Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

Um lamínula revestida com agar, preparada espalhando uma gota de agar sobre o vidro e deixando curar durante a noite, é colocada na cavidade circular da câmara de gravação pré-fabricada e coberta com solução de registro. Um verme colocado no centro é colado à superfície da lamínula, começando pela cabeça ou pela cauda, aplicando cola ao lado dorsal do verme com uma pipeta de cola. Após a conclusão da colagem, é feita uma incisão adjacente à vulva, na interface entre a cutícula e a cola, utilizando uma agulha de vidro, e estendida em direção à cabeça, seguindo-se a extração das vísceras e ovos da cavidade corporal.

A borda cortada da incisão é soldada pontualmente com cola ao sogar, expondo o nervo ventral e os músculos da parede corporal. O músculo medial ventral anterior à vulva é submetido ao registro em configuração de patch e o eletrodo estimulante é posicionado a montante na corda nervosa. Olá, sou Janet Richmond, professora associada do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade de Illinois em Chicago.

Hoje vou mostrar a vocês uma técnica de dissecação que nos permite expor as junções neuromusculares do ouriço-do-mar. Para gravação eletrofisiológica. Utilizamos este preparo para estudar a transmissão sináptica.

Ok, vamos começar. Antes de trabalhar com os nematodos, alguns equipamentos devem ser preparados pelo menos um dia antes do procedimento. Uma câmara de dissecação para gravação, lamínulas de vidro revestidas com S-gel, pipetas antigas, um aplicador de cola e uma pipeta de extração.

Inicie pela construção da câmara. Corte uma folha de plexiglás com um dezesseis avos de polegada de espessura para ajustar ao estágio do microscópio. Utilizado para realizar as gravações no centro do plexiglás.

Faça um furo circular grande o suficiente para acomodar um cubre-objeto circular de 22 milímetros de diâmetro com cola. Fixe um cubre-objeto de 48 por 60 milímetros ao lado inferior da câmara abaixo do furo, utilizando um pequeno pellet de parafina de inclusão de tecidos de baixo ponto de fusão em cada canto do cubre-objeto. A parafina é rapidamente derretida em uma placa aquecida, deixando uma fina camada de parafina entre o plexiglass e o cubre-objeto após o resfriamento; retire qualquer excesso de parafina com uma lâmina.

O lamínula que se ajusta à câmara é um lamínula revestido com S guard de 22 milímetros. Para que o sard funcione, ele deve ser preparado recentemente de acordo com as instruções do fabricante. Após o preparo, uma pequena gota de sard é colocada sobre cada lamínula e espalhada com uma lâmina para obter uma superfície uniforme.

Os lamínulas revestidos são então colocados em recipientes tampados e levados a uma estufa a 65 graus Celsius durante a noite para cura. Amanhã estarão prontos para a dissecação ao longo do protocolo. São necessários micropipetas de vidro de silicato com diâmetro externo de 1 milímetro puxadas até uma ponta com resistência de aproximadamente quatro megaohms, portanto é recomendável manter um frasco disponível.

Veja o vídeo do JoVE sobre a confecção de macropatches, pipetas e eletrodos afiados com um micropipetógrafo programável por Miriam Goodman. Para os detalhes técnicos da realização de eletrofisiologia, o nematódeo deve ser colado no lugar. E para isso, é necessário um aplicador de cola.

O aplicador de cola é simplesmente um tubo plástico de dois milímetros com diâmetro interno de um milímetro. Uma extremidade do tubo será segurada na boca. Pode ser equipado com um bocal, e a outra extremidade do tubo manterá uma pipeta de um milímetro preenchida com cola.

Uma pipeta de extração especializada também é utilizada durante a dissecação. Esta é feita de um tubo e uma pipeta, assim como o aplicador de cola, exceto que a ponta da pipeta é levemente quebrada para acomodar os ovos e as vísceras. Comece traçando uma linha de cera ao longo do perímetro da câmara.

Agora pressione e coloque um lamínula revestida com S guard, com o lado syl guard virado para cima. A linha de cera imobiliza o lamínula e impede que a solução de registro infiltre por baixo e desloque o lamínula durante a dissecação e o registro. Em seguida, a câmara é preenchida com solução extracelular de registro. Leia o texto acompanhante para a formulação com a câmara preparada.

