco minutos à temperatura ambiente. Transfira a mistura de DNA em MEM para o tubo lipídico e misture suavemente com APE Next, seguido de incubação por 30 minutos à temperatura ambiente. Após 25 minutos, adicione 60 microlitros de ácido K-neurônico 50 milimolar para minimizar danos citotóxicos aos neurônios cultivados.

Como cultivamos neurônios na face inferior de lamínulas suspensas acima de uma monocamada de GL, é necessário inverter as lamínulas e expor os neurônios à solução de transfeção. Vire cuidadosamente a lamínula, com os pés para cima, usando pinças estéreis. Organize-as de modo que não se sobreponham.

Tenha cuidado para não raspar a superfície do lamínula recoberta com neurônios ou a superfície do recipiente recoberta com ggl. Ao final da incubação de 30 minutos, retire aproximadamente N 0,5 mililitros de meio do recipiente de seis centímetros e misture suavemente com o DNA no tubo. Transfira a solução de DNA de volta ao recipiente, gotejando uniformemente sobre a superfície do meio.

Deslize suavemente o recipiente para frente e para trás em uma única direção, mas certifique-se de não agitar o meio. Após a mistura em uma direção, pare e repita na direção perpendicular para distribuir uniformemente os complexos de lipofecção de DNA por todo o recipiente. Incube por 90 minutos no incubador de cultura de tecidos a 37 graus C e 5% de dióxido de carbono.

Após a incubação, vire as lamínulas com o lado dos pés para baixo e organize-as de modo que não se sobreponham. Por fim, permita que a expressão do DNA prossiga pelo tempo desejado, o que normalmente corresponde a uma noite inteira até 48 horas no incubador. A imagem em tempo real de grânulos densos marcados com GFP em neurônios hipocampais cultivados requer um microscópio fluorescente equipado com uma câmera CCD.

Será necessário uma câmara de imagem com controlador de temperatura e aquecedor de objetiva. A câmara não deve conter portas abertas, uma modificação que pode ser incluída ao solicitar a câmara. Em seguida, inicie a câmera do microscópio, a lâmpada fluorescente e o software de aquisição de imagens.

Ligue a energia da plataforma da câmara e dos aquecedores do objetivo. Este também é um bom momento para aplicar uma gota de óleo nos objetivos. Agora prepare a plataforma aquecida e a câmara de imageamento.

Para facilitar a manipulação, rotule um lado da tampa da câmara com uma caneta permanente. Coloque a tampa da câmara com o lado superior voltado para cima sobre a tampa de um tubo de 50 mililitros, que é um suporte ideal para a câmara.

Aplicar um anel de graxa ao sulco ao redor do orifício na lateral da câmara marcada como superior. Evite usar excesso de graxa, pois ela entrará na câmara e reduzirá a área observável. Usando pinça.

Acople uma lamínula limpa e não utilizada de 18 centímetros ao lado superior da câmara. Aplique pressão suave nas bordas da lamínula para criar um selo firme dentro do sulco reentrante da câmara. Vire a câmara e aplique um anel semelhante de graxa ao sulco no lado oposto ou inferior da câmara.

Transfira 750 microlitros de meio de imagem para a câmara. Essa é uma quantidade excessiva, mas a graxa deve impedir que o meio transborde, e o excesso evitará que bolhas fiquem aprisionadas quando a lamínula coberta de células for aplicada. Mantenha a câmara preparada no incubador de cultura de tecidos até o momento do uso.

Incubações prolongadas, como uma hora ou mais, devem ser evitadas, pois o meio de imagem irá evaporar e alterar sua composição. Para a montagem final da câmara para imagem de ciclo de vida, transfira a câmara preparada e uma placa com lamínulas transfectadas do incubador para a cabine de cultura de tecidos. Usando pinças estéreis, remova cuidadosamente uma lamínula da placa transfectada.

Em seguida, encoste a borda da lamínula em um lenço de papel para absorver o meio de crescimento. A seguir, posicione a lamínula com o lado dos neurônios voltado para baixo sobre a câmara preparada. Encoste um lado da lamínula na graxa primeiro e aplique pressão ao redor das bordas para acomodar a lamínula plana, sem aprisionar bolhas de ar.

É esperado que o meio de imagem em excesso transborde; remova o excesso de meio de imagem, mas tenha cuidado para não deslocar o lamínula de sua posição. Transfira a câmara para o aquecedor de plataforma pré-aquecido e fixe a câmara no lugar. Em seguida, transfira a câmara para a platina para reduzir o fotodesbotamento e a fototoxicidade.

Ajuste a lâmpada para a intensidade mínima necessária para localizar as células transfectadas. Agora, encontre uma célula de interesse. Usando uma objetiva de imersão com baixa magnificação, como 40 x, é benéfico seguir um padrão de busca planejado para garantir cobertura máxima do lamínula e evitar aquisições de imagem redundantes.

Uma vez localizado o campo desejado, altere o canal para uma proteína marcada com fluoróforo de interesse. Mude para uma objetiva de imersão em óleo de alta magnificação, como 60 a 100x, e retorne a intensidade da lâmpada para um nível alto. Utilize a aquisição contínua ou uma função equivalente do seu software de imagem para registrar a dinâmica da proteína marcada com fluoróforo em organelas de movimento rápido. O tempo de exposição e o intervalo entre exposições devem ser minimizados para produzir gravações com uma alta taxa de quadros.

A deriva focal observada na pré-visualização na tela pode ser corrigida em tempo real por meio de ajuste manual do foco. Certifique-se de capturar uma imagem de contraste de fase e quaisquer outras imagens complementares necessárias para análises e apresentações posteriores. Salve todas as imagens antes de explorar mais a lamínula e realizar a próxima gravação.

Normalmente, considera-se bem-sucedida a obtenção de três a cinco gravações de um único lamínula, e os lamínulas são submetidos à imagem por 30 a 60 minutos; deve-se ter em mente, em geral, a fototoxicidade e a saúde celular, já que transportadores podem estar reduzidos em células danificadas. As observações de imagem em tempo real em células vivas normalmente consistem em gravações, também conhecidas como pilhas de imagens, que mostram o movimento de organelas marcadas com fluorescência dentro do campo de visão. A seguir, há um filme representativo do transporte de iCal de núcleo denso.

A cor foi invertida para facilitar a observação. Observe as partículas em movimento. Os gráficos CH são imagens que ilustram o movimento das partículas mediante a justaposição de varreduras lineares, nas quais cada ponto temporal é representado por uma coluna no gráfico.

Esta figura demonstra como duas partículas em movimento em direções opostas são representadas em um gráfico CH. A análise adicional de cronogramas pode fornecer informações sobre a velocidade do fluxo de partículas, inversões no comprimento do percurso e partículas estacionárias. Olá, acabamos de mostrar como obter gravações de alta velocidade do transporte de vesículas dscos e de neurônios hipocampais cultivados.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de pré-aquecer todos os componentes da câmara de imagem e da plataforma para reduzir o estresse nas células durante sua transição do incubador para a platina. Você deve trabalhar rapidamente, mas com cuidado. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.