Usando um pincel para nematóides, coloque vários nematóides na solução. Com prática, os nematóides nadadores podem ser colados sem procedimentos adicionais para impedir o movimento. Carregue um recipiente para cola, feito a partir de uma tampa de PCR fixada em cera ou massa de modelar, com um estoque de trabalho da cola acrílica Sano para trabalhar com a cola.

Termine a montagem do aplicador de cola fixando sua pipeta de gravação na extremidade do aplicador. Em seguida, sob o microscópio de dissecação, preencha o aplicador de cola por sucção bucal. A adesão da cola a um nematódeo é desafiadora e exige prática, pois a cola polimeriza ao entrar em contato com a solução extracelular de gravação.

Para resolver isso, mantenha um fluxo constante de cola para fora, ou ela endurecerá e entupirá a pipeta. Se a pipeta ficar entupida, às vezes é possível desobstruí-la batendo suavemente a ponta na lamínula. Pratique o manuseio da cola.

E quando você conseguir escrever seu nome com cola na superfície do sil guard, provavelmente estará pronto para colar a cutícula do nematódeo a fim de fixar um nematódeo. Primeiro, escolha um espécime próximo ao centro da câmara, onde haja espaço para operar. Em seguida, aplique uma pequena quantidade de cola na cabeça ou na cauda do nematódeo e rapidamente puxe o nematódeo para baixo, encostando-o na superfície do sil guard.

Em seguida, aplique um filete de cola ao longo da borda dorsal da cutícula dos nematoides. Isso força o nematoide a assumir uma posição em C, com a vulva voltada para dentro. Quaisquer lacunas nesta linha de cola devem ser preenchidas para garantir a máxima adesão entre o nematoide e o suporte de sílica.

Esse é um processo delicado e pode ser útil praticar com mutantes hipomóteis. Como no 31, há uma lâmpada bem ali, logo à direita. Agora vou mover esta preparação e, em seguida, vou trazer a agulha de vidro e começar a fazer a incisão. Para fazer a incisão na cutícula, mude para uma pipeta de dissecação manual.

Este pipeta precisa ser mais afiada do que as pipetas usadas para gravação de cola e ter um eixo curto e resistente, utilizando a maior ampliação possível. No microscópio estereoscópico, alinhe a pipeta paralelamente ao eixo longitudinal do nematódeo e insira a ponta próximo à vulva, na interface entre a cutícula e a cola. Esse corte libera a pressão hidrostática do nematódeo, forçando os ovos e o intestino a saírem pelo ponto de incisão.

Continue cortando a cutícula em direção à cabeça do nematódeo com um movimento de corte semelhante ao de abrir uma carta, até alcançar a faringe. Agora, mude para a pipeta de extração para aspirar os órgãos internos do nematódeo. Após limpar a incisão, a cutícula aberta manterá sua forma cilíndrica.

Em seguida, pegue uma pipeta nova para colagem. Use-a para soldar pontualmente a cutícula na borda da incisão sobre a superfície do suporte de sylgard. É importante usar quantidades mínimas de cola nesta etapa para evitar danificar ou obscurecer os njs.

O cordão nervoso ventral e os músculos da parede corporal estão agora expostos, mas a membrana basal que recobre a junção neuromuscular ainda precisa ser removida. Para isso, aspire a solução de registro extracelular da câmara e aplique uma solução de registro extracelular com 0,4 miligramas por mililitro de colagenase. Após 10 a 20 segundos, remova a colagenase e lave o preparo várias vezes com solução de registro fresca.

O nematódeo está agora pronto para gravações eletrofisiológicas. Na posição da junção neuromuscular, posicione a câmara de gravação sobre a platina de um microscópio ereto usando uma objetiva de 10 vezes para centralizar o nematódeo, depois mude para uma objetiva de imersão em água de 40 vezes com óptica DIC e verifique se os músculos da parede corporal e o cordão nervoso estão intactos. Posicione o nematódeo horizontalmente para que os eletrodos possam ser introduzidos tanto pelo lado esquerdo quanto pelo direito.

Normalmente, realizamos a perfusão na região ventral medial do corpo, nas musculaturas internas à vulva, mas é possível realizar a perfusão com facilidade nas musculaturas tanto do lado dorsal quanto do ventral do verme, com alguns neurônios que parecem semicírculos encostados no músculo. Agora, realize a perfusão no músculo utilizando técnicas padrão de patch clamp para obter um selo gigôhmico. Em nossa experiência, eletrodos de gravação com resistência de cerca de quatro megohms funcionam bem no modo de gravação em clamp de tensão na célula inteira.

Aplique mais sucção e aplique um choque na membrana até que o selo gigaseal seja rompido. Então, falamos sobre ter uma resistência de quatro megaohms. Então, se você olhar para isso aqui, sim, está indicando 4,9 megas.

É maior, normal. Está na faixa que nós utilizamos. Ok. Sim. Agora vamos tentar ir além, então o quê?

O quê? Queremos que isso desça completamente. Sim. Entendi. Êxito.

Em uma boa gravação, os músculos da parede corporal de nematoides adultos do tipo selvagem normalmente apresentam uma capacitância da membrana celular de aproximadamente 70 picofarad e podem ser gravados de forma estável por pelo menos 10 minutos em um potencial de retenção de menos 60 milivolts, com correntes de retenção mínimas, cerca de 50 picoampères. Após o selamento de uma célula muscular, a estimulação por um segundo eletrodo, ativação luminosa de canais, Rodin ou a adição de solução hiperosmótica gerará todas respostas mensuráveis. Para provocar uma resposta evocada eletricamente, normalmente colocamos um eletrodo de estimulação contendo solução extracelular sobre o cordão nervoso ventral, interno à célula muscular selada.

Essa configuração de selamento solto exige pulsos de corrente de um a dois milissegundos entre 10 e 40 volts. Infelizmente, após algumas respostas evocadas, o cordão nervoso é irreversivelmente danificado e, por razão desconhecida, apenas respostas evocadas colinérgicas podem ser obtidas com essa configuração. Alternativamente, nematoides que expressam um canal ativado por luz, onde o transgene dosin em diferentes populações neuronais pode ser usado para evocar a liberação.

Na preparação para este método, esteja ciente de que os nematoides utilizados para esta aplicação devem ser cultivados em bactérias enriquecidas com retinol. Nesta preparação, um LED de 470 nanômetros de alta potência, filtrado por um filtro de excitação GFP de 450 a 490 nanômetros, é usado para ativar repetidamente a opsina do canal, provocando a liberação de diferentes neurotransmissores, dependendo dos tipos celulares que expressam o canal. A última técnica a ser analisada pode ser utilizada para medir o tamanho do pool prontamente liberável de vesículas sinápticas provenientes de vários neurônios na musculatura registrada.

Isso é realizado aplicando pulsos de pressão de uma solução extracelular hiperosmótica sobre o músculo perfundido por um a três segundos. O resultado será uma sucessão de eventos pós-sinápticos assíncronos. São apresentadas gravações do músculo da parede corporal em clamping de tensão em célula inteira para cada um dos três protocolos de estimulação descritos acima: respostas evocadas eletricamente, evocadas por luz e hiperosmóticas.

Em todos os casos, o músculo da parede corporal medial ventral é fixado em sessenta milivolts negativos. Células musculares do tipo selvagem normalmente exibem altas taxas de correntes sinápticas miniatura endógenas entrantes. Em nossas soluções padrão de gravação, uma despolarização de dois milissegundos do cordão nervoso ventral anterior provoca uma liberação sincrônica de várias sinapses, resultando em uma resposta evocada grande de cerca de dois a 2,5 nanoampères.

Em vermes do tipo selvagem, traços representativos à direita dos traços do tipo selvagem em A e B mostram a liberação sináptica em um mutante gravemente descoordenado. O painel C18 mostra uma resposta evocada por luz na junção neuromuscular de um verme do tipo selvagem expressando canal vermelho dosin. Em neurônios colinérgicos, um pulso de luz de dois milissegundos normalmente produz uma resposta de 1,5 a 1,8 nanoampères. A ejeção por pressão de salina hiperosmótica de 850 mOsm por um segundo sobre o músculo produz uma rajada assíncrona de correntes sinápticas miniaturas, representando o pool prontamente liberável de vesículas.

Acabo de mostrar a você a técnica de dissecação que usamos para expor as junções neuromusculares de *Aplysia californica* e realizar gravações eletrofisiológicas. É importante lembrar que essa técnica é desafiadora e provavelmente levará meses para ser aperfeiçoada. No entanto, uma vez adquirida, é como andar de bicicleta.

As técnicas permanecerão com você, e quanto mais você as praticar, mais rápida e confiável será a preparação. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.